2024年9月14日发(作者：应育)
热带作物学报２０１８，３９（８）：１５７０—１５７９
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ
文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析
杨翠萍，胡 进，闫冰玉，巩笑笑，谭玉荣，高 璇，王 丹，张 恒，
刘进平
海南省热带生物资源可持续利用重点实验室／海南大学热带农林学院，海南海口 ５７０２２８
摘 要 利用转录组文库中的 ７基因序列，从文心兰盛开期花瓣中扩增得到文心兰ＰＲＲ７基因的２个成员，
分别命名为ＯｎＰＲＲ７一 （ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＭＧ５４３９９３）和ＯｎＰＲＲ７—２（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＭＧ５４３９９４ ｏ ＯｎＰＲＲ７－
和ＯｎＰＲＲ７—２基因全长分别为２ ０９１ ｂｐ和２ １５４ ｂｐ，分别编码６９６和７１７个氨基酸大小的蛋白质序列。蛋白质二
级结构分析表明，ＯｎＰＲＲ７—１和ＯｎＰＲＲ７．２均为疏水性蛋白。ＢｌａｓｔＸ比对和系统发育分析表明，ＯｎＰＲＲ７－ 和
ＯｎＰＲＲ７—２基因和铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的 基因同源性比较高。实时荧光定量ＰＣＲ分析结果表明，ＯｎＰＲＲ７－，
和ＯｎＰＲＲ７—２基因均呈现昼夜节律性表达格式，并且在正午１２点时表达量达到峰值；在花发育和衰老过程中，
ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７．２基因在花瓣中的表达量均在绽口期和衰老初期达到峰值，表明其有可能在花发育的开花和
花衰老的过程中发挥作用。
关键词文心兰；生物钟；ＰＲＲ７基因；表达分析；开花；花衰老
￥６８２．３１ 文献标识码Ａ 中图分类号
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｉｒｃａｄｉａｎ—·Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ ＰＲＲ ７
ＹＡＮＧ Ｃｕｉｐｉｎｇ，ＨＵ Ｊｉｎ，ＹＡＮ Ｂｉｎｇｙｕ，ＧＯＮＧ Ｘｉａｏｘｉａｏ，ＴＡＮ Ｙｕｒｏｎｇ，ＧＡＯ Ｘｕａｎ，ＷＡＮＧ Ｄａｎ，
ＺＨＡＮＧ Ｈｅｎｇ，ＬＩＵ Ｊｉｎｐｉｎｇ
Ｈａｉｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈａｉｎａｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ ５７０２２８，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｗ０ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ尸Ｒ ７ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ．ＯｎＰ ７—１ ａｎｄ ＯｎＰ ７—２，ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｔａｌｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｆｕ１１．ｏｐｅｎｅｄ ｆｌｏｗｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ Ｐ尼Ｒ ７ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｆｕｌ１一ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ
ＯｎＰ Ｒ７．１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７—２ ｗａｓ ２ ０９１ ｂｐ ａｎｄ ２ １５４ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ．ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ６９６ ａｎｄ ７１７ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．ｒｅ．
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ．ＢＬＡＳＴＸ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｈｙ—
ｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＯｎＰＲＲ７．１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７．２ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ ｏｆ Ｄｅｎ—
ｄｒｏｂｉｕｍ ０历ｃｉｎａｌｅ ａｎｄ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅｑｕｅｓｔｒｉｓ．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ＯｎＰ尺 ７—１ ａｎｄ ＯｎＰ尺Ｒ７—２ ｇｅｎｅｓ ｂｏｔｈ ｈａｄ ａ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ．ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｐｅａｋｅｄ ａｔ １２：００
ｗｉｔｈｉｎ ２４ ｈｏｕｒｓ．Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＯｎＰ足尺７—１ ａｎｄ ＯｎＰ足尺７—２ ｉｎ
ｐｅｔａｌｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｔ ｔｈｅ ｂｕｄ ｂｕｒｓｔ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ
ｌｏｗｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｆｆｌｏｗｅｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ；ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ；ＰＲＲ ７ ｇｅｎｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ；ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ；ｆｌｏｗｅｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
ＤＯＩ １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—２５６１．２０１８．０８．０１５
生物钟（ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ）是生物体内一种内
在计时机制，是生物体对地球光照和温度等环境
收稿日期２０１７ １１ ２１；修回日期２０１８－０４—２６
因子昼夜周期变化长期适应而演化产生的适应机
制 钔。在植物体中，可以使体内生物学过程与体
基金项目 国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３１５６０５７３）；海南省重大科技专项（Ｎｏ．ＺＤＺＸ２０１３０２３ ｏ
作者简介杨翠萍（１９９２一），女，硕士研究生，研究方向：生化与分子生物学。 通信作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ）：刘进 （ＬＩＵ
Ｊｉｎｐｉｎｇ），Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕ３３０５６０２＠１６３．ｃｏｍ。
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析 １５７ｌ
外的昼夜和季节条件变化同步化，从而调控新陈
代谢活动并在最有利的昼夜和季节时问来分配
资源［５］。生物钟对于植物的生长、发育、生殖和
胁迫反应都有调控作用［１－５］。在生物钟系统核心
为一套复杂的、环环相扣的转录和翻译反馈环路
组成。生物钟核心振荡器由３个循环组成：中
心循环、早晨循环、傍晚循环ｌ２ Ｊ。其中ＰＲＲｓ
（ｐｓｅｕｄｏ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）为植物转录／翻译
昼夜节律网络中的关键成分，在生物钟系统中
的中央振荡器和生物钟输出过程起着至关重要
的调控作用Ｌ６ Ｊ。
目前拟南芥中发现参与生物钟调控的ＰＲＲｓ
共有５个，分别是ＰＲＲ１／ＴＯＣ１、ＰＲＲ３、ＰＲＲ５、
ＰＲＲ７和ＰＲＲ９ ］。拟南芥中ＰＲＲ家族成员在一
天里表达峰值按照ＰＲＲ９、ＰＲＲ７、ＰＲＲ５、ＰＲＲ３、
ＰＲＲ１的顺序依次出现，间隔２～３ ｈ。其中ＰＲＲ９
出现在黎明，而ＰＲＲ１表达峰值出现在傍晚【７ Ｊ。
这５个成员因为与原核生物的磷酸化和脱磷酸化
双元信号系统的受体ＲＲ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）
有很高的同源性而被命名为ＰＲＲｓ家族。ＰＲＲｓ
基因均具有两个保守的结构域，分别是氨基端
的ＲＬＤ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ．１ｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）结构域和羧基端
ＣＣＴ（Ｃ０ＮＳＴＡＮＳ／Ｃ０ＮＳ１ ＮＳ．ＬＩＫＥ／ＴＯＣ１）结
构域［８－１０］。目前，除在模式植物拟南芥和水稻中
ＰＲＲ基因研究较为充分外，在少数重要作物如玉
米、高粱、大麦、小麦和甜菜等也有少数的研究，
但尚未见到在观赏园艺植物上相关基因研究的报
道 ¨。
对于 ７基因的研究不多，但是先前有研
究表明ＰＲＲ７—８．葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白定位
于细胞核，意味着其可能在调控光敏基因表达中
起作用，并经研究发现ＰＲＲ７可作为光敏色素调
节的基因表达中信号传导的中间体，负责响应于
光的幼苗的消长和生物钟的阶段［１ 。拟南芥的生
物钟是由一系列的互锁反馈循环环组成，ＰＲＲ７
和ＰＲＲ９在早上循环环中起作用；经ｐｒｒ７／ｐｒｒ９双
突变体研究发现，ＰＲＲ７和ＰＲＲ９在调节ＣＣＡ１
和ＬＨＹ响应环境温度的活动中发挥作用 引。
文心兰（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ）属于兰科文心兰属植物，
又名舞女兰、金蝶兰等，是世界上重要的切花品种，
具有极其重要的观赏价值和经济价值［１４－１５］ｏ栽培的
文心兰切花品种以黄色花南茜种（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ Ｇｏｗｅｒ
Ｒａｍｓｅｙ）及其变异种为主 引。海南大学热带农
林学院刘进平课题组研究表明，文心兰花发育可
根据其形态特征明确分期，是一种很好的花发
育和衰老的研究系统¨ ］。此前刘进平课题组
已从文心兰中克隆和鉴定出一系列跟花发育和
衰老相关的基因［１９－２３］。植物能精确地控制其开
花时间，以确保其能成功地进行繁殖。开花时
间的季节控制的一个重要因素是光周期，而日
照时长由体内生物钟所测量的。因此，生物钟
对光周期反应和植物开花具有重要的调控作用
［２４－２５］
。
我们最近的转录组学研究表明，生物钟
基因ＰＲＲ７基因可能还参与了花瓣衰老的启动
调控。
本研究利用转录组分析所获得的序列，克隆
到生物钟相关基因 ７，并利用生物信息学方法
分析了该基因推定的蛋白质的结构，利用序列比
对构建了系统进化树，并研究了 ７基因昼夜
节律性表达及在文心兰切花发育和衰老过程中在
花瓣中的基因表达格式。
１材料与方法
１．１材料
本研究所用材料为文心兰南茜种‘黄金３
代’（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ Ｇｏｗｅｒ Ｒａｍｓｅｙ‘Ｇｏｌｄ ３’）鲜切花。
购白海南出入境检验检疫局热带植物隔离检疫
中心。
ｌ－２ 方法
１．２．１ 文心兰花瓣总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ第一
链的合成 取２～３个文心兰花瓣于预冷的研钵
中，在液氮环境下充分研磨成粉末状，之后用通
用植物总ＲＮＡ提取试剂盒（离心柱型，购自北京
百泰克生物技术有限公司）提取ＲＮＡ。用１％琼
脂糖凝胶电泳鉴定ＲＮＡ完整性，并且测量ＲＮＡ
的浓度。获得高质量ＲＮＡ后，按照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ
ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ试剂盒（购自
ＴａＫａＲａ公司）说明进行反转录反应，合成ｅＤＮＡ
第一链。
１．２．２ 文心兰ＰＲＲ７基因的克隆利用转录组测
序得到的差异表达基因ＰＲＲ７序列片段，用ＮＣＢＩ
热带作物学报 第３９卷
的Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）预测蛋白质的三级结构，使用
ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）进行保守结构域分
ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／
析，然后用ＮＣＢＩ的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ＴＭＨＭＭ／）进行跨膜预测，使用ＤＮＡＭＡＮ软件
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｒｆｉｆｎｄｅｒ／）分析序列的开放阅读框， 进行氨基酸序列的多重比对，并且使用ＭＥＧＡ ６．０
并根据ＯＲＦ两端设计上下游引物ＰＲＲ７．Ｆ和 软件构建ＮＪ系统进化树。
ＰＲＲ７ Ｒ（表１），克隆ＰＲＲ７基因的ＯＲＦ序列。
１．２．４文心兰ＰＲＲ７基因的节律性表达分析以及
ＰＣＲ反应体系如下：ＴａＫａＲａ ＬＡＴａｑ ０．５ ｐＬ，１０￣ 在花发育过程中的表达分析文心兰ＰＲＲ７基因
ＬＡ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ Ｌ，ｄＮＴＰｓ ８ Ｌ，ｅＤＮＡ ｌ Ｌ，
的节律性表达分析取样方法为：首先将购买的１ ００
上下游引物各０．５ ｕＬ，灭菌蒸馏水３４．５ ｋｔＬ。ＰＣＲ
枝文心兰鲜切花在１２ ｈ光照和１２ ｈ黑暗（１２Ｌ：
程序如下：９４℃预变性３ ｍｉｎ；９４℃变性３０ Ｓ， １２Ｄ），预处理２～３ ｄ，然后每隔２ ｈ采样，总共
５５℃退火３０ Ｓ，７２℃延伸２ ｍｉｎ １５ Ｓ，３０个循环； 采样时间４８ ｈ；文心兰ＰＲＲ７基因在花发育过程
７２℃延伸１０ ｍｉｎ；４℃保存。将ＰＣＲ产物进行
中的表达分析取样方法为早上８点采集分别处于
１％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用ＯＭＥＧＡ Ｇｅｌ 花苞期、绽口期、半开放期、盛开前期、盛开期、
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（购自ＴａＫａＲａ公司）进行胶回收，
衰老初期、衰老期和脱落干枯期８个阶段的文心
回收目的片段，之后连接到ｐＭＤ．１９Ｔ载体上，转 兰花瓣。采用１．２．１节中的方法进行花瓣总ＲＮＡ
化大肠杆菌感受态细胞ＤＨ５ａ，过夜培养，进行 的提取和反转录反应。用Ａｃｔｉｎ检测基因对反转
菌落ＰＣＲ鉴定，获得阳性克隆后送上海英潍捷基 录得到的ｅＤＮＡ进行质量的检测，Ａｃｔｉｎ基因作
生物公司进行测序。 为内参。所用引物序列见表１。Ｑ．ＰＣＲ表达分析
１．２．３ ＰＲＲ７—１和ＰＲＲ７—２基因生物信息学分析 的反应体系如下：ＳＹＢＲ Ｐｒｉｍｉｘ ＴａｑⅢ１０“Ｌ，
利用ＮＣＢＩ的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ进行ＯＲＦ和编码氨基酸
ｅＤＮＡ模板２ Ｌ，ｄｄＨ２０ ６．６ Ｌ，Ｄｙｅｌ１ ０．４ ｐＬ，
序列预测；用ＥｘＰＡＳｙ在线分析软件
上下游引物各０．５“Ｌ。每个不同来源的模板都进
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｖｇ／ｉｎｄｅｘ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）进行蛋
行３次生物学重复实验。ＰＣＲ程序如下：９４℃
白质理化性质的预测，包括蛋白质等电点和相对
预变性３ ｍｉｎ；９４℃１５ Ｓ，６０℃１５ Ｓ，７２℃２０ Ｓ，
分子质量和蛋白质二级结构预测（ＳＯＰＭＡ＆
４０个循环。最后采用２以Ａｃｔ法进行目的基因的表
ＣＯＩＬＳ），用Ｓｗｉｓｓ．ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅ１．
达量分析。
表１本研究所用引物序列
Ｔａｂ．１ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析
１．２．５ 文心兰ＰＲＲ７一，和ＰＲＲ７—２基因差异验证
泳道４为以ＯｎＰＲＲ７—２为模板，以ＯｎＰＲＲ７一，一Ｆ．Ｑ
和ＯｎＰＲＲ７一Ｒ—Ｑ为引物的扩增产物，产物大小为
ｌ ｌ ８ ｂｐ。结果表明ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７—２相似性
考虑到两个基因仅存在６０ ｂｐ左右碱基的明显差
异，所以Ｑ ＰＣＲ对这两个基因进行区分验证时采
用相同的下游引物
上游引物
尺７一Ｒ．Ｑ，而上游引物
很高但是也存在差异，说明是２个不同的序列。
ＰＲＲ７一，一Ｆ．Ｑ是在差异序列之前区域设计的引物，
尺７—２．Ｆ—Ｑ则是在差异序列区域设计
尺７一Ｒ．Ｑ，及
１Ｏ０ｂｐ
的引物；以 ＪＲ７一，和Ｐ尺尺７—２为模板，以Ｑ．ＰＣＲ
设计的引物朋尺７一，．Ｆ．Ｑ和
ＰＲＲ７—２一Ｆ—Ｑ和 ７一Ｒ—Ｑ为引物分别进行ＰＣＲ
扩增反应，观察扩增产物的异同。
Ｍ：ｌ００ ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｉ、２：ＯｎＰＲＲ７—１基因扩增产物；
３、４：ＯｎＰＲＲ７—２基因扩增产物。
２结果与分析
２．１ 文心兰 ７基因ｅＤＮＡ的克隆
以文心兰花盛开前期的花瓣ＲＮＡ反转录产
