2024年9月1日发(作者：祭姣妍)
TET2蛋白下调5hmC在膀胱癌细胞T739中低表达
目的：研究膀胱尿路上皮癌细胞中TET2蛋白及5hmC的表达量相关作用。
方法：采用Real-time PCR检测正常尿路上皮细胞和膀胱尿路上皮癌细胞中TET2
mRNA的表达，并同时采用细胞免疫化学染色检测正常尿路上皮细胞和膀胱尿
路上皮癌细胞中5mC及5hmC表达，了解TET与膀胱癌的作用关系，并探讨其
可能的作用机制。结果：TET2 mRNA在正常膀胱细胞T24中的表达（1.400
00±0.057 74，n=3），显著高于膀胱癌T739细胞（[0.866 70±0.120 20，n=3），P=0.016
1]；TET2蛋白在T739中表达（1.589 00±0.048 52，n=3）也明显低于T24[（1.310
00±0.049 33，n=3），P=0.015 7]。5-mC在两种细胞中的表达量比较差异无统计学
意义（P=0.097 6）；5-hmC的表达量T739细胞明显低于T24细胞
[（1.840 00±0.055 68，n=3） VS （1.487 00±0.041 77，n=3），P=0.007 1）]。
结论：TET2 mRNA和蛋白水平在膀胱肿瘤细胞中低表达，显著低于正常膀胱细
胞；且TET2与5hmC低表达存在相关性。
隨着相关诊疗技术的进展，膀胱癌的发病率与病死率在我国呈现逐年升高趋
势，严重地危害着我国居民健康[1]。75%～85%初诊膀胱癌患者为非肌层浸润性
肿瘤，经尿道手术治疗后，约20%进展为肌层浸润性膀胱癌，患者需行根治性手
术切除膀胱，生活质量与预期寿命均显著下降[2]。膀胱癌是由多因素综合作用
导致的，一个复杂的病理过程，与遗传、环境、免疫等密切相关。在肿瘤转移发
生过程中，许多基因的表达将出现改变，尤其是肿瘤可通过上调转移促进基因
（metastasis-promoting genes）的表达以及下调转移抑制基因
（metastasis-suppressor genes）的表达来获得一些新的生物学特性，从而增强肿
瘤细胞的侵袭及转移能力[3]。随着表观遗传学的研究进展以及检测方式的改进，
5?羟甲基胞嘧啶（5-Hydroxymethylcytosine，5hmC）逐渐成为目前的研究热点。
5hmC是由TET蛋白催化5?甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，5mC）去甲基化转
化而来。近年来，人们对这一有趣的DNA研究有了很大的兴趣，了解TET蛋白
和5hmC的相关性，进一步了解基因调控与疾病的关系。5hmC水平表达可能在
各个方面发挥着重要作用病理生理过程，如血液学恶性肿瘤、黑色素瘤、神经退
行性疾病和老化等[4-7]。然而，5hmC是否与膀胱肿瘤相关，目前尚无明确报道。
本研究，拟通过检测膀胱癌细胞及正常膀胱上皮细胞中TET2及5hmC的表达，
了解膀胱尿路上皮癌发生发展过程中TET家族可能所起的作用，并探讨其可能
的作用机制。现报道如下。1 材料与方法
1.1 细胞来源及培养 人类膀胱癌细胞株T739、人膀胱上皮细胞株T24由中
科院上海细胞库提供。RPMI 1640细胞培养液购自Hyclone公司，10%胎牛血清、
100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素购自Invitrogen公司。细胞置于培养皿中，
放到37 ℃的条件下，5%CO2培养箱中传代培养。最终，取对数生长期的细胞
进行本研究的相关实验操作。
1.2 RNA提取、反转录聚合酶链反应 Real-time PCR检测T739和T24细胞
中TET2 mRNA的表达，利用TRIzol试剂（Invitrogen公司）分别提取T739与
T24细胞的总RNA，合成cDNA。反应条件：（1）42 ℃ 30 min；（2）99 ℃5 min，
反应产物-20 ℃冰箱保存。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，合成cDNA，
进行real-time PCR反应。本研究中采用的TET2 mRNA的引物序列由上海生工
生物工程公司合成：上游5’-TTCTTCCCCATGACCAC-3’下游5’
-ACGCTTGGAAG CAGGAGAT-3’。PCR循环条件：（1）变性94 ℃ 30秒；（2）
退火55 ℃45秒；（3）延伸65 ℃45秒，共循环30次；（4）72 ℃延伸5 min。
分析最终的基因扩增结果，计算Ct值。采用GAPDH作为内参。每组设3个复
孔，基因相对表达量（RQ）采用2-△△Ct方法计算。
1.3 蛋白质印迹法检测TET2蛋白表达量 采用
1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF，凯基生物科技有限公司，Ltd，南京，中
