2024年9月16日发(作者：其和平)
ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis
153-160.
江西农业大学学报
2021，43（1）
DOI：10.13836/.2021017
http:
//
陈金凤，乐伟，何永，等.非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备［J］.江西农业大学学报，2021，43（1）：
CHENJF,LEW,HEY,yoticexpressionofafricanswinefevervirusp72proteinandpreparationofpolyclonalantibodies
[J].ActaagriculturaeuniversitatisJiangxiensis,2021,43(1):153-160.
非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达
和多克隆抗体制备
陈金凤，乐伟，何永，吴丽琴，贾宝玉，邓小淇，胡睿铭，
黄冬艳，宋德平，邬向东，吴琼，唐玉新，丁珍
*
（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）
摘要：【目的】非洲猪瘟（africanswinefever，ASF）是一种以猪急性发病、高死亡率为典型特征的病毒病，其病原
非洲猪瘟病毒（ASFvirus，ASFV）在中国的暴发给中国养猪业造成重大损失。p72蛋白是ASFV的主要衣壳蛋
白，能够有效诱导机体产生特异性抗体，常被利用于检测试剂盒的备成。【方法】构建了p72全长（pET-28a-
ASFV-p72）及1-171aa截短突变体（pET-28a-ASFV-p72-（1-171））原核表达质粒，通过原核表达系统
表达并纯化了p72全长及1-171aa融合蛋白。该2种蛋白经过4次免疫日本大耳白Balb/C兔后，获得效价皆
为大于1∶819200的多抗血清。【结果】通过间接免疫荧光实验和Westernblot检测2种多抗均能与真核表达的
p72蛋白发生特异性反应。【结论】制备的针对p72多克隆抗体为后续诊断试剂盒的研发提供依据。
关键词：非洲猪瘟病毒；p72；原核表达；多克隆抗体
中图分类号：S852.65
+
1文献标志码：A文章编号：1000-2286（2021）01-0153-08
ProkaryoticExpressionofAfricanSwineFeverVirusp72Protein
andPreparationofPolyclonalAntibodies
CHENJinfeng，LEWei，HEYong，WULiqin，JIABaoyu，DENGXiaoqi，
HURuiming，HUANGDongyan，SONGDeping，WUXiangdong，
WUQiong，TANGYuxin，DINGZhen
*
（CollegeofAnimalScience&Technology，JiangxiAgriculturualUniversity，Nanchang330045，China）
Abstract：［Objective］Africanswinefever（ASF）isaswineviraldiseasecharacterizedwithhemorrhagic
breakofAfricanswinefevervirus（ASFV）inChina，hascausedhugedamage
totheswineindustry.p72isthecapsidproteinofASFV，whichcaneffectivelyinducespecificantibodies，and
isalwaysusedindetectkitdevelopment.［Method］Inthisstudy，thep72full-length（pET-28a-ASFV-p72）
收稿日期：2020‑09‑16修回日期：2020‑11‑02
基金项目：江西省重点研发计划重点项目（20201BBF61004）和江西省自然科学基金面上项目（20202BAB205004）
ProjectsupportedbytheKeyResearchandDevelopmentProgramofJiangxiProvince（20201BBF61004）andthe
作者简介：陈金凤，/0000-0001-6862-677X，*****************；*通信作者：丁珍，讲师，博士，主要从事冠
状病毒研究，/0000-0002-5002，********************.cn。
NaturalScienceFoundationofJiangxiProvince（20202BAB205004）
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江西农业大学学报
第43卷
and1-171aatruncatedmutant（pET-28a-ASFV-p72-（1-171））combinant
‑
clonalantibodieswereobtainedandtheirtitersweregreaterthan1∶819200.［Result］Indirectimmunofluores‑
cenceandwesternblotassaysconfirmedthatpolyclonalantibodiescanreactwellwiththeeukaryoticexpres‑
sionofp72.［Conclusion］Thepolyclonalantibodiesagainstp72canbeappliedtothedevelopmentofsubsequent
diagnostickits.