生的ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增得到两条２ ０００ ｂｐ
Ｍ：ｌ００ ｂＤ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１，２：ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ＯｎＰＲＲ７－，ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ；３．４：ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ＯｎＰＲＲ ７－２ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ．
图２ ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７－２基因差异序列验证
Ｆｉｇ．２ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７．１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７－２
左右的条带（图１），分别命名为ＯｎＰＲＲ７一Ｊ，
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＭＧ５４３９９３）和ＯｎＰＲＲ７—２
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＭＧ５４３９９４）。
Ｍ １ ２
２．３ 文心兰ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７－２基因的生
物信息学分析
测序表明ＯｎＰＲＲ７一Ｊ和ＯｎＰＲＲ７－２存在很小
的差异，其中ＯｎＰＲＲ７—２比ＯｎＰＲＲ７一 多６０ ｂｐ左
右的核苷酸序列。理化性质分析表明，ＯｎＰＲＲ７一
编码的蛋白分子式为Ｃ３２４６Ｈ５１９０Ｎ１０１０Ｏ１０６４Ｓ２８，分
２ ０００ｂｐ—
子量７６ ２８６．７２，等电点是７．９２，经预测该蛋白是
一
１ ０００ ｂｐ—
种不稳定蛋白。在氨基酸组成上是负电荷残基
（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）总数为８０个，正电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）
Ｍ：１ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ：１：０ｎＰＲＲ７－，；２：ＯｎＰＲＲ７－２。
总数为８２个。ＯｎＰＲＲ７一ｌ蛋白是一种亲水性蛋白，
经跨膜结构域预测可知，ＯｎＰＲＲ７—１蛋白没有明
显的跨膜结构域，因此它可能不是膜蛋白。
ＯｎＰＲＲ７－２ 编码的蛋白分子式为
图１文心兰ＰＲＲ７基因的克隆
Ｆｉｇ．１ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ＰＲＲ７ ｇｅｎｅｓ
２．２ 文心兰ＯｎＰＲＲ ７＿Ｊ和Ｏｎ
验证
７－２差异序列
Ｃ３３３８Ｈ５３４１Ｎ１０３９Ｏ１０９８Ｓ２７，分子量为７８ ４６２．０５，等
电点是８．１３，经预测该蛋白也是一种不稳定的蛋
白。在氨基酸组成上，负电荷残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）
总数为８１个，正电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）总数为８４
ＯｎＰＲＲ７—２序列中间部分有６０ ｂｐ左有的序列
与ＯｎＰＲＲ７一，序列差异比较大，因此使用设计的
Ｑ—ＰＣＲ引物ＯｎＰＲＲ７一Ｊ—Ｆ—Ｏ与ＯｎＰＲＲ７一Ｒ．Ｑ，及
ＯｎＰＲＲ７－２一Ｆ—Ｑ与ＯｎＰＲＲ７一Ｒ．Ｑ对２个基因进行
个，ＯｎＰＲＲ７．２同样也是一种疏水性蛋白。经跨
膜结构域预测，该蛋白同样没有明显的跨膜结构，
因此也不是膜蛋白。测序结果显示，ＯｎＰＲＲ７．，
和ＯｎＰＲＲ７—２的ｃＤＮＡ片段分别为２ ０９ｌ ｂｐ和２
ｌ５４ ｂｐ。以ＮＣＢＩ上的ＯＲＦ开放阅读框在线分析
可知，ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７—２分别编码６９６个氨
基酸（图３）和７１７个氨基酸（图４）。
验证．其中ＯｎＰＲＲ７—２．Ｆ—Ｑ引物是根据差异序列设
计的引物，扩增结果如图２所示。图２中泳道１
为以ＯｎＰＲＲ７ １为模板，以ＯｎＰＲＲ７－２．Ｆ—Ｑ和
ＯｎＰＲＲ７一Ｒ—Ｑ为引物的扩增结果；泳道２为以
Ｄ，２ 尺７一，为模板，以ＯｎＰＲＲ７一』．Ｆ—Ｑ和ＯｎＰＲ ７一
Ｒ—Ｑ为引物的扩增产物，产物大小７６ｂｐ；泳道３
为以ＯｎＰＲＲ７－２为模板，以ＯｎＰＲＲ７—２．Ｆ和
ＯｎＰＲＲ７一Ｒ为引物的扩增产物，产物大小８９ ｂｐ；
经二级结构预测可知，ＯｎＰＲＲ７一，编码的蛋白
二级结构主要包含２８．３０％ｃ【螺旋，１６．９５％Ｄ片层，
ｌ５７４ 热带作物学报 第３９卷
ｌ Ａ
雁 Ｇ Ｇ Ｔ Ｈ Ｒ Ｋ Ｒ
丌＾＾Ｔ 。Ａ。 “ Ａ Ｅ Ⅱ Ｋ Ｅ Ｖ ＲＡＡＧＧ ＮＡＡＴ ＧＧＧＧＴ ＬＴＡ ＤＧＡＴ ＥＧＡＡ ＤＧＡＴ ＥＧＡ ＤＡＯＡＴ ＥＧＡＧ ＳＴＣＡＡ ＲＧＧ ⅢＡＴ ＮＧＡＡＴ ＧＧＧＴ ＶＧ１１ Ｓ１ＣＣＡ ■ＤＴＧＧＡＴ ＬＴｒ＾Ａ ＮＡ ＥＴＧＡＡ
ＣＣ亿Ｔ
ＴＴ
Ｐｖｖ
１３６ Ｇｒｒｃ＾ＴＧＴ
Ｖ Ｈ Ｖ
Ｖ Ｅ ＾ Ａ 直 Ｔ Ｑ Ｉ Ｐ Ｉ Ｌ Ｅ Ｋ Ｌ 盛 Ｑ Ｑ Ｓ
＾ＴＴＧＧＴＧＧＡＧ从Ｔ
Ｆ Ｌ Ｐ Ｌ Ｒ Ｓ Ｌ Ｋ Ｖ Ｌ Ｌ Ｖ Ｅ Ｎ
２７１ Ｇ＾ＴＧ＾
Ｄ Ｄ
Ｓ Ｔ Ｒ口
ＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＴＴ＾ＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡ
Ｖ Ｖ Ｓ Ａ Ｌ Ｌ Ｒ Ｎ Ｃ Ｃ Ｙ Ｅ Ｖ Ｔ Ａ Ａ Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ Ｅ Ａ Ｒ
｛订Ｔ＾ＣＱＡＧ。ＡＤ ：盯
ｓＮ
ＡＨｎ ∞ 。 ＾Ｇ订 。ＡＣＴＴ。ＡＥ。
。ＴｓＣＴＡＫＡ。
Ｑ Ｇ Ｅ Ｋ
Ｔ直Ｃ＾ＡＧＧＣＧ＾＾＾＾＾
∞。； ＴＴ ｊｃ。 。 订 “ 亿
５４１
盯 。 吼ＴＧ 。ｃＡ
Ｋ 丁
ＴＴ￣Ｃ
Ｃ Ｋ Ｔ
ＩＰ
ＣＡ
ＴＧ ＴＧＴＣＡＴＣ
ｍＩｓ
Ａｗ 丌 ；。 ｎＴＩＡＧｖＴ ＴＴＦＴ ＡＫ
ＡＡＧＣＣＡＡ
＾ Ｖ Ｄ Ｆ Ｌ Ｖ Ｘ Ｐ Ｉ Ｒ Ｋ Ｎ Ｅ Ｌ
ＡＧ ＡＴ ＧＣ。Ａ∞ＨＡｗｖＴ ＴＧｗＧ ｎ
Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｅ Ｓ Ｇ
Ｉ
１‘ＧＧＧ＾ＧＴＧ＾Ｔ直Ａ
盯。 Ａ＝Ｇ 。
ＴＴ
。ＧＡＥＧ。ＡＤ ＡＡＮ ＧＧＧｎＧｓＣ
Ｉ Ｇ Ｌ Ｓ Ａ Ｒ Ｄ Ｇ Ｓ Ｄ Ｎ Ｇ Ｓ Ｇ Ｔ Ｑ Ｓ Ｓ
Ｔ Ｃ ＾ ０ Ａ
ＴＣＧＡＴＧＴＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＣＴＴＧ＾
Ｉ Ｄ Ｖ Ｖ Ｈ Ｈ Ｔ Ｋ Ｆ Ｎ Ⅱ Ｌ Ｄ
Ｅ Ｐ Ｓ
■Ｔ Ｋ Ｒ Ａ Ｆ Ｅ
。ｎ
９４ｅ
。 ｃ３ 她：盯８ 盯 ２ 。８＾ 。ｉ Ｃ Ａ
Ｘ Ｅ ０ Ｋ Ｋ Ｉ
ｃＡＴＣＣ Ｔ 。 ＡＧｃ Ｆ Ｃ Ｓ Ｋ Ｋ Ｌ Ｌ 产
： ＾Ｔｃ ：。 ＣＡ。ＧＧＡＤ。
ＴＣＡＡＣＴＣ
珂 Ｓ Ｐ Ｇ Ｔ Ｅ Ｋ Ｌ Ｓ Ｅ Ｋ Ｐ Ｐ Ｋ Ｎ
＾Ｒ Ａ Ｓ Ｄ Ｑ Ｌ
ＡＡＡＧＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡ Ｔ＾＾Ｔ００＾ＴＧＴＧＴＴＧＡＧＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＴ
Ｇ Ｈ Ｎ Ｓ Ｉ Ｈ Ｔ
１２１ｅ
Ｓ
１３５１
辩Ｑ Ｑ Ｓ Ｖ Ｌ Ｇ Ｄ Ａ Ｓ Ｋ Ｄ Ｆ Ｌ Ｋ Ｉ Ｓ Ｅ Ｓ Ｋ Ｄ Ｎ Ｇ Ｃ Ｖ Ｅ Ｌ Ｐ Ｓ Ｌ Ｅ Ｌ Ｓ Ｌ Ｋ Ｒ Ｌ Ｒ
ＴＧ１’０ＣＴ
＾ Ｓ Ｉ Ｐ Ｐ Ｈ Ｅ Ｅ Ｒ Ｎ Ｖ Ｌ Ｋ Ｈ Ｓ Ｎ Ｌ
Ｔ； ｉ盯ＹＡ ＣＰＣＴＧＡＣ订 ： Ａ Ｓ Ｖ Ｑ Ａ Ｐ Ｔ Ｇ珏ＧＴＧＧ＾ ＧＧＧＡ＾ Ｎ＾Ｃ ＳＴｃＴ＾ ＴＣＡ ＬｃＴＣ ＥＧ＾Ａ＾ ＴＣＴ
Ｔ从ＡＴＣＣＡＧＴＣ直
＾Ｔ
ＴＣＡＧＣｅ兀＿ｃＣＡＣ
Ｓ Ｓ Ｅ
ｌ幸Ｂ６ ＣＧ
＾Ｔ Ｐ Ｑ瑶 Ｑ Ｇ Ｓ Ｎ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｓ Ｎ Ｎ Ｉ Ｄ Ｋ Ｇ Ｓ Ｔ Ｎ Ｉ Ｎ Ｐ Ｖ Ｈ Ｋ Ｐ Ｃ Ｖ
Ｙ Ｘ Ｄ Ｖ Ｓ Ｔ Ｓ ＾ Ｆ Ｈ
ＴＣＧ＾１ｌＧ直 ＴＣＡＣＡＧＡＡＡ且Ａ ＴＣ＾ＴＣ＾ＴＴＡＴ
Ｒ Ｖ Ｑ Ｓ Ｒ Ｓ Ｓ Ｄ Ｉ ｑ Ｐ Ｖ Ｖ Ｑ Ｅ Ｔ
Ｉ Ｄ Ｄ
Ｖ Ａ Ｖ Ａ Ｐ Ａ Ｉ Ｅ Ｏ Ｌ Ｒ Ｇ Ｓ ０ Ｋ Ｎ
Ｖ Ｑ Ｖ Ｑ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｙ
。 ＴＣＡＡ ＣＡＣＣＡＣＣＡ ＴＣＣ
ＨＨＨＩ
Ｈ
Ｈ Ｙ
Ａ Ｇｉ盯 ２ 。 ｃ＾。 Ｇ＾Ｔｃ８∞
Ｇ Ｃ Ｓ Ｖ Ｅ Ｎ Ｌ Ｋ Ｐ Ｎ Ａ Ａ Ｙ Ｈ Ｎ Ｓ Ｓ Ｎ Ｖ
ＴＴＧ＾ＡＣ＾Ａ＾ＴＴＴ
Ａ
ＡＡＴＧＧ
ＴＧ
ＧＣＡＴ
ＣＴＡＴＡＧＣＴＴ＾＾ＡＴＧＧ＾
ＮＧＧＩ
Ｙ
ｓ
Ｌ
Ｎ
Ｇ
１７５６ ＡＧ
ｓ Ｈ
虬
Ａ ｃ： ＡｓＧｗＤＡ ∞＾Ｇ
ＴＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡ
ＴＧＧＧ
ＴＴＧＣ＾
Ｇ Ｇ Ｓ Ｓ Ａ Ｉ Ｎ Ｈ 再 Ｇ Ｇ Ｔ Ｎ 曩 Ｅ Ｇ Ｄ ＾ Ｉ ＾ Ｖ Ａ Ｅ Ｋ
Ｉ Ｇ
Ｆ Ｇ Ｇ Ｇ Ｎ Ｇ
Ａ
Ａ
ＣＣＴＡＴＣ
Ａ Ａｎ
ＮＥ
Ａ
Ｙｏ
Ｎ
Ｆ Ｌ Ｑ Ｒ Ｅ Ａ Ａ
Ｌ Ｎ Ｋ Ｆ Ｒ Ｌ Ｋ Ｒ Ｋ Ｅ Ｒ Ｈ Ｆ Ｇ Ｋ Ｋ Ｖ Ｒ
Ｙ
Ｏ Ｓ Ｒ Ｋ Ｒ
： Ａｃ
２０２６
Ｐ Ｒ Ｖ Ｒ Ｇ ０
；ｃＧ 。 ｛ ∞ＨＡ ＮＡ％ＥＡＧ ＡＮ
Ｏ
矗＾
Ｅ Ｅ Ｎ Ｓ
图３ ＯｎＰＲＲ７－１基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７一
ｌ＾
Ｈ Ｇ Ｇ Ｔ Ｈ Ｒ Ｋ Ｒ
。ＴＧ。 甲 ： “
Ｅ Ｈ
“ 。Ａ
ＡＴＧＧ
ＧＴＴＡＧＡＴＧ
Ｋ Ｅ Ｖ
Ｈ
ＧＬ
Ｄ
Ｅ
Ａ Ｇ＾ 从ｃ Ｅ Ｓ Ｒ Ⅲ 翦
Ｇ
∞
Ｒ
ＧＧ
ＴＧＴＴＴＣ
ｖ
ｓ
。。
Ａ 。Ａ
ＮＥ
ｌ３６ ＧＴＴＣ＾ ｒｎ：ＣＴ＾
ＴＴ
ＴＧＧＡＧＡＡＴ
Ｖ 丑 Ｖ Ｖ Ｅ ＾ ＾ ＾ Ｖ Ｔ ０
Ｉ Ｐ
Ｉ Ｌ Ｅ Ｋ Ｌ ｑ ｑ Ｑ Ｓ
Ｌ ＾ Ｐ Ｖ Ｖ Ｒ ■ Ｅ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ Ｌ Ｒ Ｓ Ｌ Ｋ Ｖ Ｌ Ｌ Ｖ Ｅ Ｎ
２７ｌ ＧＡＴＧＡ 竹
Ｄ Ｄ Ｓ Ｔ Ｒ Ｑ Ｖ Ｖ Ｓ Ａ Ｌ Ｌ Ｒ Ｎ
４０６
ＧＣｔ
ＡＴＧ
ＡＡＧＴ
Ｔ
ｃＹＥｖ
Ｔ Ａ 直 Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ Ｅ ＾
Ｇ直
盯ＣＧ Ａ Ａ
ｓＮＨ
ｊ∞ＡＴｃ ｖＴ” “ＴＣＴ。ＡＥ。
Ｔ＾Ｃ＾＾ＧＧＣＧＡ＾＾＾＾
Ｏ Ｇ Ｅ Ｋ
ＴＧＣＡＡＧ＾Ｔ
ＣＡ
ＴＧＡＧ
ＣＣ
ＡＴ直
ＡＡ＾ＣＴＴ
ｃ
Ｋ
Ｉ蕞ｓＨＫＴ
ＡＧＡＡ
Ｈ
。ＣＡＧ。
Ａ Ｔ
。
Ｈｖ
－
ＴＣＣ
ＴＧ
ＴＧ＾ＴＴ＾ＴＧ
ＴＧＴＣ
ＡＴＣＣＡＡＴＣＡＴＴＣ
ＰｖＩ
Ｈ
孤
ｓ
ｓ
ＮＤ
ｓ
Ｃ＾：Ｇ Ｔ＾ ｃＴｖ ＴＴＦ７ ＡＫ＾Ｔ ｃ 。ＴｓＣＴ ＫＡＧ Ｔ
５４１
Ｅ Ｌ Ｋ
ｇａｇ 时ｇ。 Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｃ Ｓ Ｇ Ｓ Ｅ Ｓ Ｇ
Ｉ
ｅ７６ ＡＴＧＡＴＧ
Ａ ＡＧＧ
ＮＤＥＥ
Ｄ
ＡＣ ： 兀Ｇ ：“； ：“ 。ＡＤＴＧＧＧ。ＡｓＧ ＤＡ ＮＡ
Ｇ Ｓ Ｇ Ｔ Ｏ Ｓ Ｓ ’ 丁 Ｋ Ｒ ＾ Ｆ Ｅ
ＴＧＡＡ
Ｓ Ｘ Ｋ Ｌ Ｌ Ｐ Ｈ Ｎ Ｐ Ｇ Ｌ Ｄ
ｃＴ。 ２。
９４６
“ 。 。
＾Ｔ。＾Ｔ
■
Ａ兀 ：
。：ｃ＾ｃ
ＡＨＴ。ＡＤ ＾ｃ耵 。ＡＱ ＾ＣＣ 他 ＴＣＰＣ ＫＡ ＰＣＴ。ＥＡＡＧ
Ｆ Ｃ
ｎ
Ｋ
ＴＴＣＣＡＴＣＡ＾Ｃ＾Ｃ＾＾ＡＴＣＡＡＣＡＡ
Ｋ Ｅ Ｏ Ｋ Ｋ
１０８１ ＧＣＡＧＣＴＣＡＴｃＡＴ
＾＾
Ｈ
Ｈ
Ｔ Ｋ Ｆ Ｎ
１２拍
ＴＣＧ＾Ｔ
Ｓ Ｔ Ｋ Ｌ Ｔ Ｇ Ｐ Ｇ Ｔ Ｅ Ｋ Ｌ Ｓ Ｅ Ｋ Ｐ Ｐ Ｋ Ｎ
Ｉ Ｄ
Ｌ Ｄ Ｅ Ｐ Ｓ Ａ Ｒ Ａ Ｓ Ｄ Ｑ Ｌ Ｇ Ｎ Ｎ Ｓ Ｉ Ｎ Ｔ Ｎ Ｑ ｑ Ｓ Ｖ Ｌ Ｃ Ｄ＾ Ｓ
＾Ｔ 呵“ＫＡＡＡＴＩＣＴｓＣ。
ＴＴＣＴＣ＾ＡＧＧＴＡＴ
Ｔ０Ｇ＾Ｃ＾Ｔ＾ＣＧＴＴＣＧ
ｃ Ａ ｃＡ
Ａ＾ＧＡ
Ｔ＾ＡＴＧＧ
＾ＴＧＴＧＴＴＧＡＧＴＴ
ＡＣ
Ｃ＾ＴＣ
ＴＣＴ
ＴＧ
Ｋ
Ｄ
Ｎ
Ｇｃｖ
ＥＬＰｓＬＥ
。
ＡＡＣ：
Ｓ Ｌ
ＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡ
Ｋ Ｒ Ｌ Ｒ
ＴＧＴＧＣＴ
Ｓ ＾ Ｓ Ｉ Ｐ Ｐ Ｈ Ｅ Ｅ Ｒ Ｎ Ｖ Ｌ
瑶 Ｈ Ｓ Ｎ Ｌ Ｓ ＾ Ｆ Ｓ Ｒ Ｙ
”
＾ＣＡＣＴＣＧ＾＾ＡＣＴ
Ａ Ｓ Ｖ 口 ＾ Ｐ Ｔ Ｇ Ｈ Ｇ Ｇ Ｎ Ｓ Ｔ Ｌ Ｅ Ｔ Ｓ Ｓ Ｅ Ａ Ｔ Ｐ Ｑ Ｎ Ｑ Ｇ Ｓ Ｎ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｓ对Ｎ
Ｉ Ｄ Ｉ Ｇ Ｓ
。＾Ｔ＾
。
１７５ｅ
Ｐ Ｖ Ｔ Ｘ Ｐ ０ Ｖ
Ａ ＡＡ
＾Ｔ 。＾ｃ ｊ Ｃ
Ｓ ＾Ｆ Ｈ Ｒ Ｖ Ｑ Ｓ Ｒ Ｓ Ｓ Ｄ Ｉ Ｑ Ｐ Ｖ Ｖ Ｑ Ｅ Ｔ
Ｉ
ＴｅＧ＾ＴＧ＾
Ｄ Ｄ
Ｖ ＾ Ｖ ＾ Ｐ
ＴＣ。
Ａ ＡＧ
ＴＧ
Ｉ
Ｅｏ
Ｌ
ＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＴＣＣＡＴ００ＣＴＣＡＡ＾ＴＣＣＣＣＡＧＴｃ。Ｇ＾ＴＣ＾ＧＧＡ
ＫＮ
Ｖ ｑ Ｖ Ｑ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｙ Ｈ Ｈ Ｙ Ｈ Ｈ Ｈ Ｉ Ｈ Ａ Ｓ Ｈ Ｐ Ｑ Ｓ Ｄ Ｑ Ｄ Ｇ Ｃ Ｓ Ｖ Ｅ 辩Ｌ
Ｋ Ｐ Ｎ Ａ Ａ Ｙ Ｈ Ｎ Ｓ Ｓ玎 Ｖ
： ： ＴＩＣＴＡＹ ：“ＮＡ “ＧｓＴ ＡＮＴ ＣｓＡＧ 。ＡｓＧ ＮＡＴＣＨＡＴＧＧＧ“ ＴＧ＾ ＧＣＡ。“ＡＮ
Ｇ
； 警 ｗ
ＴＴ
ＴＴＡ
ＡＴ矗
ＡＴＡＡＴＧ
Ｇ Ｓ Ｓ ＾ ＩＨ
Ｎ
Ｎ
Ｇ
Ｇ＾Ｇ：Ｔ
１８９１ ＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＣＣＴＡ
Ｔ Ｈ 麻 Ｅ Ｃ Ｄ ＾ Ⅱ Ｖ Ｖ Ａ Ｅ Ｋ Ｓ Ｇ
２０２６
ＡＨ亿ＥＡ ＧＣ＾ＴＴＹＡ ＣＡ。。ＡＡ月Ｔ
∞Ａ
。
１＿ｒＧ＾＾Ｃ＾ＡＡ
Ｆ Ｌ ０ Ｒ Ｅ ＾ ＾ Ｌ Ｎ Ｋ Ｆ Ｒ Ｌ Ｋ Ｒ
Ｋ Ｅ Ｒ Ｎ Ｆ Ｃ Ｋ Ｋ Ｖ Ｒ Ｙ Ｑ Ｓ Ｒ Ｋ Ｒ
Ｌ ＾ Ｅ ０ Ｒ Ｐ Ｒ
ＴＣＣＡ。Ａ
ＡＴＧＡ ＡＡ＾
Ｉ
Ｈ
Ｎ
Ｅ
Ｎ
０ Ｅ Ｅ Ｎ Ｓ
图４ ＯｎＰＲＲ７－２基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７－２
４７．１３％无规则卷曲；ＯｎＰＲＲ７—２编码的蛋白主要 ２个基因表达的蛋白均与一种趋化蛋白ＣｈｅＹ有
包含２７．３４％ 螺旋，１７．２９％ｐ片层，４６．８６％无规
则卷曲；其中均是以无规 则卷曲含量最多。用
Ｓｗｉｓｓ．ｍｏｄｅ１分析ＯｎＰＲＲ７．１的三级结构（图５）
和ＯｎＰＲＲ７ ２蛋白的三级结构（图６），结果显示
２５％左右的相似性，相似度并不高。
用ＤＮＡＭＡＮ将ＯｎＰＲＲ７．１和ＯｎＰＲＲ７．２蛋
白的氨基酸序列与其他９个物种的ＰＲＲ７蛋白氨
基酸序列进行同源序列比对，比对结果如图７所
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析 １５７５
及其同源的其他植物的ＰＲＲ调控因子构建系统发
育树（图８）。共同构建系统发育树的其他ＰＲＲ
调控因子分别是：巴旦木ＡＰＲＲ７（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ
ＸＰ ０２０４２３０４９．１）、花生ＡＰＲＲ７（Ａｒａｃｈｉｓ ｉｐａｅｎｓｉｓ
ＸＰ ０ｌ６ｌ８３３２４．１）、苦瓜ＡＰＲＲ７（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ
ｃｈａｒａｎｔｉａ ＸＰ ０２２ １４３９２２．１）、榴莲ＡＰＲＲ７（Ｄｕｒｉｏ
ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ ＸＰ ０２２７４５７４２．１）、 菡萏ＰＲＲ３／７
（ ｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ ＸＰ ０１０２５３４５８．１）、桑树ＰＲＲ
图５预测的ＯｎＰＲＲ７．１蛋白三级结构
Ｆｉｇ．５ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７—１
（Ｍｏｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ ＸＰ ０ｌ０ｌｌ２３１８．１）、番茄ＰＲＲ３／７
（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ＸＰ ００４２３７５３３．１）、葡萄
ＰＲＲ３／７（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｘＰ ０１０６５８ｌ５７．１）、蓖麻
ＰＲＲ３／７（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ＸＰ ０ｌ ５５７８３８０．１）、枣
１３转角
３１－ｔｕｒｎ
ＰＲＲ３／７（Ｚｉｚｉｐｈｕｓｊｕ） ｕｂａ ＸＰ ０ｌ５８７７ｌｌ３．１）、大桉
ＰＲＲ３／７（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ ＸＰ ０ｌ００６７２４３．１）、
可 可 子ＰＲＲ３／７ （Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
ＸＰ ００７００９６６９．２）、铁皮石斛ＰＲＲ７／３（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ
ｃａｔｅｎａｔｕｍ ＸＰ ０２０６９２４４５．１）、小兰屿蝴蝶兰
ＰＲＲ７／３（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅｑｕｅｓｔｒｉｓ ＸＰ
０２０６０—
一
ｑ螺旋