国）于冰上孵育0.5 h，裂解细胞。使用BCA蛋白检测试剂盒（凯基生物科技有
限公司）检测蛋白浓度。细胞裂解液（16 μg）用6%十二烷基硫酸钠处理。聚丙
烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜。采用含5%脱脂牛奶的TBST，室温封闭1 h。加
入一抗，抗TET2（1∶500稀释，Abcam，美国）在4 ℃过夜。TBST洗涤后，
印迹与二抗体孵育（1∶6 000稀释，cwbio）在室温下1 h。蛋白质密度分析Image
J软件（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国）
1.4 细胞免疫化学染色检测5mC和5hmC表达 T739与T24细胞去除培养
基后，采用PBS冲洗3次，5 min/次。PBS清洗后，收集细胞放置于4%多聚甲
醛，37 ℃固定15 min。固定后，再用PBS清洗细胞3次，5 min/次。将细胞置
入预冷的甲醇处理10min，处理前甲醛需要置于-20 ℃冰箱预处理。PBS洗3 次。
孵育一抗：5hmC为1∶500，Abcam，美国，4 ℃孵育过夜。一抗孵育后，PBS
洗涤细胞，5 min/次，洗3次。孵育荧光二抗。两种抗体，抗体稀释度：AlexaFluor594
为1∶800，AlexaFluor488为1∶400。二抗室温孵育，孵育60 min。PBS清洗后，
用50%甘油/PBS封片观察。采用尼康荧光显微镜进行观察。采用Image ProPlus
Version 4.0软件分析，检测荧光光度值。
1.5 统计学处理 以上实验均重复3次以上。统计学软件采用SPSS 19.0版
（SPSS Inc.，Chicago，IL，美国），实验结果用（x±s）表示，先进行方差分析
（F检验），两样本均数比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-PCR检测TET2 mRNA的在T739和T24细胞的表达水平 TET2
mRNA在T739中的表达（1.400 00±0.057 74，n=3），显著高于T24细胞（0.866
70±0.120 20，n=3），差异有统计学意义（P=0.0161），见图1。
2.2 TET2 蛋白的在T739和T24细胞的表达水平 TET2蛋白在T739细胞中
的表达为（1.589 00
±0.048 52，n=3），T24细胞为（1.310 00±0.049 33，
n=3），TET2蛋白在T739细胞中的表达明显高于T24细胞（P=0.015 7），见
图2。
2.3 5mC和5hmC在T739和T24细胞的表达水平比较 5mC在T739和T24
细胞的表达水平比较，差异无统计学意义（P=0.097 6），见图3；5hmC在T739
细胞中的表达（1.840 00±0.055 68，n=3）明显高于T24细胞（1.487 00±0.041 77，
n=3），差異有统计学意义（P=0.007 1），见图4。
3 讨论
5hmC是由TET家族蛋白催化产生的氧化产物，早在几十年前就被发现[8]。
但是直到最近，研究者才在鼠的脑和胚胎干细胞中确定了5hmC的高表达，羟甲
基话逐渐被人们所重视[9]。目前研究认为，5hmC是去甲基化的中间产物，通过
移位或突变产生甲基化表型，从而破坏了TET蛋白质的功能。TET蛋白是5hmC
的重要调节因子[10]。人TET蛋白家族共有3个成员，分别为TET1、TET2和
TET3。TET1主要在胎儿组织和干细胞中表达，TET2在造血系统中含量较高，
而TET3则在结肠和肌肉等组织中表达[11]。其中，TET2相关研究显示：约有
20%骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者可以被检测出
TET2突变；并且，相关结果与临床症状存在一定的相关性；有部分学者认为：
TET2可以被作为一种良好的诊断标志物，指导精准治疗[12-13]。
在人类的不同组织中，5hmC表达存在明显的差异性。采用免疫沉淀等方法，
Li等[14]发现在人脑组织中5hmC高表达约0.67%，在肝、肾、结直肠组织中表
达量相对较低，在心、乳腺、胎盘组织内表达量更低，仅为0.05%～0.06%。本
研究发现但去甲基化5mC即5hmC在肿瘤细胞中，也存在高表达的趋势。相对
于T24的表达量，TET2作为5hmC的重要调节因子，在肿瘤细胞T739中mRNA
和蛋白水平均明显降低，这与肿瘤与低甲基化水平相类似的结果。DNA甲基化，
是最早被学者发现的表观遗传的修饰形式。TET2基因维持CpG岛的局部DNA
甲基化，从而起到了阻止肿瘤细胞CPG异常甲基化的作用[15]。最近的一項报
告显示，脑部病变，特别是星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，随着肿瘤级别升高，5mC