Keywords：Africanswinefevervirus；p72；prokaryoticexpression；polyclonalantibodies
【研究意义】非洲猪瘟（africanswinefever，ASF）是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高度接触性传染
病。自1921年肯尼亚首次报道非洲猪瘟疫情后，该病在非洲大陆蔓延，随后传入欧洲和南美洲，2018年
我国辽宁首次出现ASFV疫情，至今世界各地仍有疫情爆发的报道
[1]
。ASF被我国列为一类动物疫病，被
世界动物卫生组织（worldorganizationforanimalhealth，OIE）列为A类动物疫病，一旦出现必须上报。【前
人研究进展】非洲猪瘟病毒（ASFVvirus，ASFV）有介于痘病毒和虹彩病毒的特征，为一个新科，国际病毒
分类委员会将其列入非洲猪瘟病毒属，ASFV为唯一已知代表种
[2]
。ASFV为单分子线性双链DNA病毒，
也是一种虫媒病毒。ASFV基因组全长170~190kb，含151个开放阅读框，可编码150~200种蛋白质
[3]
。
ASFV基因编码的结构蛋白约有50种，包括囊膜蛋白CD2v、p30、p54；衣壳蛋白p72、p49；核壳蛋白多聚蛋
白前体pp20和pp62；DNA结合蛋白p10、pA104R
[4]
。【本研究切入点】B646L基因编码的p72蛋白，是ASFV
的主要衣壳蛋白，蛋白大小约为73.2ku，产生于病毒感染晚期，为病毒参与结合细胞的重要蛋白，其表达
常作为病毒复制的标志
[5]
。MalloryElizabeth
[6]
绘制的氨基酸重叠图中可知，在氨基酸1至171中，含有2个
抗原表位，分别在160-165和165-171氨基酸肽段中，在图1中的C端被蓝色方格标记。【拟解决的关键问
题】笔者根据ASFVAuhuiXCGQ毒株序列（GenBank登录号：MK128995.1）合成了ASFVp72全长基因，利用
分子克隆技术构建了pET-28a-ASFV-p72和pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）原核表达质粒。通过
原核表达系统获的p72全长和1-171aa融合蛋白，使其作为抗原免疫日本大耳白Balb/C兔，获得高效价兔
源多克隆抗体，为非洲猪瘟血清学检测的发展提供依据。
Fig.1Antigenicepitopeoftruncatedproteinp72
图1p72截短蛋白抗原表位
1
1.1
1.1.1
材料和方法
试验材料
细胞、质粒和试验动物HEK293T细胞购自ATCC细胞库；日本大耳白Balb/C兔由武汉戴安生物
技术有限公司提供；pET-28a原核表达载体和pCAGGS-myc真核表达载体皆由本实验室保存；ASFV
（MK128995.1）p72全长基因同时5′端携带GAATTC（EcoRI）3′端携带GAGCTC（XhoI）的基因序列委托苏
州金唯智生物科技有限公司设计与合成。
第1期陈金凤等:非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备
·155·
1.1.2
胶回收试剂盒（GelExtractionKit）购自Omega公司；TOP10、BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技
（北京）有限公司；His蛋白纯化试剂盒由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；SDS-PAGE凝胶试
主要试剂EcoRI、XhoI内切酶购自NEB公司；T4DNALigase和DNAMarker购自TaKaRa公司；
剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司；PVDF膜由Millipore公司提供；极超敏ECL化学发光试剂盒购
自上海碧云天生物技术有限公司；DAPI购自ThermoFisher公司；PE标记的羊抗兔抗IgG和HRP标记的
羊抗兔IgG购自全式金生物技术有限公司。
1.2
1.2.1
试验方法
质粒构建笔者设计了p72（1-171aa）基因的特异性引物（表1），以合成的p72全长基因为模板，
PCR扩增目的基因，胶回收反应产物，经EcoRI和XhoI酶切并纯化，与经相同酶切处理的pET-28a载体
连接，产物转化至TOP10感受态细胞。挑取单个菌落扩大培养，质粒小提试剂盒提取pET-28a-p72（1-
171aa）质粒。而pET-28a-p72和pCAGGS-myc-p72则皆为通过EcoRI和XhoI酶，与分别pET-28a和
pCAGGS-myc连接形成。通过双酶切提取的质粒DNA和北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，鉴
定构建的质粒为正确。
表1引物序列
Tab.1Primerssequence
引物种类Kindofprimer
pET-28a-p72（1-171aa）-R
pET-28a-p72（1-171aa）-F
引物序列Primersequence
CCGCTCGAGattctttgtgccgggtac
gGAATTCatggcatcaggaggagc
1.2.2
空载质粒分别转化入BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单个菌落，摇菌扩大培养，加入终浓度为1mmol/L的
IPTG诱导目的蛋白表达，37℃摇床上180r/min诱导4h，设置未诱导为对照。诱导结束后，5000r/mim离
心10min，弃上清用PBS重悬，超声波破碎处理。离心后收集上清，加入上样缓冲液，沸水煮10min，通
蛋白的表达和纯化将鉴定正确的重组质粒pET-28a-p72及pET-28a-p72（1-171aa）和pET-28a
过SDS-PAGE凝胶跑蛋白电泳查看目的蛋白表达情况。扩大诱导的蛋白通过His标签纯化试剂盒进
行纯化。
1.3多抗制备
将纯化的蛋白作为抗原免疫2只2~3月龄日本大耳白Balb/C兔，第1次主注射使用弗氏完全佐剂，以