ｃ【．ｈｅｌｉｘ
０ｌ８９．１）、野生稻ＰＲＲ７／３（０１Ｔｚａ ｂｒａｃｈｙａｎｔｈａ
ＸＰ ００６６４９８８４．１）、 玉米ＰＲＲ７／３（Ｚｅａｓ
ＡＣＧ２４２３４．１）、风梨ＰＲＲ３／７（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ
图６预测的ＯｎＰＲＲ７．２蛋白和三级结构
Ｆｉｇ．６ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７—２
ｘＰ ０２０ｌ０８３７８．１）、石刁柏ＰＲＲ７／３（Ａｓｐａｒａｇｕｓ
ｏｆｉｃｉｆｎａｌｉｓ ＸＰ ０２０２７ ｌ４８２．１）、茳芏ＰＲＲ７／３（Ｍｕｓａ
ａｃｕｍｉｎａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｍａｌａｃｃｅｎｓｉｓ ＸＰ ００９３８６５４３．１）、
示。其他９个物种的蛋白分别是：海枣ＰＲＲ３７
（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙ，ｉｆｅｒａ，ＸＰ ００８７８９０２２．１）、菡萏
ＰＲＲ３７（Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃ￣ｅｒａ，ＸＰ ０１０２５３４５８．１）、葡
海 枣ＰＲＲ３／７ （Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ
ＸＰ ００８７８９０２２．１）、油棕ＰＲＲ３／７（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ
萄ＰＲＲ３７（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ，ＸＰ ０１０６５８１５７．１）、油
棕ＰＲＲ３７（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ，ＸＰ ０１０９２０９６１．１）、
ｘＰ ０ｌ０９２０９６１．１）、拟南芥ＰＲＲｓ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ ＡＥＤ９７２７８．１、ＡＥＤ９０５２０．１、ＡＥＣ １ ０７５４．１、
蓖麻ＰＲＲ３７（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ，ＸＰ ０１５５７８３８—
０．１）、凤梨ＰＲＲ３７（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ，ＸＰ ０２０１０８—
３７８．１）、巴旦木ＡＰＲＲ７（Ｐｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａ，ＸＰ ０２０—
ＢＡＢ１３７４３．１、０ＡＯ９０７５７．１）水稻ＰＲＲｓ（Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ｉｎｄｉｃａ ＢＡＤ３８８５９．１、ＢＡＤ３８８５８．１：Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ｊａｐｏｎｉｃａ ＢＡＤ３８８５６．１、ＢＡＤ３８８５５．１）、小立
碗藓（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ ＢＡＪ８３８２９．１、
ＢＡＪ８３８２７．１ 、 ＢＡＪ８３８２６．１ 、
４２３０４９．１）、小兰屿蝴蝶兰ＰＲＲ７３（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅ—
ＢＡＪ８３８２８．１ 、
ｑｕｅｓｔｒｉｓ，ｘＰ ０２０６００１ ８９．１）和铁皮石斛ＰＲＲ７３（Ｄ—
ｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｔｅｎａｔｕｍ，ＸＰ ０２０６９２４４５．１）。比对结
果显示，分析的１０个物种的氨基酸序列均在Ｎ
ＢＡＩ３９９９３．１）、铁皮石斛ＰＲＲ１（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ
ｃａｔｅｎａｔｕｍ ＰＫＵ７６ｌｌ８．１）、深圳拟兰（Ａｐｏｓｔａｓｉａ
ｓｈｅｎｚｈｅｎｉｃａ ＰＫＡ６６２０８．１）和作为外族的巴两安白
僵菌ＰＲＲ１（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ ＰＭＢ６７６６８．１）。
末端有非常保守的ＲＬＤ结构域，ｃ末端有非常保
守的ＣＣＴ结构域。
分析结果表明，ＯｎＰＲＲ７一ｌ和ＯｎＰＲＲ７—２与同为兰
科植物的铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的ＰＲＲ７／３亲
缘关系最近，并且系统发育树的分支表明，双子
叶植物纲和单子叶植物纲的ＰＲＲ蛋白分别分支成
了上下两组。
２．４ ＯｎＰＲＲ７．１和ｏｎＰＲＲ７．２蛋白系统进化
分析
为研究ＯｎＰＲＲ７一ｌ和ＯｎＰＲＲ７—２蛋白的进化关
系，用ＭＥＧＡ ６．０软件将ＯｎＰＲＲ７—１和ＯｎＰＲＲ７．２
ｌ５７６ 热带作物学报 第３９卷
Ａｎａｎａ．ｓ ａｎｔｏｎｉｕｓ．ｔ
＇３６
ＤａｒｔｄＴ’ｏｈｉｕｍ ｅａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ ａ，ｕｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｔｕｓ￣，ｒａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
Ｐｈ８ＩａｅｎｏｎｓＩｓ ｅｏｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎｔｉｓ ｎｅｍｉｃａｔ
１４３
１ ３５
ｌ４２
１３６
Ｉ４２
ｌ４３
ｊ２７
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｒｎｍｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉ ｒａ ｔ
０ｎＰＲＲ７．１ ｔｘｔ
０ｎＰＲＲ７－２ ｔｘｔ
１３８
１４０
ｌ３７
１２６
１２６
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ
Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓ￣ｓ ｔ
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ ｍａｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｔｕｓ ｍ－ａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｍ
Ｐｈａｌａｅｎｏｎｓｉｓ ｅｏｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｅｔｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎｕｓ ｎｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ
Ｔｂｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉ忆ｒａ ｌ
ｏｎＰＲＲ７－１ ｔｘｔ
ＯｎＰＲＲ７－２ ｔｘｔ
Ｃｏｎｓｅｏｓｕｓ
Ａｎａｎａａ ｃｏｍｏｓｔｍ ｔ
２５７
２６８
２５６
２６２
２５７
２６５
２６４
２５０
２８０
２６０
２５９
２４７
２４７
３９３
Ｄｅｎｄｒｏｈｉｕｍ ｃａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ￣ｎａｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｔｕｓ￣ｒａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｈｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
ＰｈａＩａｅｎ０ｎ ｓ ｅ口ｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄｓｃｒｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎｕｓ ｏｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｈｒｏｒｎａ ｃａｃａｏ．
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｔ
ＯｎＰＲＲ７．１ ｔｘｔ
ＯｎＰＲＲ７．２ ｔｘｔ
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ
Ａｎａｎ８ｓ ｃｎｍｎＲ￣ｑｔ
３９４
３９１
３９９
３９８
３９４
３９９
３５８
４２１
４０１
３９３
３５０
３７１
５２９
５１ ５
Ｄｅｎｄｒｏｈｉｕｍ ｃａｔｃｎ
Ｅｌａｅｉｓ ｍｌｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｍｓ ｒｅ＇ａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｈｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
Ｐｈａｌａｅｎ０ｎｓｉｓ ｅｏｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｖｌｉｆ
Ｐｍｎｕｓ ｎｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｒｎｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｈｒｏｒｎａ ｃａｃａｏ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｔ
ＯｎＰＲＲ７．１ ｔｘｔ
ｏｎＰＲＲ７．２ ｔｘｔ
ＣｏｎｓｅｎＳＵＳ
Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ ｔ
５２９
５２５
５３５
５０１
５３７
４９５
５５ｌ
５３８
５３０
４６６
４８７
６７０
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｅａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ ｇｒｕｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｔｕｓ ｒｅ＇ａｎｄ
６３６
６６３
６６ｌ
６７０
Ｎｅｌｕｍｈｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
Ｐｈａｌａｅｎｏｎｓｉｓ ｅｏｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎ￣ｒ￣ｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉ佗ｒａ．ｔ
０ｎＰＲＲ７－１ ｔｘｔ
ｏｎＰＲＲ７－２ ｔｘｔ
Ｃｏｎｓｅｎｓｏｓ
Ａｎａｎ＆ｓ ＣＯｔＴＩＯＳＵＳｔ
６ｌ ３
６７Ｉ
６３１
６８６
６７６
６５０
５８０
６Ｏｌ
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｅａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ ｃ，ｕｉｎｅｅｎｓ｛
Ｅｕｃａｌｖ－ｏｔｕｓ ｔｒｒａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｈｏ ｎｕｅｉ￣
Ｐｈａｌａｅｎ０ｎ Ｒ ｅＯｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｅｔｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎｕｓ ｎｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ．
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａｔ
ＯｎＰＲＲ７．１ ｔｘｔ
ＯｎＰＲＲ７－２ Ｉｘｔ
７９ｌ
７４Ｒ
７７５
７７８
７８７
７３３
７９０
７４６
ｇＯ１
７９２
７６９
６９６
７ｌ７
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ
红线部分是保守的结构域，绿线是ＯｎＰＲＲ７—１和ＯｎＰＲＲ７．２的序列差异区域。
Ｔｈｅ ｒｅｄ ｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ＯｎＰＲＲ７＿１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７·２
图７ 文心兰ＯｎＰＲＲ７—１和ＯｎＰＲＲ７．２与其他物种ＰＲＲ家族蛋白氨基酸序列多重比对
Ｆ｜ｇｌ ７ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７—１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７—２ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＰＲＲ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
２．５ ＯｎＰＲＲ７－１和Ｄ，ｌ艘 ７－２基因表达分析
通过Ｑ．ＰＣＲ可知，在连续的１２Ｌ：１２Ｄ处理
光照前的４ ｈ（凌晨２：００）左右。
在文心兰花发育的８个时期（花苞期Ａ、绽
口期Ｂ、半开放期Ｃ、盛开前期Ｄ、盛开期Ｅ、
衰老初期Ｆ、衰老期Ｇ和脱落干枯期Ｈ）中，
Ｄ ７一 和ＯｎＰＲＲ７－２基因表达情况如图１０所
下的４８ ｈ中ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７—２基因表达变
化情况如图９所示。分析可知，ＯｎＰＲＲ７一，和
０ ＰＲＲ７．２基因在２个连续的周期内呈现节律性
表达，在１２Ｌ：１２Ｄ条件下，２个基因的表达峰值
现在光照后的４ ｈ（上午１０：００），谷值出现在
示。该基因在绽口期（Ｂ）和衰老初期（Ｆ）时期
表达量达到高峰值，而在盛开前期（Ｄ）和脱落
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因 Ｒ７克隆与表达分析 １５７７
∞
图８ ＯｎＰＲＲ７．１和ＯｎＰＲＲ７－２蛋白的系统进化树分析
Ｆｉｇ．８ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７—１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７—２ ａｎｄ ０ｔｈｅｒ ＰＲＲ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｒａ１ ｈｉ曲。 ｐ１
６ ８ １０１２１４１６１８２０２２２４２ ４ ６ ８１０１２１４１６１８２０２２２４２ ４
６ ８１０１２１４１６１８２０２２２４２ ４ ６ ８ １０１２１４１６１８２０２２２４２ ４
时间Ｔｉｍｅ／ｈ
时间Ｔｉｍｅ／ｈ
图９ ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７－２基因的节律性表达分析
Ｆｉｇ．９ Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７＿ 和ＯｎＰＲＲ７＿２ ｉｎ ４８ ｈｏｕｒｓ
热带作物学报 第３９卷
２．５
２．Ｏ
２．Ｏ
１．５
至
莨罂
【＿ｏＡ。一吕 ２ｄｘｕ ｏ 焉一Ｑ
１．Ｏ
＿薹ｉ
§
夏
喜
０．５
０．５
Ｏ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ
花发育阶段
Ｆｌｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ
花发育阶段
Ｆｌｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ
Ａ：花苞期；Ｂ：绽口期；Ｃ：半开放期；Ｄ：盛开前期；Ｅ：盛开期；Ｆ：衰老初期；Ｇ：衰老期；Ｈ：脱落干枯期。
Ａ：Ｔｈｅ ｂｕｄ ｓｔａｇｅ；Ｂ：Ｔｈｅ ｂｕｄ ｂｕｒｓｔ ｓｔａｇｅ；Ｃ：Ｔｈｅ ｈａｌｆ－ｏｐｅｎｅｄ ｓｔａｇｅ；Ｄ：Ｔｈｅ ｐｒｅ—ｂｌｏｏｍｉｎｇ ｓｔａｇｅ；Ｅ：Ｔｈｅ ｂｌｏｏｍｉｎｇ ｓｔａｇｅ；Ｆ：Ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅ
ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ；Ｇ：Ｔｈｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｇｅ；Ｈ：Ｔｈｅ ｗｉｔｈｅｒｅｄ ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｅｄ ｓｔａｇｅ．
图１０ ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７－２文心兰花发育和衰老过程中的表达分析
Ｆｉｇ．１０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７－ 和ＯｎＰＲＲ７—２ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｎｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
莨
干枯期（Ｈ）表达达到低峰值。 物种的同族基因一样具有保守性 Ｊ。
表达分析表明，ＯｎＰＲＲ７．，和ＯｎＰＲＲ７－２基因
３ 讨论
在文心兰花瓣中呈现连续的昼夜循环表达。在
１２Ｌ：１２Ｄ光照黑暗循环处理下，ＯｎＰＲＲ７一 和
ＯｎＰＲＲ７—２基因呈现节律性表达，和之前研究的拟
南芥和菁芜菁ＰＲＲｓ基因的表达模式相一致ｆ３１－３２］。
本研究克隆得到２个文心兰ＰＲＲ７基因：
ＯｎＰＲＲ７一 和ＯｎＰＲＲ７－２基因，这２个ＰＲＲ７基因
成员的核苷酸序列仅有６０ ｂｐ左右差异。序列比
对表明它们与其他物种ＰＲＲ基因氨基酸序列均在
Ｎ端或Ｃ端有非常保守的ＲＬＤ和ＣＣＴ结构域。
文心兰尸 Ｒ７基因存在２个成员的现象和小立碗
拟南芥ＰＲＲ７与ＰＲＲ９和ＰＲＲ５通过对ＣＣＡ１和
