2024年11月3日发(作者：库书艺)
1426
第
26
卷第
16
期第 三 军 医 大 学 学 报
Vol.26,No.16
2004
年
8
月
ACTA
ACADEMIAE
MEDICINAE
MILITARIS
TERTIAEAug.2004
论著
12
文章编号
:1000
2
5404
(
2004
)
16
2
1426
2
03
硫芥诱导
L5178Y
细胞
tk
基因突变的研究
李奇慧
,
朱明学
,
张黎明
,
董兆君
(
1
第三军医大学预防医学院军事毒理学教研室
,
重庆
400038;
2
第二军医大学海医系
防化教研室
,
上海
200433
)
提 要
:
目的 检测硫芥对小鼠淋巴瘤
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞的诱变性。方法 采用
96
孔微孔板接种法检测平板
接种效率和突变频率。结果 硫芥可诱导
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞
tk
位点的突变
,
诱发突变是自发突变的
2
～
15
倍。在
tk
位点诱发了大克隆和小克隆两种不同表型的突变集落
,
以小克隆为主。结论 硫芥有明确的致突变性和较强的细胞毒
21
性
,
产生了大范围的
DNA
损伤。
关键词
:
tk
;
基因
;
突变
;
硫芥
中图法分类号
:R394;R73
2
354;R827.174
文献标识码
:A
tk
genemutationofL5178Ycellsinducedbysulfurmustard
12211
LIQi
2
hui,ZHUMing
2
xue,ZHANGLi
2
ming,DONGZhao
2
jun
(
DepartmentofMilitaryToxicology,CollegeofPreventive
Medicine,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038;DepartmentofNavyMedicine,SecondMilitaryMedical
University,Shanghai200433,China
)
2
Abstract:Objective
Todetectthemutagenicityofsulfurmustardinthe
tk
geneofL5178Y3.7.2c
2
tk
s
Theplatingefficiencyandthemutantfrequencyweredetectedbythemicrotiter
s
Sulfurmustardinduced
tk
locusmutationwithmutationfrequency2-15timeshigherthanthat
+
Π
-
ofspontaneousmutationfrequencyofL5178Y3.7.2c
2
tk
eretwodifferentphenotypesofmutation
coloniesinduced,whichwerelargeandsmallcolonies,sion
Sulfur
poundmayresultinlargerangeof
DNAdamage.
Keywords:
tk
;gene;mutation;sulfurmustard
tk
基因突变试验是一种国外已广泛使用的体外
短期致突变实验。它能够检出包括点突变、大的缺失、
重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内
1
的多种遗传改变。具有很高的灵敏度。小鼠淋巴瘤
+
Π
-
L5178Y3.7.2c
2
tk
细胞是
tk
基因突变试验的标准靶
2
细胞株。应用
L5178Y
细胞建立的小鼠淋巴瘤细胞
突变试验称之为
MLA
(
mouselymphomaassay
)
。硫芥是
3
一种重要的化学战剂
,
也是使用较多的药物。硫芥
4
中毒可对
DNA
产生强烈损伤。除了细胞毒作用外
,
5
硫芥可能尚具有遗传毒作用。本研究应用
MLA
评
价硫芥的致突变性
,
以期进一步阐明硫芥的遗传毒理
学基本特征
,
为探讨硫芥的遗传毒性以及可能的致肿
瘤作用机制提供一定的实验依据。
基金项目
:
全军医学科学技术研究“十五”计划指令性课题
(
01L054
)
SupportedbytheMandatoryScientificResearchProjectofthe
“
Tenth
2
five
YearPlan
”
ofPLA
(
01L054
)
+
Π
-
1
材料和方法
1
1
1
材料
1.1.1
实验用毒剂硫芥由军事医学科学院第六研究所提供
,
纯度为
97.5%,
用
1,3
2丙二醇配成
3%
母液
,
实验当日用无菌生
理盐水配成工作液使用。
1.1.2
细胞株
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞株由日本国立卫生
研究所惠赠。
1.1.3
主要试剂
RPMI1640
培养液为
Hyclone
公司产品
,
马
血清
(
horseserum
)
为
GIBCO
公司产品
,
次黄嘌呤
(
hypoxanthine
)
购自衢州化学工业公司
,
氨甲喋呤
(
aminopterin
)
、脱氧胞苷
(
de
2
oxycytidine
)
为瑞士进口产品
,
脱氧胸腺嘧啶核苷
(
thymidine
)
购自