后加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后背部多点注射，免疫程序见表2。
表2免疫程序
Tab.2Immuneprocedure
Operating
Maininjection
Firstboostofimmunity
Secondboostofimmunity
第2次加强
第1次加强
主注射
操作
Immunecycle
0
28
42
免疫周期/d
Operating
Thirdboostofimmunity
Fourthboostofimmunity
Bloodcollection
放血
第4次加强
第3次加强
操作
Immunecycle
47
54
64
免疫周期/d
1.4抗体效价检测
按照间接ELISA方法对免疫后获得的血清进行效价检测：用抗原包被液将纯化后的重组ASFV
p72蛋白进行稀释，加入酶标板，4℃过夜包被，第2天弃液并用新配制的PBST洗涤3遍，排干板内液
体，加入5%脱脂奶粉进行封闭液，37℃培养箱封闭2h，封闭结束后PBST洗3遍，拍干待用。将2种血
清按1∶100×2
0
~1∶100×2
13
倍比稀释后，加入酶标板，37℃孵育1h，孵育结束弃液，洗涤拍干（同上），再向
其中加入1∶2500倍稀释的HRP带标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后弃液，洗涤拍干（同上），最后加入
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TMB显色液37℃避光反应15min，浓硫酸终止反应后使用酶标仪于OD
450
检测吸光度。
1.5间接免疫荧光检测
将p72基因与pCAGGS-myc真核表达载体连接，使用pCAGGS-myc-p72和pCAGGS-myc空载分别
转染HEK293T细胞，24h后PBS清洗3次，使用4%的多聚甲醛在室温下固定细胞15min，PBS洗3次后，
用低温无水甲醇透化处理15min，之后PBS洗3次，使用10%的牛血清白蛋白（BSA）封闭，PBS清洗3次
后加入1∶100稀释的多抗血清作为一抗，37℃孵育1h，PBS将未结合上的一抗清洗后，加入PE标记的羊
抗兔二抗孵育避光30min，接着PBS清洗3遍，加入DAPI室温避光孵育15min，PBS清洗3遍后于荧光显
微镜观察结果。
1.6Westernblot检测
将pCAGGS-myc-p72和pCAGGS-myc分别转染于12孔细胞培养板培养的HEK293T细胞，28h后
收集细胞。取1.5mLEP管，加入1mLRIPA细胞组织裂解液和10µLPMSF蛋白酶抑制剂，混匀后每
孔加入100µL，冰上孵育20min，12000r/min，4℃离心10min，吸取上清加入5×LoadingBuffer于沸水
中煮10min。进行SDS-PAGE电泳，然后湿转于PVDF膜，转膜结束后，将膜浸于含5%脱脂奶粉的TBS
溶液中37℃封闭2h，TBST于摇床上清洗3次，每次10min。将2种血清1∶1000稀释作为一抗，孵育4h
后TBST清洗3次，每次10min，使用HRP标记的羊抗兔二抗（1∶2500稀释）孵育45min，TBST清洗3次，
每次10min，通过ECL化学发光液将膜于化学曝光仪上曝光。
2
2.1
结果与分析
重组表达载体的构建
笔者构建了pET-28a-ASFV-p72和pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）原核表达质粒，和pCAGGS-myc-
p72真核表达质粒，通过双酶切重组质粒，琼脂糖凝胶结果p72全长基因显示在1941bp（图2A和图2C），
p72截短突变体显示在513bp处（图2B），符合预期结果。
A：pET-28a-ASFV-p72双酶切结果；B：pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）双酶切结果；C：pCAGGS-myc-p72双酶切结果
plasmidpCAGGS-myc-p72byrestrictionenzymesdigestion
Fig.2
图2
recombinationplasmidpET-28a-ASFV-p72（1-171aa）byrestrictionenzymesdigestion；C：Identificationoftherecombination
Identificationoftherecombinationplasmidbyrestrictionenzymesdigestion
重组质粒的双酶切鉴定
A：IdentificationoftherecombinationplasmidpET-28a-ASFV-p72byrestrictionenzymesdigestion；B：Identificationofthe
2.2p72及1-171aa蛋白的表达与纯化
构建成功的pET-28a-ASFV-p72和pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）表达质粒转化入BL21感受态细
胞中，添加IPTG诱导4h后，收取细胞样品，并进行SDS-PAGE分析，结果发现p72（图3A）和p72（1-
171aa）（图3B）均出现明显的条带，分别在75.9ku和23.7ku处，未诱导及pET-28a空载则没有条带。p72
和p72（1-171aa）蛋白通过His标签纯化试剂盒进行纯化，并进行SDS-PAGE分析，结果纯化得到p72（图
3C）和p72（1-171aa）（3D）蛋白。
第1期陈金凤等:非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备
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A：p72的诱导表达；B：p72（1-171aa）的诱导表达；C：纯化的p72；D：纯化的p72（1-171aa）
A：expressedp72；B：expressedp72（1-171aa）；C：purifiedp72；D：purifiedp72（1-171aa）