ＬＨＹ启动子的阻遏活性而在生物钟反馈环路中
发挥功能【７ Ｊ，ＰＲＲ７本身也通过转录和转录后机制
藓及水稻情况类似。小立碗藓 尺７存在编码不
同的氨基酸序列的两个成员ＰＲＲＴａ和ＰＲＲ７ｂ［ ］，
水稻粳稻和籼稻中也具有序列不同的两基因成员
尺 和 ３７【２７］，但拟南芥中只有一个 尺７
基因，这可能是由于在进化过程中基因含量和序
列发生变化所致。ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７．２基因含
而受到调控 引。有研究表明拟南芥ＰＲＲ７与ＰＲＲ９
和ＰＲＲ５一起通过ＣＯＮＳＴＡＮＳ依赖性途径控制开
花时问【ｊ引。本研究中，ＯｎＰＲＲ７一 和ＯｎＰＲＲ７—２
基因在文心兰花发育和花衰老过程中呈现双峰表
达模式，表达量分别在绽口期（Ｂ）和衰老初期
（Ｆ）达到高峰值，而在两峰之间的盛开前期（Ｄ）
处于低峰。ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７—２基因这种表达
有ＲＬＤ和ＣＣＴ保守结构域的氨基酸序列，这与
其他物种的ＰＲＲｓ家族基因编码的氨基酸序列保
守结构域相一致，但中间序列则差异较大。ＰＲＲｓ
被定义为是包含有２个保守域的蛋白质，这２个
模式，表明它们有可能在花发育的开花和仡衰老
的过程中发挥作用，但仍待进一步证实。
参考文献
【１】Ｄｕｎｌａｐ Ｊ Ｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｄｏｃｋｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，
结构域被１个不太保守的“可变”域分隔ｌ 引。
因此，本研究克隆的２个文心兰基因属于ＰＲＲ基
因家族。发育树的分支表明，双子叶植物纲和单
子叶植物纲的ＰＲＲ蛋白分别形成亲缘关系较远的
两组，而ＯｎＰＲＲ７．１和ＯｎＰＲＲ７ ２与同为兰科植
物的铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的ＰＲＲ７／３亲缘关
系最近。显然文心兰ＰＲＲ基因在进化上也与其他
１９９９，９６（２）：２７１－２９０．
［２］Ｈａｒｍｅｒ Ｓ Ｌ．Ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆＰｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，６Ｏ（１）：３５７—３７７．
［３］ 徐小冬，谢启光．植物生物钟研究的历史同顾与最新进展
［Ｊ］．自然杂志，２０１３，３５（２）：１１８－１２６．
【４】 王晗．生物钟生物学及其研究进展［Ｊ］．生命科学，２０ １ ５，
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析 １５７９
２７（１１１：１ ３１３－１ ３１９．
［５］
Ｂｅｎｄｉｘ Ｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｃ Ｍ，Ｈａｒｍｏｎ Ｆ Ｇ．Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ
ｇｅｎｅｓ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｅｙ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｒｔａｉｔｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ
Ｐｌａｎｔ，２０１５，８（８）：ｌ １３５—１ １５２．
【６］
Ｂｅｃｋｗｉｔｈ Ｅ Ｊ．Ｙａｎｏｖｓｋｙ Ｍ Ｊ．Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａｔ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ
ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｕｇｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１４，２７：３５—４２．
［７］
Ｍａｔｓｕｓｈｉｋａ Ａ，Ｍａｋｉｎｏ Ｓ，Ｋｏｊｉｍａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｗａｖｅｓ
ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＰＲＲ１／ＴＯＣ１ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｓｅｕ—
ｄｏ—ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ
ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，
４１（９）：１ ００２—１ ０１２．
［８１
Ｆａｒｒ６ Ｅ Ｍ，Ｌｉｕ Ｔ．Ｔｈｅ ＰＲＲ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｒｔａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａ—
ｔｏｒｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｉｒｃａｄｉａｎ
ｃｌｏｃｋｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌｎａｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１６（５）：
６２１—６２９．
［９］
Ｍｉｚｕｎｏ Ｔ．Ｔｗｏ—ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｌａｙ ｓｉｇｎａｌ ｒｔａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：ｆｒｏｍ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｉｒｃａｄｉａｎ
ｒｈｙｔｈｍｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，
６９：２ ２６３．２ ２７６．
【１Ｏ】 Ｍｉｚｕｎｏ Ｔ，Ｎａｋａｍｉｃｈｉ Ｎ．Ｐｓｅｕｄｏ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ（ＰＲＲｓ）
ｏｒ ｔｒｕｅ ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｒＴＯＣｓ）［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ—
ｏｌｏｇｙ，２００５，４６：６７７—６８５．
Ｌｉ Ｙ．Ｘｕ Ｍ．ＣＣＴ ｆａｍｉｌｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐｓ：Ａ ｃｕｒｒｅｎｔ
ｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｃｒｏｐ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１７，５（６）：４４９—４５８．
［１２】
Ｋａｃｚｏｒｏｗｓｋｉ Ｋ Ａ， Ｑｕａｉｌ Ｐ Ｈ． Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＰＳＥＵＤＯ—ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲ７ ｉｓ ａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｔｅｒ－
ｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｄｅｅｔｉｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｐｈａｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｃｅｌｌ，２００３，１５（Ｉ １）：
２ ６５４．２ ６６５．
［１３】
Ｓａｌｏｍ ６ Ｐ Ａ，Ｗｅｉｇｅｌ Ｄ，Ｍｃｃｌｕｎｇ Ｃ Ｒ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆｔｈｅ Ａｒａ—
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｏｒｎｉｎｇ ｌｏｏｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ＣＣＡ１，ＬＨＹ，ＰＲＲ７，ａｎｄ
ＰＲＲ９ ｉｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２０１０，
２２（１ ｌ、：３ ６５０－３ ６６１．
【１４】
刘晓荣，王碧青，朱根发．文心兰研究进展【Ｊ］．亚热带植
物科学，２００７，３６（３）：８５—９０．
［１５］
潘英文，林明光，韩松．文心兰切花采后冷藏保鲜技术
研究［Ｊ］．热带作物学报，２０１ １，３２（４）：７５２—７５５．
［１６］
石乐松，孙慧，田晓岩，等．文心兰南茜种花发育进程
与分期［Ｊ】．热带生物学报，２０１６，７（４）：４４０—４４３，４４９．
［１７］
勾 昕，胡薇薇，范亚飞，等．文心兰切花不同开放阶段
花被的生理生化变化［Ｊ］．热带生物学报，２０１６，７（１）：７０—７５．
【１８］
黄浩宇，肖云骁，石乐松，等．文心兰切花花被衰老过程
中酶活性变化研究．热带生物学报，２０１６，７（２）：１９９—２０３
［１９】
Ｙａｎｇ Ｇ Ｈ．Ｌｉｕ Ｊ Ｐ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ １－ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ一
１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ Ｇｏｗｅｒ Ｒａｍ—
ｓｅｙ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１３（４）：
８ ４８０．８ ４８８
［２０】
杨光华，刘进平．文心兰ＡＣＣ氧化酶基因ＯｎＡＣＯ１克隆
与表达分析［Ｊ］．热带作物学报，２０１４，３５（４）：６９３—６９９．
［２１】Ｓｈｉ Ｌ Ｓ，Ｌｉｕ Ｊ Ｐ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｃｌｏｎｉｎｇ ｎａｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎａａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ａｎ １一ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ一１一ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ Ｇｏｗｅｒ Ｒａｍｓｅｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏ—
ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６，４６９：２０３—２０９．
［２２］田晓岩，石乐松，潘英文，等．文心兰ＯｎＡＣ０２基因的克
隆及表达分析［Ｊ】．分子植物育种，２０１５，１３（７）：１ ６０２—１ ６１０．
［２３】田晓岩，杨翠萍，胡进，等．文心兰ＯｎＥＲＳ１全长基因
克隆及表达分析［Ｊ］＿分子植物育种，２０１７，１５（４）：
１ ２６５．１ ２７２．
［２４】徐张红，赵晓刚，何奕昆．拟南芥生物钟分子机制研究进
展［Ｊ］．植物学通报，２００５，２２（３）：３４１—３４９．
［２５］Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｍ，Ｓｔａｉｇｅｒ Ｄ．Ｔｉｍｅ ｔｏ ｌｆｏｗｅｒ：ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｂｅｗｔｅｅｎ
ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉ—
ｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，２０１５，６６（３）：７１９—７３０．
［２６］Ｓａｔｂｈａｉ Ｓ Ｂ．Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｇｅｎｅｓ（ＰＲＲ）ｉｎ ｈｔｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ［Ｄ］．Ｎａｇｏｙａ：
Ｎａｇｏｙａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，２０１ １．
［２７］Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｋａ Ａ，Ａｓｈｉｋａｒｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｒ－
ｃａｄｉａｎ·ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｒｃｅ ｐｓｅｕｄｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ（ＯｓＰＲＲｓ）：
ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｈｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌｆｏｗｅｒｉｎｇ ｔｉｍｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏ—
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，６９（２）：４１０—４１４．
【２８】Ｍａｋｉｎｏ Ｓ，Ｋｉｂａ Ｔ，Ｉｍａｍｕｒａ Ａ，ｅｌ ａ１．Ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｐｓｅｕｄｏ－·ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ：ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ Ｈｉｓ－－ｔｏ－－Ａｓｐ ｐｈｏｓ－－
ｐｈｏｒｅｌａｙ ａｎｄ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｈｙｔｈｍ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，４１：７９１—８０３．
［２９】Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ，Ｔａｇｏ Ｙ，Ｙａｍａｓｈｉｎｏ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｏｖｅｒｖｉｅｗｓ ｏｆ ｃｌｏｃｋ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
ａｎｄ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，４８（１）：
ｌ１０—１２１．
【３０】Ｔａｋａｔａ Ｎ，Ｓａｉｔｏ Ｓ，Ｓａｉｔｏ Ｃ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ ｏｆ
ｈｔｅ ｐｌｎａｔ ｃｌｏｃｋ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｐｒｏｃ—
ｅｓｓｅｓ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏ—ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｕｇｌａｔｏｒｓ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１０：１２６．
【３１】Ｋｉｍ Ｊ Ａ，Ｙａｎｇ Ｔ Ｊ，Ｋｉｍ Ｊ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒ—
ｃａｄｉａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｂｙ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅ·
ｎｏｍｉｃｓ ｗｉｔｈ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＆
Ｃｅｉｌｓ．２００７，２３（２）：１４５—１５３．
【３２］Ｍａｋｉｎｏ Ｓ，Ｋｉｂａ Ｔ，Ｉｍａｍｕｒａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｐｓｅｕｄｏ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ：ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ Ｈｉｓ—ｔｏ—Ａｓｐ ｐｈｏｓ—
ｐｈｏｒｅｌａｙ ａｎｄ ｃｉｒｃａｄｉｎａ ｒｈｙｔｍｈ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．
Ｐｌｎａｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，４１（６）：７９１—８０３．
［３３］Ｎａｋａｍｉｃｈｉ Ｎ，Ｋｉｂａ Ｔ，Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ Ｒ，ｅｔ ａ１．ＰＳＥＵＤＯ—
ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＳ ９，７，ａｎｄ ５ ａｒｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｉｒｃａｄｉｎａ ｃｌｏｃｋ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｃｅｌｌ，
２０１０，２２（３）：５９４－６０５．
［３４］Ｆａｒｒ６ Ｅ Ｍ，Ｋａｙ Ｓ Ａ．ＰＲＲ７ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ
ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉｎａ ｃｌｏｃｋ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ—
ｈａｌ，２００７，５２（３）：５４８—５６０．
2024年9月14日发(作者：应育)
热带作物学报２０１８，３９（８）：１５７０—１５７９
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ
文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析
杨翠萍，胡 进，闫冰玉，巩笑笑，谭玉荣，高 璇，王 丹，张 恒，
刘进平
海南省热带生物资源可持续利用重点实验室／海南大学热带农林学院，海南海口 ５７０２２８
摘 要 利用转录组文库中的 ７基因序列，从文心兰盛开期花瓣中扩增得到文心兰ＰＲＲ７基因的２个成员，
分别命名为ＯｎＰＲＲ７一 （ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＭＧ５４３９９３）和ＯｎＰＲＲ７—２（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＭＧ５４３９９４ ｏ ＯｎＰＲＲ７－
和ＯｎＰＲＲ７—２基因全长分别为２ ０９１ ｂｐ和２ １５４ ｂｐ，分别编码６９６和７１７个氨基酸大小的蛋白质序列。蛋白质二
级结构分析表明，ＯｎＰＲＲ７—１和ＯｎＰＲＲ７．２均为疏水性蛋白。ＢｌａｓｔＸ比对和系统发育分析表明，ＯｎＰＲＲ７－ 和
ＯｎＰＲＲ７—２基因和铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的 基因同源性比较高。实时荧光定量ＰＣＲ分析结果表明，ＯｎＰＲＲ７－，
和ＯｎＰＲＲ７—２基因均呈现昼夜节律性表达格式，并且在正午１２点时表达量达到峰值；在花发育和衰老过程中，
ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７．２基因在花瓣中的表达量均在绽口期和衰老初期达到峰值，表明其有可能在花发育的开花和
花衰老的过程中发挥作用。
关键词文心兰；生物钟；ＰＲＲ７基因；表达分析；开花；花衰老
￥６８２．３１ 文献标识码Ａ 中图分类号
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｉｒｃａｄｉａｎ—·Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ ＰＲＲ ７
ＹＡＮＧ Ｃｕｉｐｉｎｇ，ＨＵ Ｊｉｎ，ＹＡＮ Ｂｉｎｇｙｕ，ＧＯＮＧ Ｘｉａｏｘｉａｏ，ＴＡＮ Ｙｕｒｏｎｇ，ＧＡＯ Ｘｕａｎ，ＷＡＮＧ Ｄａｎ，
ＺＨＡＮＧ Ｈｅｎｇ，ＬＩＵ Ｊｉｎｐｉｎｇ
Ｈａｉｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈａｉｎａｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ ５７０２２８，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｗ０ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ尸Ｒ ７ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ．ＯｎＰ ７—１ ａｎｄ ＯｎＰ ７—２，ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｔａｌｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｆｕ１１．ｏｐｅｎｅｄ ｆｌｏｗｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ Ｐ尼Ｒ ７ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｆｕｌ１一ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ
ＯｎＰ Ｒ７．１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７—２ ｗａｓ ２ ０９１ ｂｐ ａｎｄ ２ １５４ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ．ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ６９６ ａｎｄ ７１７ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．ｒｅ．
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ．ＢＬＡＳＴＸ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｈｙ—
ｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＯｎＰＲＲ７．１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７．２ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ ｏｆ Ｄｅｎ—
ｄｒｏｂｉｕｍ ０历ｃｉｎａｌｅ ａｎｄ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅｑｕｅｓｔｒｉｓ．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ＯｎＰ尺 ７—１ ａｎｄ ＯｎＰ尺Ｒ７—２ ｇｅｎｅｓ ｂｏｔｈ ｈａｄ ａ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ．ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｐｅａｋｅｄ ａｔ １２：００
ｗｉｔｈｉｎ ２４ ｈｏｕｒｓ．Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＯｎＰ足尺７—１ ａｎｄ ＯｎＰ足尺７—２ ｉｎ
ｐｅｔａｌｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｔ ｔｈｅ ｂｕｄ ｂｕｒｓｔ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ
ｌｏｗｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｆｆｌｏｗｅｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ；ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ；ＰＲＲ ７ ｇｅｎｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ；ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ；ｆｌｏｗｅｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
ＤＯＩ １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—２５６１．２０１８．０８．０１５
生物钟（ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ）是生物体内一种内
在计时机制，是生物体对地球光照和温度等环境
收稿日期２０１７ １１ ２１；修回日期２０１８－０４—２６
因子昼夜周期变化长期适应而演化产生的适应机
制 钔。在植物体中，可以使体内生物学过程与体
基金项目 国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３１５６０５７３）；海南省重大科技专项（Ｎｏ．ＺＤＺＸ２０１３０２３ ｏ
作者简介杨翠萍（１９９２一），女，硕士研究生，研究方向：生化与分子生物学。 通信作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ）：刘进 （ＬＩＵ
Ｊｉｎｐｉｎｇ），Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕ３３０５６０２＠１６３．ｃｏｍ。
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析 １５７ｌ
外的昼夜和季节条件变化同步化，从而调控新陈
代谢活动并在最有利的昼夜和季节时问来分配
资源［５］。生物钟对于植物的生长、发育、生殖和
胁迫反应都有调控作用［１－５］。在生物钟系统核心
为一套复杂的、环环相扣的转录和翻译反馈环路
组成。生物钟核心振荡器由３个循环组成：中
心循环、早晨循环、傍晚循环ｌ２ Ｊ。其中ＰＲＲｓ
（ｐｓｅｕｄｏ．ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）为植物转录／翻译
昼夜节律网络中的关键成分，在生物钟系统中
的中央振荡器和生物钟输出过程起着至关重要
的调控作用Ｌ６ Ｊ。
目前拟南芥中发现参与生物钟调控的ＰＲＲｓ
共有５个，分别是ＰＲＲ１／ＴＯＣ１、ＰＲＲ３、ＰＲＲ５、
ＰＲＲ７和ＰＲＲ９ ］。拟南芥中ＰＲＲ家族成员在一
天里表达峰值按照ＰＲＲ９、ＰＲＲ７、ＰＲＲ５、ＰＲＲ３、
ＰＲＲ１的顺序依次出现，间隔２～３ ｈ。其中ＰＲＲ９
出现在黎明，而ＰＲＲ１表达峰值出现在傍晚【７ Ｊ。
这５个成员因为与原核生物的磷酸化和脱磷酸化
双元信号系统的受体ＲＲ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）
有很高的同源性而被命名为ＰＲＲｓ家族。ＰＲＲｓ
基因均具有两个保守的结构域，分别是氨基端
的ＲＬＤ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ．１ｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）结构域和羧基端
ＣＣＴ（Ｃ０ＮＳＴＡＮＳ／Ｃ０ＮＳ１ ＮＳ．ＬＩＫＥ／ＴＯＣ１）结
构域［８－１０］。目前，除在模式植物拟南芥和水稻中
ＰＲＲ基因研究较为充分外，在少数重要作物如玉
米、高粱、大麦、小麦和甜菜等也有少数的研究，
但尚未见到在观赏园艺植物上相关基因研究的报
道 ¨。
对于 ７基因的研究不多，但是先前有研
究表明ＰＲＲ７—８．葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白定位
于细胞核，意味着其可能在调控光敏基因表达中
起作用，并经研究发现ＰＲＲ７可作为光敏色素调
节的基因表达中信号传导的中间体，负责响应于
光的幼苗的消长和生物钟的阶段［１ 。拟南芥的生
物钟是由一系列的互锁反馈循环环组成，ＰＲＲ７
和ＰＲＲ９在早上循环环中起作用；经ｐｒｒ７／ｐｒｒ９双
突变体研究发现，ＰＲＲ７和ＰＲＲ９在调节ＣＣＡ１
和ＬＨＹ响应环境温度的活动中发挥作用 引。
文心兰（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ）属于兰科文心兰属植物，
又名舞女兰、金蝶兰等，是世界上重要的切花品种，
具有极其重要的观赏价值和经济价值［１４－１５］ｏ栽培的
文心兰切花品种以黄色花南茜种（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ Ｇｏｗｅｒ
Ｒａｍｓｅｙ）及其变异种为主 引。海南大学热带农
林学院刘进平课题组研究表明，文心兰花发育可
根据其形态特征明确分期，是一种很好的花发
育和衰老的研究系统¨ ］。此前刘进平课题组
已从文心兰中克隆和鉴定出一系列跟花发育和
衰老相关的基因［１９－２３］。植物能精确地控制其开
花时间，以确保其能成功地进行繁殖。开花时
间的季节控制的一个重要因素是光周期，而日
照时长由体内生物钟所测量的。因此，生物钟
对光周期反应和植物开花具有重要的调控作用
［２４－２５］
。
我们最近的转录组学研究表明，生物钟
基因ＰＲＲ７基因可能还参与了花瓣衰老的启动
调控。
本研究利用转录组分析所获得的序列，克隆
到生物钟相关基因 ７，并利用生物信息学方法
分析了该基因推定的蛋白质的结构，利用序列比
对构建了系统进化树，并研究了 ７基因昼夜
节律性表达及在文心兰切花发育和衰老过程中在
花瓣中的基因表达格式。
１材料与方法
１．１材料
本研究所用材料为文心兰南茜种‘黄金３
代’（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ Ｇｏｗｅｒ Ｒａｍｓｅｙ‘Ｇｏｌｄ ３’）鲜切花。
购白海南出入境检验检疫局热带植物隔离检疫
中心。
ｌ－２ 方法
１．２．１ 文心兰花瓣总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ第一
链的合成 取２～３个文心兰花瓣于预冷的研钵
中，在液氮环境下充分研磨成粉末状，之后用通
用植物总ＲＮＡ提取试剂盒（离心柱型，购自北京
百泰克生物技术有限公司）提取ＲＮＡ。用１％琼
脂糖凝胶电泳鉴定ＲＮＡ完整性，并且测量ＲＮＡ
的浓度。获得高质量ＲＮＡ后，按照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ
ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ试剂盒（购自
ＴａＫａＲａ公司）说明进行反转录反应，合成ｅＤＮＡ
第一链。
１．２．２ 文心兰ＰＲＲ７基因的克隆利用转录组测
序得到的差异表达基因ＰＲＲ７序列片段，用ＮＣＢＩ
热带作物学报 第３９卷
的Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）预测蛋白质的三级结构，使用
ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）进行保守结构域分
ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／
析，然后用ＮＣＢＩ的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ＴＭＨＭＭ／）进行跨膜预测，使用ＤＮＡＭＡＮ软件
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｒｆｉｆｎｄｅｒ／）分析序列的开放阅读框， 进行氨基酸序列的多重比对，并且使用ＭＥＧＡ ６．０
并根据ＯＲＦ两端设计上下游引物ＰＲＲ７．Ｆ和 软件构建ＮＪ系统进化树。
ＰＲＲ７ Ｒ（表１），克隆ＰＲＲ７基因的ＯＲＦ序列。
１．２．４文心兰ＰＲＲ７基因的节律性表达分析以及
ＰＣＲ反应体系如下：ＴａＫａＲａ ＬＡＴａｑ ０．５ ｐＬ，１０￣ 在花发育过程中的表达分析文心兰ＰＲＲ７基因
ＬＡ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ Ｌ，ｄＮＴＰｓ ８ Ｌ，ｅＤＮＡ ｌ Ｌ，
的节律性表达分析取样方法为：首先将购买的１ ００
上下游引物各０．５ ｕＬ，灭菌蒸馏水３４．５ ｋｔＬ。ＰＣＲ
枝文心兰鲜切花在１２ ｈ光照和１２ ｈ黑暗（１２Ｌ：
程序如下：９４℃预变性３ ｍｉｎ；９４℃变性３０ Ｓ， １２Ｄ），预处理２～３ ｄ，然后每隔２ ｈ采样，总共
５５℃退火３０ Ｓ，７２℃延伸２ ｍｉｎ １５ Ｓ，３０个循环； 采样时间４８ ｈ；文心兰ＰＲＲ７基因在花发育过程
７２℃延伸１０ ｍｉｎ；４℃保存。将ＰＣＲ产物进行
中的表达分析取样方法为早上８点采集分别处于
１％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用ＯＭＥＧＡ Ｇｅｌ 花苞期、绽口期、半开放期、盛开前期、盛开期、
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（购自ＴａＫａＲａ公司）进行胶回收，
衰老初期、衰老期和脱落干枯期８个阶段的文心
回收目的片段，之后连接到ｐＭＤ．１９Ｔ载体上，转 兰花瓣。采用１．２．１节中的方法进行花瓣总ＲＮＡ
化大肠杆菌感受态细胞ＤＨ５ａ，过夜培养，进行 的提取和反转录反应。用Ａｃｔｉｎ检测基因对反转
菌落ＰＣＲ鉴定，获得阳性克隆后送上海英潍捷基 录得到的ｅＤＮＡ进行质量的检测，Ａｃｔｉｎ基因作
生物公司进行测序。 为内参。所用引物序列见表１。Ｑ．ＰＣＲ表达分析
１．２．３ ＰＲＲ７—１和ＰＲＲ７—２基因生物信息学分析 的反应体系如下：ＳＹＢＲ Ｐｒｉｍｉｘ ＴａｑⅢ１０“Ｌ，
利用ＮＣＢＩ的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ进行ＯＲＦ和编码氨基酸
ｅＤＮＡ模板２ Ｌ，ｄｄＨ２０ ６．６ Ｌ，Ｄｙｅｌ１ ０．４ ｐＬ，
序列预测；用ＥｘＰＡＳｙ在线分析软件
上下游引物各０．５“Ｌ。每个不同来源的模板都进
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｖｇ／ｉｎｄｅｘ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）进行蛋
行３次生物学重复实验。ＰＣＲ程序如下：９４℃
白质理化性质的预测，包括蛋白质等电点和相对
预变性３ ｍｉｎ；９４℃１５ Ｓ，６０℃１５ Ｓ，７２℃２０ Ｓ，
分子质量和蛋白质二级结构预测（ＳＯＰＭＡ＆
４０个循环。最后采用２以Ａｃｔ法进行目的基因的表
ＣＯＩＬＳ），用Ｓｗｉｓｓ．ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅ１．
达量分析。
表１本研究所用引物序列
Ｔａｂ．１ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析
１．２．５ 文心兰ＰＲＲ７一，和ＰＲＲ７—２基因差异验证
泳道４为以ＯｎＰＲＲ７—２为模板，以ＯｎＰＲＲ７一，一Ｆ．Ｑ
和ＯｎＰＲＲ７一Ｒ—Ｑ为引物的扩增产物，产物大小为
ｌ ｌ ８ ｂｐ。结果表明ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７—２相似性
考虑到两个基因仅存在６０ ｂｐ左右碱基的明显差
异，所以Ｑ ＰＣＲ对这两个基因进行区分验证时采
用相同的下游引物
上游引物
尺７一Ｒ．Ｑ，而上游引物
很高但是也存在差异，说明是２个不同的序列。
ＰＲＲ７一，一Ｆ．Ｑ是在差异序列之前区域设计的引物，
尺７—２．Ｆ—Ｑ则是在差异序列区域设计
尺７一Ｒ．Ｑ，及
１Ｏ０ｂｐ
的引物；以 ＪＲ７一，和Ｐ尺尺７—２为模板，以Ｑ．ＰＣＲ
设计的引物朋尺７一，．Ｆ．Ｑ和
ＰＲＲ７—２一Ｆ—Ｑ和 ７一Ｒ—Ｑ为引物分别进行ＰＣＲ
扩增反应，观察扩增产物的异同。