水平没有明显变化，但可以显著降低5hmC[16]；其他的研究也显示，相比于正
常组织，肿瘤会降低5hmC的水平[17-18]。国内的一些学者在其他实体癌的相关
研究中，也得到了相类似的结果：谢素红等[19]通过应用小干扰RNA沉默TET1
基因表达，可显著下调肾癌786-O细胞中TET1蛋白的表达水平，明显抑制786-O
细胞的增殖，并使细胞阻滞于G1期，其机制可能与TET1调控SUZ12的表达，
影响其靶基因对PRC2的招募有关。可能的猜想是：TET2突变导致活性丧失或
功能丢失，阻止了5mC向5hmC转化，从而造成5hmC的降低，但由于体内其
他代谢途径维持了5mC的平衡[20]。所以本研究中膀胱癌细胞中5hmC显著降低，
但与正常细胞相比5mC水平无明显变化。
到目前为止，TET2蛋白是否在实体恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要
作用仍有待进一步研究。虽然本研究发现了TET2、5hmC在膀胱肿瘤细胞中的
高表达，提示TET2和5hmC可能成为膀胱癌诊断及治疗的新靶点，为了解膀胱
尿路上皮癌发生发展过程中TET家族可能所起的作用，但具体相关机制尚需要
进一步深入研究。
参考文献
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diagnosis and treatment of bladder cancer in China-Analyses of Chinese bladder
cancer consortium database[J].Asian J Urol，2015，2（2）：63-69.
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development[J].Science，2011，293（5532）：1089-1093.
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family，is fused to MLL in acute myeloid leukemia containing the t（10；11）（q22；
q23）[J].Leukemia，2003，17（3）：637-641.
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5-hydroxymethylcytosine in different human tissues[J].J Nucleic Acids，2011，2011：
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[19]謝素红，翁文浩，李智.TET1对肾癌786-O细胞增殖的影响及其相关机
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animal development[J].Science，2010，330（6004）：622-627.
2024年9月1日发(作者：祭姣妍)
TET2蛋白下调5hmC在膀胱癌细胞T739中低表达
目的：研究膀胱尿路上皮癌细胞中TET2蛋白及5hmC的表达量相关作用。
方法：采用Real-time PCR检测正常尿路上皮细胞和膀胱尿路上皮癌细胞中TET2
mRNA的表达，并同时采用细胞免疫化学染色检测正常尿路上皮细胞和膀胱尿
路上皮癌细胞中5mC及5hmC表达，了解TET与膀胱癌的作用关系，并探讨其
可能的作用机制。结果：TET2 mRNA在正常膀胱细胞T24中的表达（1.400
00±0.057 74，n=3），显著高于膀胱癌T739细胞（[0.866 70±0.120 20，n=3），P=0.016
1]；TET2蛋白在T739中表达（1.589 00±0.048 52，n=3）也明显低于T24[（1.310
00±0.049 33，n=3），P=0.015 7]。5-mC在两种细胞中的表达量比较差异无统计学
意义（P=0.097 6）；5-hmC的表达量T739细胞明显低于T24细胞
[（1.840 00±0.055 68，n=3） VS （1.487 00±0.041 77，n=3），P=0.007 1）]。
结论：TET2 mRNA和蛋白水平在膀胱肿瘤细胞中低表达，显著低于正常膀胱细
胞；且TET2与5hmC低表达存在相关性。
隨着相关诊疗技术的进展，膀胱癌的发病率与病死率在我国呈现逐年升高趋
势，严重地危害着我国居民健康[1]。75%～85%初诊膀胱癌患者为非肌层浸润性
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术切除膀胱，生活质量与预期寿命均显著下降[2]。膀胱癌是由多因素综合作用