Fig.3Expressionandpurificationofrecombinantprotein
图3重组蛋白的诱导表达与纯化
2.3多克隆抗血清的效价测定
用抗原包被液将纯化后的重组ASFV
p72蛋白进行稀释并包被酶标板，分别以抗
p72的兔血清、抗p72（1-171aa）的兔血清和
阴性血清作为一抗，按1∶100×2
0
~1∶100×2
13
倍比稀释加入。以HRP带标记的羊抗兔IgG
为二抗，加入TMB显色液反应，并通过浓硫
酸终止反应。OD
450
检测吸光度发现抗p72
和抗p72（1-171aa）2种兔血清的效价皆大于
1∶100×2
13
，即1∶819200。
2.4多克隆抗体的特异性
Fig.4Determinationoftiteroftwoanti-serums
图42种抗血清的效价测定
为检测获得的多抗的特异性，将pCAGGS-
myc-p72和pCAGGS-myc转染至HEK293T细胞，分别将抗p72和抗p72（1-171aa）2种多抗血清作为一
抗，进行Westernblot分析和间接免疫荧光检测，结果如图，Westernblot分析结果显示，抗p72（图5A）和
示，2种多抗可特异性识别HEK293T细胞中表达的p72蛋白（图5C和5D）。
抗p72（1-171aa）（图5B）2种多抗血清皆可识别蛋白大小约为75.9ku的条带；间接免疫荧光检测结果显
·158·
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C：免疫荧光检测分析抗p72兔血清与p72蛋白的反应；D：免疫荧光检测分析抗p72（1-171aa）兔血清p72蛋白的反应
A：Westernblot分析抗p72兔血清与p72蛋白的反应；B：Westernblot分析抗p72（1-171aa）兔血清p72蛋白的反应；
A：Westernblotanalysisthereactionofanti-p72serumwithp72；B：Westernblotanalysisthereactionofanti-p72（1-171aa）
serumwithp72；C：Immunofluorescenceassayanalysisthereactionofanti-p72serumwithp72；D：Immunofluorescenceassayanal‑
ysisreactionofanti-p72（1-171aa）serumwithp72
Fig.5
图5多克隆抗体的特异性验证
Specificityverificationofpolyclonalantibodies
3结论与讨论
到目前为止，非洲猪瘟已经给我国养猪业造成了极大的损失。我国非洲猪瘟病毒的扩散主要由调
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·159·
运感染猪、感染猪的肉制品及泔水、野猪及软蜱交叉传播，其中调运感染病毒的猪为主要的扩散原因
[7]
。
野猪与软蜱的交叉传播也使得病毒的净化工作变的困难。非洲猪瘟病毒的早期诊断对其有效防控至关
重要。目前非洲猪瘟病毒的检测方法有红细胞吸附实验（hemoadsorptiontest，HAD）、聚合酶链式反应技
术（polymerasechainreaction，PCR）、环介导恒温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）、
荧光抗体实验等，不同诊断技术的联合应用将会是非洲猪瘟诊断的发展趋势
[8]
。本试验制备的抗p72多
克隆抗体可运用于胶体金检测试纸条的制备，而胶体金检测试剂条具有方便快捷等优点，为ASFV的诊
断提供新方法。
常见的血清学诊断利用VP73、p54、p30及p72等蛋白制备抗体。VP73蛋白能够在自然感染中诱发，
且在MS细胞中传代后抗原性稳定；p54蛋白在上清表达，有利于纯化，但其为跨膜蛋白，全长蛋白无法在
大肠杆菌中表达；p30蛋白在病毒DNA合成前就开始表达，针对p30蛋白产生的抗体可以阻止病毒内
吞
[1,9-10]
。有研究评估了针对p72、p30、p523种蛋白的中和抗体在免疫保护中的作用，结果3种仅在感染
早期表现临床疾病发作延迟和降低的病毒血症水平的作用，其不足以进行抗体介导的保护，这也许是目
前尚无有效ASF疫苗的重要原因之一
[11]
。尽管无法进行抗体介导的保护，p72蛋白的强抗原性使其足够
应用于操作简单、准确性高的血清学诊断方法，以提供ASFV疫情诊断的参考
[12]
。
本研究通过设计引物合成p72基因，构建pET-28a-ASFV-p72和pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）重
组质粒，表达出2种蛋白，纯化后免疫兔获得多抗血清，对获得的血清进行Westernblot和间接免疫荧光
试验，检测该多抗的特异性，结果显示特异性良好。p72蛋白在病毒感染时可有效诱导机体产生中和抗
体，且在线软件预测筛选发现B淋巴细胞优势表位为12-18、27-37、45-55、77-88、110-120位置
[13]
。本试
验构建的p72截短突变体1-171包含了这些预测的所有B淋巴细胞优势表位，同时也包涵了160-165、
全长蛋白及1-171截短片段可为ASFV相关血清学诊断方法奠定基础。
165-171等已经报道的抗原表位，本研究也证实该区间段氨基酸免疫大白兔能够产生良好的免疫原性。
目前已有研究
[14-16]
通过构建真核表达载体如杆状病毒表达系统、缺陷型重组腺病毒和重组新城疫等
表达了亲和力与反应性高的p72蛋白。虽然本研究通过原核表达系统表达并纯化了p72和1-
171aa融合蛋白，制备了抗p72和1-171aa的多克隆抗体，但制备的多克隆抗体效价高、且能与真核表达
的p72发生良好的反应，可运用于后续诊断试剂的开发。
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ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis
153-160.