Ｍ：ｌ００ ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｉ、２：ＯｎＰＲＲ７—１基因扩增产物；
３、４：ＯｎＰＲＲ７—２基因扩增产物。
２结果与分析
２．１ 文心兰 ７基因ｅＤＮＡ的克隆
以文心兰花盛开前期的花瓣ＲＮＡ反转录产
生的ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增得到两条２ ０００ ｂｐ
Ｍ：ｌ００ ｂＤ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１，２：ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ＯｎＰＲＲ７－，ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ；３．４：ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ＯｎＰＲＲ ７－２ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ．
图２ ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７－２基因差异序列验证
Ｆｉｇ．２ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７．１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７－２
左右的条带（图１），分别命名为ＯｎＰＲＲ７一Ｊ，
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＭＧ５４３９９３）和ＯｎＰＲＲ７—２
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＭＧ５４３９９４）。
Ｍ １ ２
２．３ 文心兰ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７－２基因的生
物信息学分析
测序表明ＯｎＰＲＲ７一Ｊ和ＯｎＰＲＲ７－２存在很小
的差异，其中ＯｎＰＲＲ７—２比ＯｎＰＲＲ７一 多６０ ｂｐ左
右的核苷酸序列。理化性质分析表明，ＯｎＰＲＲ７一
编码的蛋白分子式为Ｃ３２４６Ｈ５１９０Ｎ１０１０Ｏ１０６４Ｓ２８，分
２ ０００ｂｐ—
子量７６ ２８６．７２，等电点是７．９２，经预测该蛋白是
一
１ ０００ ｂｐ—
种不稳定蛋白。在氨基酸组成上是负电荷残基
（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）总数为８０个，正电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）
Ｍ：１ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ：１：０ｎＰＲＲ７－，；２：ＯｎＰＲＲ７－２。
总数为８２个。ＯｎＰＲＲ７一ｌ蛋白是一种亲水性蛋白，
经跨膜结构域预测可知，ＯｎＰＲＲ７—１蛋白没有明
显的跨膜结构域，因此它可能不是膜蛋白。
ＯｎＰＲＲ７－２ 编码的蛋白分子式为
图１文心兰ＰＲＲ７基因的克隆
Ｆｉｇ．１ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ＰＲＲ７ ｇｅｎｅｓ
２．２ 文心兰ＯｎＰＲＲ ７＿Ｊ和Ｏｎ
验证
７－２差异序列
Ｃ３３３８Ｈ５３４１Ｎ１０３９Ｏ１０９８Ｓ２７，分子量为７８ ４６２．０５，等
电点是８．１３，经预测该蛋白也是一种不稳定的蛋
白。在氨基酸组成上，负电荷残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）
总数为８１个，正电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）总数为８４
ＯｎＰＲＲ７—２序列中间部分有６０ ｂｐ左有的序列
与ＯｎＰＲＲ７一，序列差异比较大，因此使用设计的
Ｑ—ＰＣＲ引物ＯｎＰＲＲ７一Ｊ—Ｆ—Ｏ与ＯｎＰＲＲ７一Ｒ．Ｑ，及
ＯｎＰＲＲ７－２一Ｆ—Ｑ与ＯｎＰＲＲ７一Ｒ．Ｑ对２个基因进行
个，ＯｎＰＲＲ７．２同样也是一种疏水性蛋白。经跨
膜结构域预测，该蛋白同样没有明显的跨膜结构，
因此也不是膜蛋白。测序结果显示，ＯｎＰＲＲ７．，
和ＯｎＰＲＲ７—２的ｃＤＮＡ片段分别为２ ０９ｌ ｂｐ和２
ｌ５４ ｂｐ。以ＮＣＢＩ上的ＯＲＦ开放阅读框在线分析
可知，ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７—２分别编码６９６个氨
基酸（图３）和７１７个氨基酸（图４）。
验证．其中ＯｎＰＲＲ７—２．Ｆ—Ｑ引物是根据差异序列设
计的引物，扩增结果如图２所示。图２中泳道１
为以ＯｎＰＲＲ７ １为模板，以ＯｎＰＲＲ７－２．Ｆ—Ｑ和
ＯｎＰＲＲ７一Ｒ—Ｑ为引物的扩增结果；泳道２为以
Ｄ，２ 尺７一，为模板，以ＯｎＰＲＲ７一』．Ｆ—Ｑ和ＯｎＰＲ ７一
Ｒ—Ｑ为引物的扩增产物，产物大小７６ｂｐ；泳道３
为以ＯｎＰＲＲ７－２为模板，以ＯｎＰＲＲ７—２．Ｆ和
ＯｎＰＲＲ７一Ｒ为引物的扩增产物，产物大小８９ ｂｐ；
经二级结构预测可知，ＯｎＰＲＲ７一，编码的蛋白
二级结构主要包含２８．３０％ｃ【螺旋，１６．９５％Ｄ片层，
ｌ５７４ 热带作物学报 第３９卷
ｌ Ａ
雁 Ｇ Ｇ Ｔ Ｈ Ｒ Ｋ Ｒ
丌＾＾Ｔ 。Ａ。 “ Ａ Ｅ Ⅱ Ｋ Ｅ Ｖ ＲＡＡＧＧ ＮＡＡＴ ＧＧＧＧＴ ＬＴＡ ＤＧＡＴ ＥＧＡＡ ＤＧＡＴ ＥＧＡ ＤＡＯＡＴ ＥＧＡＧ ＳＴＣＡＡ ＲＧＧ ⅢＡＴ ＮＧＡＡＴ ＧＧＧＴ ＶＧ１１ Ｓ１ＣＣＡ ■ＤＴＧＧＡＴ ＬＴｒ＾Ａ ＮＡ ＥＴＧＡＡ
ＣＣ亿Ｔ
ＴＴ
Ｐｖｖ
１３６ Ｇｒｒｃ＾ＴＧＴ
Ｖ Ｈ Ｖ
Ｖ Ｅ ＾ Ａ 直 Ｔ Ｑ Ｉ Ｐ Ｉ Ｌ Ｅ Ｋ Ｌ 盛 Ｑ Ｑ Ｓ
＾ＴＴＧＧＴＧＧＡＧ从Ｔ
Ｆ Ｌ Ｐ Ｌ Ｒ Ｓ Ｌ Ｋ Ｖ Ｌ Ｌ Ｖ Ｅ Ｎ
２７１ Ｇ＾ＴＧ＾
Ｄ Ｄ
Ｓ Ｔ Ｒ口
ＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＴＴ＾ＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡ
Ｖ Ｖ Ｓ Ａ Ｌ Ｌ Ｒ Ｎ Ｃ Ｃ Ｙ Ｅ Ｖ Ｔ Ａ Ａ Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ Ｅ Ａ Ｒ
｛订Ｔ＾ＣＱＡＧ。ＡＤ ：盯
ｓＮ
ＡＨｎ ∞ 。 ＾Ｇ订 。ＡＣＴＴ。ＡＥ。
。ＴｓＣＴＡＫＡ。
Ｑ Ｇ Ｅ Ｋ
Ｔ直Ｃ＾ＡＧＧＣＧ＾＾＾＾＾
∞。； ＴＴ ｊｃ。 。 订 “ 亿
５４１
盯 。 吼ＴＧ 。ｃＡ
Ｋ 丁
ＴＴ￣Ｃ
Ｃ Ｋ Ｔ
ＩＰ
ＣＡ
ＴＧ ＴＧＴＣＡＴＣ
ｍＩｓ
Ａｗ 丌 ；。 ｎＴＩＡＧｖＴ ＴＴＦＴ ＡＫ
ＡＡＧＣＣＡＡ
＾ Ｖ Ｄ Ｆ Ｌ Ｖ Ｘ Ｐ Ｉ Ｒ Ｋ Ｎ Ｅ Ｌ
ＡＧ ＡＴ ＧＣ。Ａ∞ＨＡｗｖＴ ＴＧｗＧ ｎ
Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｅ Ｓ Ｇ
Ｉ
１‘ＧＧＧ＾ＧＴＧ＾Ｔ直Ａ
盯。 Ａ＝Ｇ 。
ＴＴ
。ＧＡＥＧ。ＡＤ ＡＡＮ ＧＧＧｎＧｓＣ
Ｉ Ｇ Ｌ Ｓ Ａ Ｒ Ｄ Ｇ Ｓ Ｄ Ｎ Ｇ Ｓ Ｇ Ｔ Ｑ Ｓ Ｓ
Ｔ Ｃ ＾ ０ Ａ
ＴＣＧＡＴＧＴＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＣＴＴＧ＾
Ｉ Ｄ Ｖ Ｖ Ｈ Ｈ Ｔ Ｋ Ｆ Ｎ Ⅱ Ｌ Ｄ
Ｅ Ｐ Ｓ
■Ｔ Ｋ Ｒ Ａ Ｆ Ｅ
。ｎ
９４ｅ
。 ｃ３ 她：盯８ 盯 ２ 。８＾ 。ｉ Ｃ Ａ
Ｘ Ｅ ０ Ｋ Ｋ Ｉ
ｃＡＴＣＣ Ｔ 。 ＡＧｃ Ｆ Ｃ Ｓ Ｋ Ｋ Ｌ Ｌ 产
： ＾Ｔｃ ：。 ＣＡ。ＧＧＡＤ。
ＴＣＡＡＣＴＣ
珂 Ｓ Ｐ Ｇ Ｔ Ｅ Ｋ Ｌ Ｓ Ｅ Ｋ Ｐ Ｐ Ｋ Ｎ
＾Ｒ Ａ Ｓ Ｄ Ｑ Ｌ
ＡＡＡＧＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡ Ｔ＾＾Ｔ００＾ＴＧＴＧＴＴＧＡＧＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＴ
Ｇ Ｈ Ｎ Ｓ Ｉ Ｈ Ｔ
１２１ｅ
Ｓ
１３５１
辩Ｑ Ｑ Ｓ Ｖ Ｌ Ｇ Ｄ Ａ Ｓ Ｋ Ｄ Ｆ Ｌ Ｋ Ｉ Ｓ Ｅ Ｓ Ｋ Ｄ Ｎ Ｇ Ｃ Ｖ Ｅ Ｌ Ｐ Ｓ Ｌ Ｅ Ｌ Ｓ Ｌ Ｋ Ｒ Ｌ Ｒ
ＴＧ１’０ＣＴ
＾ Ｓ Ｉ Ｐ Ｐ Ｈ Ｅ Ｅ Ｒ Ｎ Ｖ Ｌ Ｋ Ｈ Ｓ Ｎ Ｌ
Ｔ； ｉ盯ＹＡ ＣＰＣＴＧＡＣ订 ： Ａ Ｓ Ｖ Ｑ Ａ Ｐ Ｔ Ｇ珏ＧＴＧＧ＾ ＧＧＧＡ＾ Ｎ＾Ｃ ＳＴｃＴ＾ ＴＣＡ ＬｃＴＣ ＥＧ＾Ａ＾ ＴＣＴ
Ｔ从ＡＴＣＣＡＧＴＣ直
＾Ｔ
ＴＣＡＧＣｅ兀＿ｃＣＡＣ
Ｓ Ｓ Ｅ
ｌ幸Ｂ６ ＣＧ
＾Ｔ Ｐ Ｑ瑶 Ｑ Ｇ Ｓ Ｎ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｓ Ｎ Ｎ Ｉ Ｄ Ｋ Ｇ Ｓ Ｔ Ｎ Ｉ Ｎ Ｐ Ｖ Ｈ Ｋ Ｐ Ｃ Ｖ
Ｙ Ｘ Ｄ Ｖ Ｓ Ｔ Ｓ ＾ Ｆ Ｈ
ＴＣＧ＾１ｌＧ直 ＴＣＡＣＡＧＡＡＡ且Ａ ＴＣ＾ＴＣ＾ＴＴＡＴ
Ｒ Ｖ Ｑ Ｓ Ｒ Ｓ Ｓ Ｄ Ｉ ｑ Ｐ Ｖ Ｖ Ｑ Ｅ Ｔ
Ｉ Ｄ Ｄ
Ｖ Ａ Ｖ Ａ Ｐ Ａ Ｉ Ｅ Ｏ Ｌ Ｒ Ｇ Ｓ ０ Ｋ Ｎ
Ｖ Ｑ Ｖ Ｑ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｙ
。 ＴＣＡＡ ＣＡＣＣＡＣＣＡ ＴＣＣ
ＨＨＨＩ
Ｈ
Ｈ Ｙ
Ａ Ｇｉ盯 ２ 。 ｃ＾。 Ｇ＾Ｔｃ８∞
Ｇ Ｃ Ｓ Ｖ Ｅ Ｎ Ｌ Ｋ Ｐ Ｎ Ａ Ａ Ｙ Ｈ Ｎ Ｓ Ｓ Ｎ Ｖ
ＴＴＧ＾ＡＣ＾Ａ＾ＴＴＴ
Ａ
ＡＡＴＧＧ
ＴＧ
ＧＣＡＴ
ＣＴＡＴＡＧＣＴＴ＾＾ＡＴＧＧ＾
ＮＧＧＩ
Ｙ
ｓ
Ｌ
Ｎ
Ｇ
１７５６ ＡＧ
ｓ Ｈ
虬
Ａ ｃ： ＡｓＧｗＤＡ ∞＾Ｇ
ＴＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡ
ＴＧＧＧ
ＴＴＧＣ＾
Ｇ Ｇ Ｓ Ｓ Ａ Ｉ Ｎ Ｈ 再 Ｇ Ｇ Ｔ Ｎ 曩 Ｅ Ｇ Ｄ ＾ Ｉ ＾ Ｖ Ａ Ｅ Ｋ
Ｉ Ｇ
Ｆ Ｇ Ｇ Ｇ Ｎ Ｇ
Ａ
Ａ
ＣＣＴＡＴＣ
Ａ Ａｎ
ＮＥ
Ａ
Ｙｏ
Ｎ
Ｆ Ｌ Ｑ Ｒ Ｅ Ａ Ａ
Ｌ Ｎ Ｋ Ｆ Ｒ Ｌ Ｋ Ｒ Ｋ Ｅ Ｒ Ｈ Ｆ Ｇ Ｋ Ｋ Ｖ Ｒ
Ｙ
Ｏ Ｓ Ｒ Ｋ Ｒ
： Ａｃ
２０２６
Ｐ Ｒ Ｖ Ｒ Ｇ ０
；ｃＧ 。 ｛ ∞ＨＡ ＮＡ％ＥＡＧ ＡＮ
Ｏ
矗＾
Ｅ Ｅ Ｎ Ｓ
图３ ＯｎＰＲＲ７－１基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７一
ｌ＾
Ｈ Ｇ Ｇ Ｔ Ｈ Ｒ Ｋ Ｒ
。ＴＧ。 甲 ： “
Ｅ Ｈ
“ 。Ａ
ＡＴＧＧ
ＧＴＴＡＧＡＴＧ
Ｋ Ｅ Ｖ
Ｈ
ＧＬ
Ｄ
Ｅ
Ａ Ｇ＾ 从ｃ Ｅ Ｓ Ｒ Ⅲ 翦
Ｇ
∞
Ｒ
ＧＧ
ＴＧＴＴＴＣ
ｖ
ｓ
。。
Ａ 。Ａ
ＮＥ
ｌ３６ ＧＴＴＣ＾ ｒｎ：ＣＴ＾
ＴＴ
ＴＧＧＡＧＡＡＴ
Ｖ 丑 Ｖ Ｖ Ｅ ＾ ＾ ＾ Ｖ Ｔ ０
Ｉ Ｐ
Ｉ Ｌ Ｅ Ｋ Ｌ ｑ ｑ Ｑ Ｓ
Ｌ ＾ Ｐ Ｖ Ｖ Ｒ ■ Ｅ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ Ｌ Ｒ Ｓ Ｌ Ｋ Ｖ Ｌ Ｌ Ｖ Ｅ Ｎ
２７ｌ ＧＡＴＧＡ 竹
Ｄ Ｄ Ｓ Ｔ Ｒ Ｑ Ｖ Ｖ Ｓ Ａ Ｌ Ｌ Ｒ Ｎ
４０６
ＧＣｔ
ＡＴＧ
ＡＡＧＴ
Ｔ
ｃＹＥｖ
Ｔ Ａ 直 Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ Ｅ ＾
Ｇ直
盯ＣＧ Ａ Ａ
ｓＮＨ
ｊ∞ＡＴｃ ｖＴ” “ＴＣＴ。ＡＥ。
Ｔ＾Ｃ＾＾ＧＧＣＧＡ＾＾＾＾
Ｏ Ｇ Ｅ Ｋ
ＴＧＣＡＡＧ＾Ｔ
ＣＡ
ＴＧＡＧ
ＣＣ
ＡＴ直
ＡＡ＾ＣＴＴ
ｃ
Ｋ
Ｉ蕞ｓＨＫＴ
ＡＧＡＡ
Ｈ
。ＣＡＧ。
Ａ Ｔ
。
Ｈｖ
－
ＴＣＣ
ＴＧ
ＴＧ＾ＴＴ＾ＴＧ
ＴＧＴＣ
ＡＴＣＣＡＡＴＣＡＴＴＣ
ＰｖＩ
Ｈ
孤
ｓ
ｓ
ＮＤ
ｓ
Ｃ＾：Ｇ Ｔ＾ ｃＴｖ ＴＴＦ７ ＡＫ＾Ｔ ｃ 。ＴｓＣＴ ＫＡＧ Ｔ
５４１
Ｅ Ｌ Ｋ
ｇａｇ 时ｇ。 Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｃ Ｓ Ｇ Ｓ Ｅ Ｓ Ｇ
Ｉ
ｅ７６ ＡＴＧＡＴＧ
Ａ ＡＧＧ
ＮＤＥＥ
Ｄ
ＡＣ ： 兀Ｇ ：“； ：“ 。ＡＤＴＧＧＧ。ＡｓＧ ＤＡ ＮＡ
Ｇ Ｓ Ｇ Ｔ Ｏ Ｓ Ｓ ’ 丁 Ｋ Ｒ ＾ Ｆ Ｅ
ＴＧＡＡ
Ｓ Ｘ Ｋ Ｌ Ｌ Ｐ Ｈ Ｎ Ｐ Ｇ Ｌ Ｄ
ｃＴ。 ２。
９４６
“ 。 。
＾Ｔ。＾Ｔ
■
Ａ兀 ：
。：ｃ＾ｃ
ＡＨＴ。ＡＤ ＾ｃ耵 。ＡＱ ＾ＣＣ 他 ＴＣＰＣ ＫＡ ＰＣＴ。ＥＡＡＧ
Ｆ Ｃ
ｎ
Ｋ
ＴＴＣＣＡＴＣＡ＾Ｃ＾Ｃ＾＾ＡＴＣＡＡＣＡＡ
Ｋ Ｅ Ｏ Ｋ Ｋ
１０８１ ＧＣＡＧＣＴＣＡＴｃＡＴ
＾＾
Ｈ
Ｈ
Ｔ Ｋ Ｆ Ｎ
１２拍
ＴＣＧ＾Ｔ
Ｓ Ｔ Ｋ Ｌ Ｔ Ｇ Ｐ Ｇ Ｔ Ｅ Ｋ Ｌ Ｓ Ｅ Ｋ Ｐ Ｐ Ｋ Ｎ
Ｉ Ｄ
Ｌ Ｄ Ｅ Ｐ Ｓ Ａ Ｒ Ａ Ｓ Ｄ Ｑ Ｌ Ｇ Ｎ Ｎ Ｓ Ｉ Ｎ Ｔ Ｎ Ｑ ｑ Ｓ Ｖ Ｌ Ｃ Ｄ＾ Ｓ
＾Ｔ 呵“ＫＡＡＡＴＩＣＴｓＣ。
ＴＴＣＴＣ＾ＡＧＧＴＡＴ
Ｔ０Ｇ＾Ｃ＾Ｔ＾ＣＧＴＴＣＧ
ｃ Ａ ｃＡ
Ａ＾ＧＡ
Ｔ＾ＡＴＧＧ
＾ＴＧＴＧＴＴＧＡＧＴＴ
ＡＣ
Ｃ＾ＴＣ
ＴＣＴ
ＴＧ
Ｋ
Ｄ
Ｎ
Ｇｃｖ
ＥＬＰｓＬＥ
。
ＡＡＣ：
Ｓ Ｌ
ＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡ
Ｋ Ｒ Ｌ Ｒ
ＴＧＴＧＣＴ
Ｓ ＾ Ｓ Ｉ Ｐ Ｐ Ｈ Ｅ Ｅ Ｒ Ｎ Ｖ Ｌ
瑶 Ｈ Ｓ Ｎ Ｌ Ｓ ＾ Ｆ Ｓ Ｒ Ｙ
”
＾ＣＡＣＴＣＧ＾＾ＡＣＴ
Ａ Ｓ Ｖ 口 ＾ Ｐ Ｔ Ｇ Ｈ Ｇ Ｇ Ｎ Ｓ Ｔ Ｌ Ｅ Ｔ Ｓ Ｓ Ｅ Ａ Ｔ Ｐ Ｑ Ｎ Ｑ Ｇ Ｓ Ｎ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｓ对Ｎ
Ｉ Ｄ Ｉ Ｇ Ｓ
。＾Ｔ＾
。
１７５ｅ
Ｐ Ｖ Ｔ Ｘ Ｐ ０ Ｖ
Ａ ＡＡ
＾Ｔ 。＾ｃ ｊ Ｃ
Ｓ ＾Ｆ Ｈ Ｒ Ｖ Ｑ Ｓ Ｒ Ｓ Ｓ Ｄ Ｉ Ｑ Ｐ Ｖ Ｖ Ｑ Ｅ Ｔ
Ｉ
ＴｅＧ＾ＴＧ＾
Ｄ Ｄ
Ｖ ＾ Ｖ ＾ Ｐ
ＴＣ。
Ａ ＡＧ
ＴＧ
Ｉ
Ｅｏ
Ｌ
ＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＴＣＣＡＴ００ＣＴＣＡＡ＾ＴＣＣＣＣＡＧＴｃ。Ｇ＾ＴＣ＾ＧＧＡ
ＫＮ
Ｖ ｑ Ｖ Ｑ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｙ Ｈ Ｈ Ｙ Ｈ Ｈ Ｈ Ｉ Ｈ Ａ Ｓ Ｈ Ｐ Ｑ Ｓ Ｄ Ｑ Ｄ Ｇ Ｃ Ｓ Ｖ Ｅ 辩Ｌ
Ｋ Ｐ Ｎ Ａ Ａ Ｙ Ｈ Ｎ Ｓ Ｓ玎 Ｖ
： ： ＴＩＣＴＡＹ ：“ＮＡ “ＧｓＴ ＡＮＴ ＣｓＡＧ 。ＡｓＧ ＮＡＴＣＨＡＴＧＧＧ“ ＴＧ＾ ＧＣＡ。“ＡＮ
Ｇ
； 警 ｗ
ＴＴ
ＴＴＡ
ＡＴ矗
ＡＴＡＡＴＧ
Ｇ Ｓ Ｓ ＾ ＩＨ
Ｎ
Ｎ
Ｇ
Ｇ＾Ｇ：Ｔ
１８９１ ＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＣＣＴＡ
Ｔ Ｈ 麻 Ｅ Ｃ Ｄ ＾ Ⅱ Ｖ Ｖ Ａ Ｅ Ｋ Ｓ Ｇ
２０２６
ＡＨ亿ＥＡ ＧＣ＾ＴＴＹＡ ＣＡ。。ＡＡ月Ｔ
∞Ａ
。
１＿ｒＧ＾＾Ｃ＾ＡＡ
Ｆ Ｌ ０ Ｒ Ｅ ＾ ＾ Ｌ Ｎ Ｋ Ｆ Ｒ Ｌ Ｋ Ｒ
Ｋ Ｅ Ｒ Ｎ Ｆ Ｃ Ｋ Ｋ Ｖ Ｒ Ｙ Ｑ Ｓ Ｒ Ｋ Ｒ
Ｌ ＾ Ｅ ０ Ｒ Ｐ Ｒ
ＴＣＣＡ。Ａ
ＡＴＧＡ ＡＡ＾
Ｉ
Ｈ
Ｎ
Ｅ
Ｎ
０ Ｅ Ｅ Ｎ Ｓ
图４ ＯｎＰＲＲ７－２基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７－２
４７．１３％无规则卷曲；ＯｎＰＲＲ７—２编码的蛋白主要 ２个基因表达的蛋白均与一种趋化蛋白ＣｈｅＹ有
包含２７．３４％ 螺旋，１７．２９％ｐ片层，４６．８６％无规
则卷曲；其中均是以无规 则卷曲含量最多。用
Ｓｗｉｓｓ．ｍｏｄｅ１分析ＯｎＰＲＲ７．１的三级结构（图５）
和ＯｎＰＲＲ７ ２蛋白的三级结构（图６），结果显示
２５％左右的相似性，相似度并不高。
用ＤＮＡＭＡＮ将ＯｎＰＲＲ７．１和ＯｎＰＲＲ７．２蛋
白的氨基酸序列与其他９个物种的ＰＲＲ７蛋白氨
基酸序列进行同源序列比对，比对结果如图７所
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析 １５７５
及其同源的其他植物的ＰＲＲ调控因子构建系统发
育树（图８）。共同构建系统发育树的其他ＰＲＲ
调控因子分别是：巴旦木ＡＰＲＲ７（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ
ＸＰ ０２０４２３０４９．１）、花生ＡＰＲＲ７（Ａｒａｃｈｉｓ ｉｐａｅｎｓｉｓ
ＸＰ ０ｌ６ｌ８３３２４．１）、苦瓜ＡＰＲＲ７（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ
ｃｈａｒａｎｔｉａ ＸＰ ０２２ １４３９２２．１）、榴莲ＡＰＲＲ７（Ｄｕｒｉｏ
ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ ＸＰ ０２２７４５７４２．１）、 菡萏ＰＲＲ３／７
（ ｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ ＸＰ ０１０２５３４５８．１）、桑树ＰＲＲ
图５预测的ＯｎＰＲＲ７．１蛋白三级结构
Ｆｉｇ．５ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７—１
（Ｍｏｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ ＸＰ ０ｌ０ｌｌ２３１８．１）、番茄ＰＲＲ３／７
（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ＸＰ ００４２３７５３３．１）、葡萄
ＰＲＲ３／７（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｘＰ ０１０６５８ｌ５７．１）、蓖麻
ＰＲＲ３／７（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ＸＰ ０ｌ ５５７８３８０．１）、枣
１３转角
３１－ｔｕｒｎ
ＰＲＲ３／７（Ｚｉｚｉｐｈｕｓｊｕ） ｕｂａ ＸＰ ０ｌ５８７７ｌｌ３．１）、大桉
ＰＲＲ３／７（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ ＸＰ ０ｌ００６７２４３．１）、
可 可 子ＰＲＲ３／７ （Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
ＸＰ ００７００９６６９．２）、铁皮石斛ＰＲＲ７／３（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ
ｃａｔｅｎａｔｕｍ ＸＰ ０２０６９２４４５．１）、小兰屿蝴蝶兰
ＰＲＲ７／３（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅｑｕｅｓｔｒｉｓ ＸＰ
０２０６０—
一
ｑ螺旋
ｃ【．ｈｅｌｉｘ
０ｌ８９．１）、野生稻ＰＲＲ７／３（０１Ｔｚａ ｂｒａｃｈｙａｎｔｈａ
ＸＰ ００６６４９８８４．１）、 玉米ＰＲＲ７／３（Ｚｅａｓ
ＡＣＧ２４２３４．１）、风梨ＰＲＲ３／７（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ
图６预测的ＯｎＰＲＲ７．２蛋白和三级结构
Ｆｉｇ．６ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７—２
ｘＰ ０２０ｌ０８３７８．１）、石刁柏ＰＲＲ７／３（Ａｓｐａｒａｇｕｓ
ｏｆｉｃｉｆｎａｌｉｓ ＸＰ ０２０２７ ｌ４８２．１）、茳芏ＰＲＲ７／３（Ｍｕｓａ
ａｃｕｍｉｎａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｍａｌａｃｃｅｎｓｉｓ ＸＰ ００９３８６５４３．１）、
示。其他９个物种的蛋白分别是：海枣ＰＲＲ３７
（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙ，ｉｆｅｒａ，ＸＰ ００８７８９０２２．１）、菡萏
ＰＲＲ３７（Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃ￣ｅｒａ，ＸＰ ０１０２５３４５８．１）、葡
海 枣ＰＲＲ３／７ （Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ
ＸＰ ００８７８９０２２．１）、油棕ＰＲＲ３／７（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ
萄ＰＲＲ３７（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ，ＸＰ ０１０６５８１５７．１）、油
棕ＰＲＲ３７（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ，ＸＰ ０１０９２０９６１．１）、
ｘＰ ０ｌ０９２０９６１．１）、拟南芥ＰＲＲｓ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ ＡＥＤ９７２７８．１、ＡＥＤ９０５２０．１、ＡＥＣ １ ０７５４．１、
蓖麻ＰＲＲ３７（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ，ＸＰ ０１５５７８３８—
０．１）、凤梨ＰＲＲ３７（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ，ＸＰ ０２０１０８—
３７８．１）、巴旦木ＡＰＲＲ７（Ｐｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａ，ＸＰ ０２０—
ＢＡＢ１３７４３．１、０ＡＯ９０７５７．１）水稻ＰＲＲｓ（Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ｉｎｄｉｃａ ＢＡＤ３８８５９．１、ＢＡＤ３８８５８．１：Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ｊａｐｏｎｉｃａ ＢＡＤ３８８５６．１、ＢＡＤ３８８５５．１）、小立
碗藓（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ ＢＡＪ８３８２９．１、
ＢＡＪ８３８２７．１ 、 ＢＡＪ８３８２６．１ 、
４２３０４９．１）、小兰屿蝴蝶兰ＰＲＲ７３（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅ—
ＢＡＪ８３８２８．１ 、
ｑｕｅｓｔｒｉｓ，ｘＰ ０２０６００１ ８９．１）和铁皮石斛ＰＲＲ７３（Ｄ—
ｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｔｅｎａｔｕｍ，ＸＰ ０２０６９２４４５．１）。比对结
果显示，分析的１０个物种的氨基酸序列均在Ｎ
ＢＡＩ３９９９３．１）、铁皮石斛ＰＲＲ１（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ
ｃａｔｅｎａｔｕｍ ＰＫＵ７６ｌｌ８．１）、深圳拟兰（Ａｐｏｓｔａｓｉａ
ｓｈｅｎｚｈｅｎｉｃａ ＰＫＡ６６２０８．１）和作为外族的巴两安白
僵菌ＰＲＲ１（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ ＰＭＢ６７６６８．１）。
末端有非常保守的ＲＬＤ结构域，ｃ末端有非常保
守的ＣＣＴ结构域。
分析结果表明，ＯｎＰＲＲ７一ｌ和ＯｎＰＲＲ７—２与同为兰
科植物的铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的ＰＲＲ７／３亲
缘关系最近，并且系统发育树的分支表明，双子
叶植物纲和单子叶植物纲的ＰＲＲ蛋白分别分支成
了上下两组。
２．４ ＯｎＰＲＲ７．１和ｏｎＰＲＲ７．２蛋白系统进化
分析
为研究ＯｎＰＲＲ７一ｌ和ＯｎＰＲＲ７—２蛋白的进化关
系，用ＭＥＧＡ ６．０软件将ＯｎＰＲＲ７—１和ＯｎＰＲＲ７．２
ｌ５７６ 热带作物学报 第３９卷
Ａｎａｎａ．ｓ ａｎｔｏｎｉｕｓ．ｔ
＇３６
ＤａｒｔｄＴ’ｏｈｉｕｍ ｅａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ ａ，ｕｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｔｕｓ￣，ｒａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
Ｐｈ８ＩａｅｎｏｎｓＩｓ ｅｏｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎｔｉｓ ｎｅｍｉｃａｔ
１４３
１ ３５
ｌ４２
１３６
Ｉ４２
ｌ４３
ｊ２７
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｒｎｍｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉ ｒａ ｔ
０ｎＰＲＲ７．１ ｔｘｔ
０ｎＰＲＲ７－２ ｔｘｔ
１３８
１４０
ｌ３７
１２６
１２６
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ
Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓ￣ｓ ｔ
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ ｍａｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｔｕｓ ｍ－ａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｍ
Ｐｈａｌａｅｎｏｎｓｉｓ ｅｏｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｅｔｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎｕｓ ｎｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ
Ｔｂｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉ忆ｒａ ｌ
ｏｎＰＲＲ７－１ ｔｘｔ
ＯｎＰＲＲ７－２ ｔｘｔ
Ｃｏｎｓｅｏｓｕｓ
Ａｎａｎａａ ｃｏｍｏｓｔｍ ｔ
２５７
２６８
２５６
２６２
２５７
２６５
２６４
２５０
２８０
２６０
２５９
２４７
２４７
３９３
Ｄｅｎｄｒｏｈｉｕｍ ｃａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ￣ｎａｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｔｕｓ￣ｒａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｈｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
ＰｈａＩａｅｎ０ｎ ｓ ｅ口ｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄｓｃｒｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎｕｓ ｏｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｈｒｏｒｎａ ｃａｃａｏ．
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｔ
ＯｎＰＲＲ７．１ ｔｘｔ
ＯｎＰＲＲ７．２ ｔｘｔ
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ
Ａｎａｎ８ｓ ｃｎｍｎＲ￣ｑｔ
３９４
３９１
３９９
３９８
３９４
３９９
３５８
４２１
４０１
３９３
３５０
３７１
５２９
５１ ５
Ｄｅｎｄｒｏｈｉｕｍ ｃａｔｃｎ
Ｅｌａｅｉｓ ｍｌｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｍｓ ｒｅ＇ａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｈｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
Ｐｈａｌａｅｎ０ｎｓｉｓ ｅｏｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｖｌｉｆ
Ｐｍｎｕｓ ｎｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｒｎｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｈｒｏｒｎａ ｃａｃａｏ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｔ
ＯｎＰＲＲ７．１ ｔｘｔ
ｏｎＰＲＲ７．２ ｔｘｔ
ＣｏｎｓｅｎＳＵＳ
Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ ｔ
５２９
５２５
５３５
５０１
５３７
４９５
５５ｌ
５３８
５３０
４６６
４８７
６７０
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｅａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ ｇｒｕｉｎｅｅｎｓｉ
Ｅｕｃａｌｖｎｔｕｓ ｒｅ＇ａｎｄ
６３６
６６３
６６ｌ
６７０
Ｎｅｌｕｍｈｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ
Ｐｈａｌａｅｎｏｎｓｉｓ ｅｏｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎ￣ｒ￣ｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉ佗ｒａ．ｔ
０ｎＰＲＲ７－１ ｔｘｔ
ｏｎＰＲＲ７－２ ｔｘｔ
Ｃｏｎｓｅｎｓｏｓ
Ａｎａｎ＆ｓ ＣＯｔＴＩＯＳＵＳｔ
６ｌ ３
６７Ｉ
６３１
６８６
６７６
６５０
５８０
６Ｏｌ
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｅａｔｅｎ
Ｅｌａｅｉｓ ｃ，ｕｉｎｅｅｎｓ｛
Ｅｕｃａｌｖ－ｏｔｕｓ ｔｒｒａｎｄ
Ｎｅｌｕｍｈｏ ｎｕｅｉ￣
Ｐｈａｌａｅｎ０ｎ Ｒ ｅＯｕ
Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｅｔｖｌｉｆ
Ｐｒｕｎｕｓ ｎｅｒｓｉｃａ ｔ
Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ．
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａｔ
ＯｎＰＲＲ７．１ ｔｘｔ
ＯｎＰＲＲ７－２ Ｉｘｔ
７９ｌ
７４Ｒ
７７５
７７８
７８７
７３３
７９０
７４６
ｇＯ１
７９２
７６９
６９６
７ｌ７
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ
红线部分是保守的结构域，绿线是ＯｎＰＲＲ７—１和ＯｎＰＲＲ７．２的序列差异区域。
Ｔｈｅ ｒｅｄ ｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ＯｎＰＲＲ７＿１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７·２
图７ 文心兰ＯｎＰＲＲ７—１和ＯｎＰＲＲ７．２与其他物种ＰＲＲ家族蛋白氨基酸序列多重比对
Ｆ｜ｇｌ ７ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７—１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７—２ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＰＲＲ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
２．５ ＯｎＰＲＲ７－１和Ｄ，ｌ艘 ７－２基因表达分析
通过Ｑ．ＰＣＲ可知，在连续的１２Ｌ：１２Ｄ处理
光照前的４ ｈ（凌晨２：００）左右。
在文心兰花发育的８个时期（花苞期Ａ、绽
口期Ｂ、半开放期Ｃ、盛开前期Ｄ、盛开期Ｅ、
衰老初期Ｆ、衰老期Ｇ和脱落干枯期Ｈ）中，
Ｄ ７一 和ＯｎＰＲＲ７－２基因表达情况如图１０所
下的４８ ｈ中ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７—２基因表达变
化情况如图９所示。分析可知，ＯｎＰＲＲ７一，和
０ ＰＲＲ７．２基因在２个连续的周期内呈现节律性
表达，在１２Ｌ：１２Ｄ条件下，２个基因的表达峰值
现在光照后的４ ｈ（上午１０：００），谷值出现在
示。该基因在绽口期（Ｂ）和衰老初期（Ｆ）时期
表达量达到高峰值，而在盛开前期（Ｄ）和脱落
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因 Ｒ７克隆与表达分析 １５７７
∞
图８ ＯｎＰＲＲ７．１和ＯｎＰＲＲ７－２蛋白的系统进化树分析
Ｆｉｇ．８ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７—１ ａｎｄ ＯｎＰＲＲ７—２ ａｎｄ ０ｔｈｅｒ ＰＲＲ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｒａ１ ｈｉ曲。 ｐ１
６ ８ １０１２１４１６１８２０２２２４２ ４ ６ ８１０１２１４１６１８２０２２２４２ ４
６ ８１０１２１４１６１８２０２２２４２ ４ ６ ８ １０１２１４１６１８２０２２２４２ ４
时间Ｔｉｍｅ／ｈ
时间Ｔｉｍｅ／ｈ
图９ ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７－２基因的节律性表达分析
Ｆｉｇ．９ Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７＿ 和ＯｎＰＲＲ７＿２ ｉｎ ４８ ｈｏｕｒｓ
热带作物学报 第３９卷
２．５
２．Ｏ
２．Ｏ
１．５
至
莨罂
【＿ｏＡ。一吕 ２ｄｘｕ ｏ 焉一Ｑ
１．Ｏ
＿薹ｉ
§
夏
喜
０．５
０．５
Ｏ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ
花发育阶段
Ｆｌｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ
花发育阶段
Ｆｌｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ
Ａ：花苞期；Ｂ：绽口期；Ｃ：半开放期；Ｄ：盛开前期；Ｅ：盛开期；Ｆ：衰老初期；Ｇ：衰老期；Ｈ：脱落干枯期。
Ａ：Ｔｈｅ ｂｕｄ ｓｔａｇｅ；Ｂ：Ｔｈｅ ｂｕｄ ｂｕｒｓｔ ｓｔａｇｅ；Ｃ：Ｔｈｅ ｈａｌｆ－ｏｐｅｎｅｄ ｓｔａｇｅ；Ｄ：Ｔｈｅ ｐｒｅ—ｂｌｏｏｍｉｎｇ ｓｔａｇｅ；Ｅ：Ｔｈｅ ｂｌｏｏｍｉｎｇ ｓｔａｇｅ；Ｆ：Ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅ
ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ；Ｇ：Ｔｈｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｇｅ；Ｈ：Ｔｈｅ ｗｉｔｈｅｒｅｄ ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｅｄ ｓｔａｇｅ．
图１０ ＯｎＰＲＲ７－１和ＯｎＰＲＲ７－２文心兰花发育和衰老过程中的表达分析
Ｆｉｇ．１０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯｎＰＲＲ７－ 和ＯｎＰＲＲ７—２ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｎｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
莨
干枯期（Ｈ）表达达到低峰值。 物种的同族基因一样具有保守性 Ｊ。
表达分析表明，ＯｎＰＲＲ７．，和ＯｎＰＲＲ７－２基因
３ 讨论
在文心兰花瓣中呈现连续的昼夜循环表达。在
１２Ｌ：１２Ｄ光照黑暗循环处理下，ＯｎＰＲＲ７一 和
ＯｎＰＲＲ７—２基因呈现节律性表达，和之前研究的拟
南芥和菁芜菁ＰＲＲｓ基因的表达模式相一致ｆ３１－３２］。
本研究克隆得到２个文心兰ＰＲＲ７基因：
ＯｎＰＲＲ７一 和ＯｎＰＲＲ７－２基因，这２个ＰＲＲ７基因
成员的核苷酸序列仅有６０ ｂｐ左右差异。序列比
对表明它们与其他物种ＰＲＲ基因氨基酸序列均在
Ｎ端或Ｃ端有非常保守的ＲＬＤ和ＣＣＴ结构域。
文心兰尸 Ｒ７基因存在２个成员的现象和小立碗
拟南芥ＰＲＲ７与ＰＲＲ９和ＰＲＲ５通过对ＣＣＡ１和
ＬＨＹ启动子的阻遏活性而在生物钟反馈环路中
发挥功能【７ Ｊ，ＰＲＲ７本身也通过转录和转录后机制
藓及水稻情况类似。小立碗藓 尺７存在编码不
同的氨基酸序列的两个成员ＰＲＲＴａ和ＰＲＲ７ｂ［ ］，