导致的，一个复杂的病理过程，与遗传、环境、免疫等密切相关。在肿瘤转移发
生过程中，许多基因的表达将出现改变，尤其是肿瘤可通过上调转移促进基因
（metastasis-promoting genes）的表达以及下调转移抑制基因
（metastasis-suppressor genes）的表达来获得一些新的生物学特性，从而增强肿
瘤细胞的侵袭及转移能力[3]。随着表观遗传学的研究进展以及检测方式的改进，
5?羟甲基胞嘧啶（5-Hydroxymethylcytosine，5hmC）逐渐成为目前的研究热点。
5hmC是由TET蛋白催化5?甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，5mC）去甲基化转
化而来。近年来，人们对这一有趣的DNA研究有了很大的兴趣，了解TET蛋白
和5hmC的相关性，进一步了解基因调控与疾病的关系。5hmC水平表达可能在
各个方面发挥着重要作用病理生理过程，如血液学恶性肿瘤、黑色素瘤、神经退
行性疾病和老化等[4-7]。然而，5hmC是否与膀胱肿瘤相关，目前尚无明确报道。
本研究，拟通过检测膀胱癌细胞及正常膀胱上皮细胞中TET2及5hmC的表达，
了解膀胱尿路上皮癌发生发展过程中TET家族可能所起的作用，并探讨其可能
的作用机制。现报道如下。1 材料与方法
1.1 细胞来源及培养 人类膀胱癌细胞株T739、人膀胱上皮细胞株T24由中
科院上海细胞库提供。RPMI 1640细胞培养液购自Hyclone公司，10%胎牛血清、
100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素购自Invitrogen公司。细胞置于培养皿中，
放到37 ℃的条件下，5%CO2培养箱中传代培养。最终，取对数生长期的细胞
进行本研究的相关实验操作。
1.2 RNA提取、反转录聚合酶链反应 Real-time PCR检测T739和T24细胞
中TET2 mRNA的表达，利用TRIzol试剂（Invitrogen公司）分别提取T739与
T24细胞的总RNA，合成cDNA。反应条件：（1）42 ℃ 30 min；（2）99 ℃5 min，
反应产物-20 ℃冰箱保存。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，合成cDNA，
进行real-time PCR反应。本研究中采用的TET2 mRNA的引物序列由上海生工
生物工程公司合成：上游5’-TTCTTCCCCATGACCAC-3’下游5’
-ACGCTTGGAAG CAGGAGAT-3’。PCR循环条件：（1）变性94 ℃ 30秒；（2）
退火55 ℃45秒；（3）延伸65 ℃45秒，共循环30次；（4）72 ℃延伸5 min。
分析最终的基因扩增结果，计算Ct值。采用GAPDH作为内参。每组设3个复
孔，基因相对表达量（RQ）采用2-△△Ct方法计算。
1.3 蛋白质印迹法检测TET2蛋白表达量 采用
1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF，凯基生物科技有限公司，Ltd，南京，中
国）于冰上孵育0.5 h，裂解细胞。使用BCA蛋白检测试剂盒（凯基生物科技有
限公司）检测蛋白浓度。细胞裂解液（16 μg）用6%十二烷基硫酸钠处理。聚丙
烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜。采用含5%脱脂牛奶的TBST，室温封闭1 h。加
入一抗，抗TET2（1∶500稀释，Abcam，美国）在4 ℃过夜。TBST洗涤后，
印迹与二抗体孵育（1∶6 000稀释，cwbio）在室温下1 h。蛋白质密度分析Image
J软件（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国）
1.4 细胞免疫化学染色检测5mC和5hmC表达 T739与T24细胞去除培养
基后，采用PBS冲洗3次，5 min/次。PBS清洗后，收集细胞放置于4%多聚甲
醛，37 ℃固定15 min。固定后，再用PBS清洗细胞3次，5 min/次。将细胞置
入预冷的甲醇处理10min，处理前甲醛需要置于-20 ℃冰箱预处理。PBS洗3 次。
孵育一抗：5hmC为1∶500，Abcam，美国，4 ℃孵育过夜。一抗孵育后，PBS
洗涤细胞，5 min/次，洗3次。孵育荧光二抗。两种抗体，抗体稀释度：AlexaFluor594
为1∶800，AlexaFluor488为1∶400。二抗室温孵育，孵育60 min。PBS清洗后，
用50%甘油/PBS封片观察。采用尼康荧光显微镜进行观察。采用Image ProPlus
Version 4.0软件分析，检测荧光光度值。
1.5 统计学处理 以上实验均重复3次以上。统计学软件采用SPSS 19.0版