江西农业大学学报
2021，43（1）
DOI：10.13836/.2021017
http:
//
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非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达
和多克隆抗体制备
陈金凤，乐伟，何永，吴丽琴，贾宝玉，邓小淇，胡睿铭，
黄冬艳，宋德平，邬向东，吴琼，唐玉新，丁珍
*
（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）
摘要：【目的】非洲猪瘟（africanswinefever，ASF）是一种以猪急性发病、高死亡率为典型特征的病毒病，其病原
非洲猪瘟病毒（ASFvirus，ASFV）在中国的暴发给中国养猪业造成重大损失。p72蛋白是ASFV的主要衣壳蛋
白，能够有效诱导机体产生特异性抗体，常被利用于检测试剂盒的备成。【方法】构建了p72全长（pET-28a-
ASFV-p72）及1-171aa截短突变体（pET-28a-ASFV-p72-（1-171））原核表达质粒，通过原核表达系统
表达并纯化了p72全长及1-171aa融合蛋白。该2种蛋白经过4次免疫日本大耳白Balb/C兔后，获得效价皆
为大于1∶819200的多抗血清。【结果】通过间接免疫荧光实验和Westernblot检测2种多抗均能与真核表达的
p72蛋白发生特异性反应。【结论】制备的针对p72多克隆抗体为后续诊断试剂盒的研发提供依据。
关键词：非洲猪瘟病毒；p72；原核表达；多克隆抗体
中图分类号：S852.65
+
1文献标志码：A文章编号：1000-2286（2021）01-0153-08
ProkaryoticExpressionofAfricanSwineFeverVirusp72Protein
andPreparationofPolyclonalAntibodies
CHENJinfeng，LEWei，HEYong，WULiqin，JIABaoyu，DENGXiaoqi，
HURuiming，HUANGDongyan，SONGDeping，WUXiangdong，
WUQiong，TANGYuxin，DINGZhen
*
（CollegeofAnimalScience&Technology，JiangxiAgriculturualUniversity，Nanchang330045，China）
Abstract：［Objective］Africanswinefever（ASF）isaswineviraldiseasecharacterizedwithhemorrhagic
breakofAfricanswinefevervirus（ASFV）inChina，hascausedhugedamage
totheswineindustry.p72isthecapsidproteinofASFV，whichcaneffectivelyinducespecificantibodies，and
isalwaysusedindetectkitdevelopment.［Method］Inthisstudy，thep72full-length（pET-28a-ASFV-p72）
收稿日期：2020‑09‑16修回日期：2020‑11‑02
基金项目：江西省重点研发计划重点项目（20201BBF61004）和江西省自然科学基金面上项目（20202BAB205004）
ProjectsupportedbytheKeyResearchandDevelopmentProgramofJiangxiProvince（20201BBF61004）andthe
作者简介：陈金凤，/0000-0001-6862-677X，*****************；*通信作者：丁珍，讲师，博士，主要从事冠
状病毒研究，/0000-0002-5002，********************.cn。
NaturalScienceFoundationofJiangxiProvince（20202BAB205004）
·154·
江西农业大学学报
第43卷
and1-171aatruncatedmutant（pET-28a-ASFV-p72-（1-171））combinant
‑
clonalantibodieswereobtainedandtheirtitersweregreaterthan1∶819200.［Result］Indirectimmunofluores‑
cenceandwesternblotassaysconfirmedthatpolyclonalantibodiescanreactwellwiththeeukaryoticexpres‑
sionofp72.［Conclusion］Thepolyclonalantibodiesagainstp72canbeappliedtothedevelopmentofsubsequent
diagnostickits.