水稻粳稻和籼稻中也具有序列不同的两基因成员
尺 和 ３７【２７］，但拟南芥中只有一个 尺７
基因，这可能是由于在进化过程中基因含量和序
列发生变化所致。ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７．２基因含
而受到调控 引。有研究表明拟南芥ＰＲＲ７与ＰＲＲ９
和ＰＲＲ５一起通过ＣＯＮＳＴＡＮＳ依赖性途径控制开
花时问【ｊ引。本研究中，ＯｎＰＲＲ７一 和ＯｎＰＲＲ７—２
基因在文心兰花发育和花衰老过程中呈现双峰表
达模式，表达量分别在绽口期（Ｂ）和衰老初期
（Ｆ）达到高峰值，而在两峰之间的盛开前期（Ｄ）
处于低峰。ＯｎＰＲＲ７一，和ＯｎＰＲＲ７—２基因这种表达
有ＲＬＤ和ＣＣＴ保守结构域的氨基酸序列，这与
其他物种的ＰＲＲｓ家族基因编码的氨基酸序列保
守结构域相一致，但中间序列则差异较大。ＰＲＲｓ
被定义为是包含有２个保守域的蛋白质，这２个
模式，表明它们有可能在花发育的开花和仡衰老
的过程中发挥作用，但仍待进一步证实。
参考文献
【１】Ｄｕｎｌａｐ Ｊ Ｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｄｏｃｋｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，
结构域被１个不太保守的“可变”域分隔ｌ 引。
因此，本研究克隆的２个文心兰基因属于ＰＲＲ基
因家族。发育树的分支表明，双子叶植物纲和单
子叶植物纲的ＰＲＲ蛋白分别形成亲缘关系较远的
两组，而ＯｎＰＲＲ７．１和ＯｎＰＲＲ７ ２与同为兰科植
物的铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的ＰＲＲ７／３亲缘关
系最近。显然文心兰ＰＲＲ基因在进化上也与其他
１９９９，９６（２）：２７１－２９０．
［２］Ｈａｒｍｅｒ Ｓ Ｌ．Ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆＰｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，６Ｏ（１）：３５７—３７７．
［３］ 徐小冬，谢启光．植物生物钟研究的历史同顾与最新进展
［Ｊ］．自然杂志，２０１３，３５（２）：１１８－１２６．
【４】 王晗．生物钟生物学及其研究进展［Ｊ］．生命科学，２０ １ ５，
第８期 杨翠萍等：文心兰生物钟相关基因ＰＲＲ７克隆与表达分析 １５７９
２７（１１１：１ ３１３－１ ３１９．
［５］
Ｂｅｎｄｉｘ Ｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｃ Ｍ，Ｈａｒｍｏｎ Ｆ Ｇ．Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ
ｇｅｎｅｓ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｅｙ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｒｔａｉｔｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ
Ｐｌａｎｔ，２０１５，８（８）：ｌ １３５—１ １５２．
【６］
Ｂｅｃｋｗｉｔｈ Ｅ Ｊ．Ｙａｎｏｖｓｋｙ Ｍ Ｊ．Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａｔ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ
ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｕｇｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１４，２７：３５—４２．
［７］
Ｍａｔｓｕｓｈｉｋａ Ａ，Ｍａｋｉｎｏ Ｓ，Ｋｏｊｉｍａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｗａｖｅｓ
ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＰＲＲ１／ＴＯＣ１ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｓｅｕ—
ｄｏ—ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ
ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，
４１（９）：１ ００２—１ ０１２．
［８１
Ｆａｒｒ６ Ｅ Ｍ，Ｌｉｕ Ｔ．Ｔｈｅ ＰＲＲ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｒｔａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａ—
ｔｏｒｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｉｒｃａｄｉａｎ
ｃｌｏｃｋｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌｎａｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１６（５）：
６２１—６２９．
［９］
Ｍｉｚｕｎｏ Ｔ．Ｔｗｏ—ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｌａｙ ｓｉｇｎａｌ ｒｔａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：ｆｒｏｍ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｉｒｃａｄｉａｎ
ｒｈｙｔｈｍｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，
６９：２ ２６３．２ ２７６．
【１Ｏ】 Ｍｉｚｕｎｏ Ｔ，Ｎａｋａｍｉｃｈｉ Ｎ．Ｐｓｅｕｄｏ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ（ＰＲＲｓ）
ｏｒ ｔｒｕｅ ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｒＴＯＣｓ）［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ—
ｏｌｏｇｙ，２００５，４６：６７７—６８５．
Ｌｉ Ｙ．Ｘｕ Ｍ．ＣＣＴ ｆａｍｉｌｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐｓ：Ａ ｃｕｒｒｅｎｔ
ｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｃｒｏｐ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１７，５（６）：４４９—４５８．
［１２】
Ｋａｃｚｏｒｏｗｓｋｉ Ｋ Ａ， Ｑｕａｉｌ Ｐ Ｈ． Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＰＳＥＵＤＯ—ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲ７ ｉｓ ａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｔｅｒ－
ｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｄｅｅｔｉｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｐｈａｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｃｅｌｌ，２００３，１５（Ｉ １）：
２ ６５４．２ ６６５．
［１３】
Ｓａｌｏｍ ６ Ｐ Ａ，Ｗｅｉｇｅｌ Ｄ，Ｍｃｃｌｕｎｇ Ｃ Ｒ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆｔｈｅ Ａｒａ—
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｏｒｎｉｎｇ ｌｏｏｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ＣＣＡ１，ＬＨＹ，ＰＲＲ７，ａｎｄ
ＰＲＲ９ ｉｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２０１０，
２２（１ ｌ、：３ ６５０－３ ６６１．
【１４】
刘晓荣，王碧青，朱根发．文心兰研究进展【Ｊ］．亚热带植
物科学，２００７，３６（３）：８５—９０．
［１５］
潘英文，林明光，韩松．文心兰切花采后冷藏保鲜技术
研究［Ｊ］．热带作物学报，２０１ １，３２（４）：７５２—７５５．
［１６］
石乐松，孙慧，田晓岩，等．文心兰南茜种花发育进程
与分期［Ｊ】．热带生物学报，２０１６，７（４）：４４０—４４３，４４９．
［１７］
勾 昕，胡薇薇，范亚飞，等．文心兰切花不同开放阶段
花被的生理生化变化［Ｊ］．热带生物学报，２０１６，７（１）：７０—７５．
【１８］
黄浩宇，肖云骁，石乐松，等．文心兰切花花被衰老过程
中酶活性变化研究．热带生物学报，２０１６，７（２）：１９９—２０３
［１９】
Ｙａｎｇ Ｇ Ｈ．Ｌｉｕ Ｊ Ｐ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ １－ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ一
１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ Ｇｏｗｅｒ Ｒａｍ—
ｓｅｙ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１３（４）：
８ ４８０．８ ４８８
［２０】
杨光华，刘进平．文心兰ＡＣＣ氧化酶基因ＯｎＡＣＯ１克隆
与表达分析［Ｊ］．热带作物学报，２０１４，３５（４）：６９３—６９９．
［２１】Ｓｈｉ Ｌ Ｓ，Ｌｉｕ Ｊ Ｐ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｃｌｏｎｉｎｇ ｎａｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎａａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ａｎ １一ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ一１一ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ Ｇｏｗｅｒ Ｒａｍｓｅｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏ—
ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６，４６９：２０３—２０９．
［２２］田晓岩，石乐松，潘英文，等．文心兰ＯｎＡＣ０２基因的克
隆及表达分析［Ｊ】．分子植物育种，２０１５，１３（７）：１ ６０２—１ ６１０．
［２３】田晓岩，杨翠萍，胡进，等．文心兰ＯｎＥＲＳ１全长基因
克隆及表达分析［Ｊ］＿分子植物育种，２０１７，１５（４）：
１ ２６５．１ ２７２．
［２４】徐张红，赵晓刚，何奕昆．拟南芥生物钟分子机制研究进
展［Ｊ］．植物学通报，２００５，２２（３）：３４１—３４９．
［２５］Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｍ，Ｓｔａｉｇｅｒ Ｄ．Ｔｉｍｅ ｔｏ ｌｆｏｗｅｒ：ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｂｅｗｔｅｅｎ
ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉ—
ｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，２０１５，６６（３）：７１９—７３０．
［２６］Ｓａｔｂｈａｉ Ｓ Ｂ．Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｇｅｎｅｓ（ＰＲＲ）ｉｎ ｈｔｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ［Ｄ］．Ｎａｇｏｙａ：
Ｎａｇｏｙａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，２０１ １．
［２７］Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｋａ Ａ，Ａｓｈｉｋａｒｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｒ－
ｃａｄｉａｎ·ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｒｃｅ ｐｓｅｕｄｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ（ＯｓＰＲＲｓ）：
ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｈｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌｆｏｗｅｒｉｎｇ ｔｉｍｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏ—
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，６９（２）：４１０—４１４．
【２８】Ｍａｋｉｎｏ Ｓ，Ｋｉｂａ Ｔ，Ｉｍａｍｕｒａ Ａ，ｅｌ ａ１．Ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｐｓｅｕｄｏ－·ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ：ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ Ｈｉｓ－－ｔｏ－－Ａｓｐ ｐｈｏｓ－－
ｐｈｏｒｅｌａｙ ａｎｄ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｈｙｔｈｍ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，４１：７９１—８０３．
［２９】Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ，Ｔａｇｏ Ｙ，Ｙａｍａｓｈｉｎｏ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｏｖｅｒｖｉｅｗｓ ｏｆ ｃｌｏｃｋ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
ａｎｄ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，４８（１）：
ｌ１０—１２１．
【３０】Ｔａｋａｔａ Ｎ，Ｓａｉｔｏ Ｓ，Ｓａｉｔｏ Ｃ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ ｏｆ
ｈｔｅ ｐｌｎａｔ ｃｌｏｃｋ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｐｒｏｃ—
ｅｓｓｅｓ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏ—ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｕｇｌａｔｏｒｓ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１０：１２６．
【３１】Ｋｉｍ Ｊ Ａ，Ｙａｎｇ Ｔ Ｊ，Ｋｉｍ Ｊ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒ—
ｃａｄｉａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｂｙ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅ·
ｎｏｍｉｃｓ ｗｉｔｈ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＆
Ｃｅｉｌｓ．２００７，２３（２）：１４５—１５３．
【３２］Ｍａｋｉｎｏ Ｓ，Ｋｉｂａ Ｔ，Ｉｍａｍｕｒａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｐｓｅｕｄｏ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ：ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ Ｈｉｓ—ｔｏ—Ａｓｐ ｐｈｏｓ—
ｐｈｏｒｅｌａｙ ａｎｄ ｃｉｒｃａｄｉｎａ ｒｈｙｔｍｈ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．
Ｐｌｎａｔ＆Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，４１（６）：７９１—８０３．
［３３］Ｎａｋａｍｉｃｈｉ Ｎ，Ｋｉｂａ Ｔ，Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ Ｒ，ｅｔ ａ１．ＰＳＥＵＤＯ—
ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＳ ９，７，ａｎｄ ５ ａｒｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｉｒｃａｄｉｎａ ｃｌｏｃｋ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｃｅｌｌ，
２０１０，２２（３）：５９４－６０５．
［３４］Ｆａｒｒ６ Ｅ Ｍ，Ｋａｙ Ｓ Ａ．ＰＲＲ７ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ
ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｉｒｃａｄｉｎａ ｃｌｏｃｋ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ—
ｈａｌ，２００７，５２（３）：５４８—５６０．