（SPSS Inc.，Chicago，IL，美国），实验结果用（x±s）表示，先进行方差分析
（F检验），两样本均数比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-PCR检测TET2 mRNA的在T739和T24细胞的表达水平 TET2
mRNA在T739中的表达（1.400 00±0.057 74，n=3），显著高于T24细胞（0.866
70±0.120 20，n=3），差异有统计学意义（P=0.0161），见图1。
2.2 TET2 蛋白的在T739和T24细胞的表达水平 TET2蛋白在T739细胞中
的表达为（1.589 00
±0.048 52，n=3），T24细胞为（1.310 00±0.049 33，
n=3），TET2蛋白在T739细胞中的表达明显高于T24细胞（P=0.015 7），见
图2。
2.3 5mC和5hmC在T739和T24细胞的表达水平比较 5mC在T739和T24
细胞的表达水平比较，差异无统计学意义（P=0.097 6），见图3；5hmC在T739
细胞中的表达（1.840 00±0.055 68，n=3）明显高于T24细胞（1.487 00±0.041 77，
n=3），差異有统计学意义（P=0.007 1），见图4。
3 讨论
5hmC是由TET家族蛋白催化产生的氧化产物，早在几十年前就被发现[8]。
但是直到最近，研究者才在鼠的脑和胚胎干细胞中确定了5hmC的高表达，羟甲
基话逐渐被人们所重视[9]。目前研究认为，5hmC是去甲基化的中间产物，通过
移位或突变产生甲基化表型，从而破坏了TET蛋白质的功能。TET蛋白是5hmC
的重要调节因子[10]。人TET蛋白家族共有3个成员，分别为TET1、TET2和
TET3。TET1主要在胎儿组织和干细胞中表达，TET2在造血系统中含量较高，
而TET3则在结肠和肌肉等组织中表达[11]。其中，TET2相关研究显示：约有
20%骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者可以被检测出
TET2突变；并且，相关结果与临床症状存在一定的相关性；有部分学者认为：
TET2可以被作为一种良好的诊断标志物，指导精准治疗[12-13]。
在人类的不同组织中，5hmC表达存在明显的差异性。采用免疫沉淀等方法，
Li等[14]发现在人脑组织中5hmC高表达约0.67%，在肝、肾、结直肠组织中表
达量相对较低，在心、乳腺、胎盘组织内表达量更低，仅为0.05%～0.06%。本
研究发现但去甲基化5mC即5hmC在肿瘤细胞中，也存在高表达的趋势。相对
于T24的表达量，TET2作为5hmC的重要调节因子，在肿瘤细胞T739中mRNA
和蛋白水平均明显降低，这与肿瘤与低甲基化水平相类似的结果。DNA甲基化，
是最早被学者发现的表观遗传的修饰形式。TET2基因维持CpG岛的局部DNA
甲基化，从而起到了阻止肿瘤细胞CPG异常甲基化的作用[15]。最近的一項报
告显示，脑部病变，特别是星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，随着肿瘤级别升高，5mC
水平没有明显变化，但可以显著降低5hmC[16]；其他的研究也显示，相比于正
常组织，肿瘤会降低5hmC的水平[17-18]。国内的一些学者在其他实体癌的相关
研究中，也得到了相类似的结果：谢素红等[19]通过应用小干扰RNA沉默TET1
基因表达，可显著下调肾癌786-O细胞中TET1蛋白的表达水平，明显抑制786-O
细胞的增殖，并使细胞阻滞于G1期，其机制可能与TET1调控SUZ12的表达，
影响其靶基因对PRC2的招募有关。可能的猜想是：TET2突变导致活性丧失或
功能丢失，阻止了5mC向5hmC转化，从而造成5hmC的降低，但由于体内其
他代谢途径维持了5mC的平衡[20]。所以本研究中膀胱癌细胞中5hmC显著降低，
但与正常细胞相比5mC水平无明显变化。
到目前为止，TET2蛋白是否在实体恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要
作用仍有待进一步研究。虽然本研究发现了TET2、5hmC在膀胱肿瘤细胞中的
高表达，提示TET2和5hmC可能成为膀胱癌诊断及治疗的新靶点，为了解膀胱
尿路上皮癌发生发展过程中TET家族可能所起的作用，但具体相关机制尚需要
进一步深入研究。
参考文献
[1] Li K，Lin e Bladder Cancer Consortium，et t status of
diagnosis and treatment of bladder cancer in China-Analyses of Chinese bladder
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