Keywords：Africanswinefevervirus；p72；prokaryoticexpression；polyclonalantibodies
【研究意义】非洲猪瘟（africanswinefever，ASF）是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高度接触性传染
病。自1921年肯尼亚首次报道非洲猪瘟疫情后，该病在非洲大陆蔓延，随后传入欧洲和南美洲，2018年
我国辽宁首次出现ASFV疫情，至今世界各地仍有疫情爆发的报道
[1]
。ASF被我国列为一类动物疫病，被
世界动物卫生组织（worldorganizationforanimalhealth，OIE）列为A类动物疫病，一旦出现必须上报。【前
人研究进展】非洲猪瘟病毒（ASFVvirus，ASFV）有介于痘病毒和虹彩病毒的特征，为一个新科，国际病毒
分类委员会将其列入非洲猪瘟病毒属，ASFV为唯一已知代表种
[2]
。ASFV为单分子线性双链DNA病毒，
也是一种虫媒病毒。ASFV基因组全长170~190kb，含151个开放阅读框，可编码150~200种蛋白质
[3]
。
ASFV基因编码的结构蛋白约有50种，包括囊膜蛋白CD2v、p30、p54；衣壳蛋白p72、p49；核壳蛋白多聚蛋
白前体pp20和pp62；DNA结合蛋白p10、pA104R
[4]
。【本研究切入点】B646L基因编码的p72蛋白，是ASFV
的主要衣壳蛋白，蛋白大小约为73.2ku，产生于病毒感染晚期，为病毒参与结合细胞的重要蛋白，其表达
常作为病毒复制的标志
[5]
。MalloryElizabeth
[6]
绘制的氨基酸重叠图中可知，在氨基酸1至171中，含有2个
抗原表位，分别在160-165和165-171氨基酸肽段中，在图1中的C端被蓝色方格标记。【拟解决的关键问
题】笔者根据ASFVAuhuiXCGQ毒株序列（GenBank登录号：MK128995.1）合成了ASFVp72全长基因，利用
分子克隆技术构建了pET-28a-ASFV-p72和pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）原核表达质粒。通过
原核表达系统获的p72全长和1-171aa融合蛋白，使其作为抗原免疫日本大耳白Balb/C兔，获得高效价兔
源多克隆抗体，为非洲猪瘟血清学检测的发展提供依据。
Fig.1Antigenicepitopeoftruncatedproteinp72
图1p72截短蛋白抗原表位
1
1.1
1.1.1
材料和方法
试验材料
细胞、质粒和试验动物HEK293T细胞购自ATCC细胞库；日本大耳白Balb/C兔由武汉戴安生物
技术有限公司提供；pET-28a原核表达载体和pCAGGS-myc真核表达载体皆由本实验室保存；ASFV
（MK128995.1）p72全长基因同时5′端携带GAATTC（EcoRI）3′端携带GAGCTC（XhoI）的基因序列委托苏
州金唯智生物科技有限公司设计与合成。
第1期陈金凤等:非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备
·155·
1.1.2
胶回收试剂盒（GelExtractionKit）购自Omega公司；TOP10、BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技
（北京）有限公司；His蛋白纯化试剂盒由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；SDS-PAGE凝胶试
主要试剂EcoRI、XhoI内切酶购自NEB公司；T4DNALigase和DNAMarker购自TaKaRa公司；
剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司；PVDF膜由Millipore公司提供；极超敏ECL化学发光试剂盒购
自上海碧云天生物技术有限公司；DAPI购自ThermoFisher公司；PE标记的羊抗兔抗IgG和HRP标记的
羊抗兔IgG购自全式金生物技术有限公司。
1.2
1.2.1
试验方法
质粒构建笔者设计了p72（1-171aa）基因的特异性引物（表1），以合成的p72全长基因为模板，
PCR扩增目的基因，胶回收反应产物，经EcoRI和XhoI酶切并纯化，与经相同酶切处理的pET-28a载体
连接，产物转化至TOP10感受态细胞。挑取单个菌落扩大培养，质粒小提试剂盒提取pET-28a-p72（1-
171aa）质粒。而pET-28a-p72和pCAGGS-myc-p72则皆为通过EcoRI和XhoI酶，与分别pET-28a和
pCAGGS-myc连接形成。通过双酶切提取的质粒DNA和北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，鉴
定构建的质粒为正确。
表1引物序列
Tab.1Primerssequence
引物种类Kindofprimer
pET-28a-p72（1-171aa）-R
pET-28a-p72（1-171aa）-F
引物序列Primersequence
CCGCTCGAGattctttgtgccgggtac
gGAATTCatggcatcaggaggagc
1.2.2
空载质粒分别转化入BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单个菌落，摇菌扩大培养，加入终浓度为1mmol/L的
IPTG诱导目的蛋白表达，37℃摇床上180r/min诱导4h，设置未诱导为对照。诱导结束后，5000r/mim离
心10min，弃上清用PBS重悬，超声波破碎处理。离心后收集上清，加入上样缓冲液，沸水煮10min，通
蛋白的表达和纯化将鉴定正确的重组质粒pET-28a-p72及pET-28a-p72（1-171aa）和pET-28a
过SDS-PAGE凝胶跑蛋白电泳查看目的蛋白表达情况。扩大诱导的蛋白通过His标签纯化试剂盒进
行纯化。
1.3多抗制备
将纯化的蛋白作为抗原免疫2只2~3月龄日本大耳白Balb/C兔，第1次主注射使用弗氏完全佐剂，以
后加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后背部多点注射，免疫程序见表2。
表2免疫程序
Tab.2Immuneprocedure
Operating
Maininjection
Firstboostofimmunity
Secondboostofimmunity
第2次加强
第1次加强
主注射
操作
Immunecycle
0
28
42
免疫周期/d
Operating
Thirdboostofimmunity
Fourthboostofimmunity
Bloodcollection
放血
第4次加强
第3次加强
操作
Immunecycle
47
54
64
免疫周期/d
1.4抗体效价检测
按照间接ELISA方法对免疫后获得的血清进行效价检测：用抗原包被液将纯化后的重组ASFV
p72蛋白进行稀释，加入酶标板，4℃过夜包被，第2天弃液并用新配制的PBST洗涤3遍，排干板内液
体，加入5%脱脂奶粉进行封闭液，37℃培养箱封闭2h，封闭结束后PBST洗3遍，拍干待用。将2种血
清按1∶100×2
0
~1∶100×2
13
倍比稀释后，加入酶标板，37℃孵育1h，孵育结束弃液，洗涤拍干（同上），再向
其中加入1∶2500倍稀释的HRP带标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后弃液，洗涤拍干（同上），最后加入
·156·
江西农业大学学报
第43卷
TMB显色液37℃避光反应15min，浓硫酸终止反应后使用酶标仪于OD
450
检测吸光度。
1.5间接免疫荧光检测
将p72基因与pCAGGS-myc真核表达载体连接，使用pCAGGS-myc-p72和pCAGGS-myc空载分别
转染HEK293T细胞，24h后PBS清洗3次，使用4%的多聚甲醛在室温下固定细胞15min，PBS洗3次后，
用低温无水甲醇透化处理15min，之后PBS洗3次，使用10%的牛血清白蛋白（BSA）封闭，PBS清洗3次
后加入1∶100稀释的多抗血清作为一抗，37℃孵育1h，PBS将未结合上的一抗清洗后，加入PE标记的羊
抗兔二抗孵育避光30min，接着PBS清洗3遍，加入DAPI室温避光孵育15min，PBS清洗3遍后于荧光显
微镜观察结果。
1.6Westernblot检测
将pCAGGS-myc-p72和pCAGGS-myc分别转染于12孔细胞培养板培养的HEK293T细胞，28h后
收集细胞。取1.5mLEP管，加入1mLRIPA细胞组织裂解液和10µLPMSF蛋白酶抑制剂，混匀后每
孔加入100µL，冰上孵育20min，12000r/min，4℃离心10min，吸取上清加入5×LoadingBuffer于沸水
中煮10min。进行SDS-PAGE电泳，然后湿转于PVDF膜，转膜结束后，将膜浸于含5%脱脂奶粉的TBS
溶液中37℃封闭2h，TBST于摇床上清洗3次，每次10min。将2种血清1∶1000稀释作为一抗，孵育4h
后TBST清洗3次，每次10min，使用HRP标记的羊抗兔二抗（1∶2500稀释）孵育45min，TBST清洗3次，
每次10min，通过ECL化学发光液将膜于化学曝光仪上曝光。
2
2.1
结果与分析
重组表达载体的构建
笔者构建了pET-28a-ASFV-p72和pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）原核表达质粒，和pCAGGS-myc-
p72真核表达质粒，通过双酶切重组质粒，琼脂糖凝胶结果p72全长基因显示在1941bp（图2A和图2C），
p72截短突变体显示在513bp处（图2B），符合预期结果。
A：pET-28a-ASFV-p72双酶切结果；B：pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）双酶切结果；C：pCAGGS-myc-p72双酶切结果
plasmidpCAGGS-myc-p72byrestrictionenzymesdigestion
Fig.2
图2
recombinationplasmidpET-28a-ASFV-p72（1-171aa）byrestrictionenzymesdigestion；C：Identificationoftherecombination
Identificationoftherecombinationplasmidbyrestrictionenzymesdigestion
重组质粒的双酶切鉴定
A：IdentificationoftherecombinationplasmidpET-28a-ASFV-p72byrestrictionenzymesdigestion；B：Identificationofthe
2.2p72及1-171aa蛋白的表达与纯化
构建成功的pET-28a-ASFV-p72和pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）表达质粒转化入BL21感受态细
胞中，添加IPTG诱导4h后，收取细胞样品，并进行SDS-PAGE分析，结果发现p72（图3A）和p72（1-
171aa）（图3B）均出现明显的条带，分别在75.9ku和23.7ku处，未诱导及pET-28a空载则没有条带。p72
和p72（1-171aa）蛋白通过His标签纯化试剂盒进行纯化，并进行SDS-PAGE分析，结果纯化得到p72（图
3C）和p72（1-171aa）（3D）蛋白。
第1期陈金凤等:非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备
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A：p72的诱导表达；B：p72（1-171aa）的诱导表达；C：纯化的p72；D：纯化的p72（1-171aa）
A：expressedp72；B：expressedp72（1-171aa）；C：purifiedp72；D：purifiedp72（1-171aa）
Fig.3Expressionandpurificationofrecombinantprotein
图3重组蛋白的诱导表达与纯化
2.3多克隆抗血清的效价测定
用抗原包被液将纯化后的重组ASFV
p72蛋白进行稀释并包被酶标板，分别以抗
p72的兔血清、抗p72（1-171aa）的兔血清和
阴性血清作为一抗，按1∶100×2
0
~1∶100×2
13
倍比稀释加入。以HRP带标记的羊抗兔IgG
为二抗，加入TMB显色液反应，并通过浓硫
酸终止反应。OD
450
检测吸光度发现抗p72
和抗p72（1-171aa）2种兔血清的效价皆大于
1∶100×2
13
，即1∶819200。
2.4多克隆抗体的特异性
Fig.4Determinationoftiteroftwoanti-serums
图42种抗血清的效价测定
为检测获得的多抗的特异性，将pCAGGS-
myc-p72和pCAGGS-myc转染至HEK293T细胞，分别将抗p72和抗p72（1-171aa）2种多抗血清作为一
抗，进行Westernblot分析和间接免疫荧光检测，结果如图，Westernblot分析结果显示，抗p72（图5A）和
示，2种多抗可特异性识别HEK293T细胞中表达的p72蛋白（图5C和5D）。
抗p72（1-171aa）（图5B）2种多抗血清皆可识别蛋白大小约为75.9ku的条带；间接免疫荧光检测结果显
·158·
江西农业大学学报
第43卷
C：免疫荧光检测分析抗p72兔血清与p72蛋白的反应；D：免疫荧光检测分析抗p72（1-171aa）兔血清p72蛋白的反应
A：Westernblot分析抗p72兔血清与p72蛋白的反应；B：Westernblot分析抗p72（1-171aa）兔血清p72蛋白的反应；
A：Westernblotanalysisthereactionofanti-p72serumwithp72；B：Westernblotanalysisthereactionofanti-p72（1-171aa）
serumwithp72；C：Immunofluorescenceassayanalysisthereactionofanti-p72serumwithp72；D：Immunofluorescenceassayanal‑
ysisreactionofanti-p72（1-171aa）serumwithp72
Fig.5
图5多克隆抗体的特异性验证
Specificityverificationofpolyclonalantibodies
3结论与讨论
到目前为止，非洲猪瘟已经给我国养猪业造成了极大的损失。我国非洲猪瘟病毒的扩散主要由调
第1期陈金凤等:非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备
·159·
运感染猪、感染猪的肉制品及泔水、野猪及软蜱交叉传播，其中调运感染病毒的猪为主要的扩散原因
[7]
。
野猪与软蜱的交叉传播也使得病毒的净化工作变的困难。非洲猪瘟病毒的早期诊断对其有效防控至关
重要。目前非洲猪瘟病毒的检测方法有红细胞吸附实验（hemoadsorptiontest，HAD）、聚合酶链式反应技
术（polymerasechainreaction，PCR）、环介导恒温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）、
荧光抗体实验等，不同诊断技术的联合应用将会是非洲猪瘟诊断的发展趋势
[8]
。本试验制备的抗p72多
克隆抗体可运用于胶体金检测试纸条的制备，而胶体金检测试剂条具有方便快捷等优点，为ASFV的诊
断提供新方法。
常见的血清学诊断利用VP73、p54、p30及p72等蛋白制备抗体。VP73蛋白能够在自然感染中诱发，
且在MS细胞中传代后抗原性稳定；p54蛋白在上清表达，有利于纯化，但其为跨膜蛋白，全长蛋白无法在
大肠杆菌中表达；p30蛋白在病毒DNA合成前就开始表达，针对p30蛋白产生的抗体可以阻止病毒内
吞
[1,9-10]
。有研究评估了针对p72、p30、p523种蛋白的中和抗体在免疫保护中的作用，结果3种仅在感染
早期表现临床疾病发作延迟和降低的病毒血症水平的作用，其不足以进行抗体介导的保护，这也许是目
前尚无有效ASF疫苗的重要原因之一
[11]
。尽管无法进行抗体介导的保护，p72蛋白的强抗原性使其足够
应用于操作简单、准确性高的血清学诊断方法，以提供ASFV疫情诊断的参考
[12]
。
本研究通过设计引物合成p72基因，构建pET-28a-ASFV-p72和pET-28a-ASFV-p72（1-171aa）重
组质粒，表达出2种蛋白，纯化后免疫兔获得多抗血清，对获得的血清进行Westernblot和间接免疫荧光
试验，检测该多抗的特异性，结果显示特异性良好。p72蛋白在病毒感染时可有效诱导机体产生中和抗
体，且在线软件预测筛选发现B淋巴细胞优势表位为12-18、27-37、45-55、77-88、110-120位置
[13]
。本试
验构建的p72截短突变体1-171包含了这些预测的所有B淋巴细胞优势表位，同时也包涵了160-165、
全长蛋白及1-171截短片段可为ASFV相关血清学诊断方法奠定基础。
165-171等已经报道的抗原表位，本研究也证实该区间段氨基酸免疫大白兔能够产生良好的免疫原性。
目前已有研究
[14-16]
通过构建真核表达载体如杆状病毒表达系统、缺陷型重组腺病毒和重组新城疫等
表达了亲和力与反应性高的p72蛋白。虽然本研究通过原核表达系统表达并纯化了p72和1-
171aa融合蛋白，制备了抗p72和1-171aa的多克隆抗体，但制备的多克隆抗体效价高、且能与真核表达
的p72发生良好的反应，可运用于后续诊断试剂的开发。
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