中科院上海生化所
,
三氟胸苷
(
trifluorothymidine,TFT
)
及阳性
N
2
ethyl
2
N
2
nitrosourea
对照
(
ENU
)
均为
Sigma
公司产品。
1
1
2
方法
1.2.1
细胞培养 采用
RPMI1640
培养液
,
加入
100U
Π
ml
青霉
素
,100
μ
g
Π
ml
链霉素和
200
μ
g
Π
ml
丙酮酸钠
,
另加
10%
、
20%
灭活马
血清作为生长培养基和集落培养基
,
分别用于细胞增殖和在
96
孔
培养板中培养细胞。细胞在含
5%CO
2
、
37
℃恒温培养箱中培养。
6
培养期间每天计数细胞
,
使细胞浓度不超过
1
1
5
×
10
Π
ml
。
作者简介
:
李奇慧
(
1976-
)
,
女
,
黑龙江省肇东市人
,
硕士研究生
,
主治医师
,
主要从事遗传毒理学方面的研究。电话
:
(
023
)
68752356
通信作者
:
董兆君
,
电话
:
(
023
)
68752285
收稿日期
:2003
2
10
2
31;
修回日期
:2003
2
12
2
28
第
16
期 李奇慧
,
等1硫芥诱导
L5178Y
细胞
tk
基因突变的研究
1427
1.2.2
自发突变细胞的清除 将对数增长期的细胞配制成
3
×
10
5
Π
ml,100ml,
加入
1ml100
×
THMG,
培养
24h
后离心细胞
(
800r
Π
min,5min
)
,
弃去上清
,
加入新培养基
,
配制成
1
×
10
5
～
3
×
10
5
Π
ml
(
100ml
以上
)
。加入
1%
量的
100
×
THG,
培养
2d,
注意
避免过度培养。
1.2.3
硫芥剂量设计实验
(
doserangefindingtest
)
剂量设计
实验在与正式实验相同的条件下处理细胞
,
处理后
2d
(
48h
)
每
天测定细胞浓度
,
求算细胞日细胞增长率
(
DCG
)
和相对增殖率
(
RSG
)
。将使细胞增殖率为阴性对照组的
10%
～
20%
剂量设为
最高剂量
,
其它剂量从最高剂量以等比或等差设定。同时设溶
剂对照组。
1.2.4
诱变实验
1.2.4.1
染毒处理 将处于对数增长期的细胞用
RPMI10
培养基配成
10
6
Π
ml
(
1
次处理约需
10
7
个细胞
)
,
按细胞悬液
:RP
2
MI10
∶培养基∶
150mmol
Π
LKCl
∶硫芥
=10
∶
8.8
∶
1
∶
0.2
的比例配
制受试物混合液。将
20ml
容量的受试物混合液置
37
℃处理
3
h,
然后用无血清培养液洗涤细胞
2
次
,
重新悬浮于
RPMI10
培
养基中
,
将细胞浓度调整为
2
×
10
5
Π
ml,
进行
48h
的表达培养
,
期间每天计数细胞浓度
,
同时计算
DCG
、
RSG
。
1.2.4.2
平板接种效率
(
PE0
)
测定 取少量经染毒处理的
细胞
,
逐步稀释至细胞密度为
8
个Π
ml,
接种于
96
孔板
,
每孔
0.2
ml,
即平均每孔约
1.6
个细胞。在
5%CO
2
、
37
℃
,
饱和湿度下
培养
12
～
14d,
计数每块平板有集落生长的孔数。
1.2.4.3
表达
2d
的平板接种效率
(
PE2
)
和
TFT
抗性突变频率
(
MF
)
测定 将经过
2d
表达培养的细胞用
RPMI20
培养基调
整为
1
×
10
4
Π
ml,
取少量逐步稀释至
8
个Π
ml,
于
96
孔板中每孔接
种
0.2ml,
按照
PE0
方法接种
,
每孔
1.6
个细胞。将剩余之细胞
(
1
×
10
4
Π
ml
)
加入
TFT,
使
TFT
终浓度为
3
μ
g
Π
ml,
混匀后接种于
96
孔板
,
每孔
0.2ml,
即每孔约
2000
个细胞。每个剂量作
2
个
平行板。培养
12
～
14d
后
,
分别计数有大小克隆生长的孔数。
据此计算出突变频率
(
MF
)
。
1
1
3
统计学方法
按照泊松分布计算平板接种效率和突变频率
6
。
2
结果
2
1
1
硫芥剂量设计实验结果
硫芥剂量设计实验结果见表
1
。在硫芥终浓度为
10
、
15
、
20
、
25
、
30
μ
mol
Π
L
时
,L5178Y
细胞的相对悬浮增长率
(
RSG
)
分别
为
93.4%,65.8%,47.3%,31.0%,22.5%
。符合剂量设计要求。
表
1
硫芥处理
L5178Y
细胞后的日细胞增长率
(DCG)
和相对悬浮
生长率
(RSG)
Tab1
Dailycellgrowth(DCG)andrelativesuspensiongrowth
(RSG)ofL5178Ycellstreatedwithsulfurmustard
Concentrationof
DCG
sulfurmustand
d0d1d2
μ
(
mol
Π
L
)
cellnumbercellnumbercellnumber
d1d2
RSG
(
%
)
0
2
×
10
5
9.17
×
10
5
14.11
×
10
5
4.597.06100
10
2
×
10
5
7.53
×
10
5
16.05
×
10
5
3.778.0393.4
15
2
×
10
5
7.17
×
10
5
11.83
×
10
5
3.595.9165.8
20
2
×
10
5
6.33
×
10
5
9.72
×
10
5
3.174.8647.3
25
2
×
10
5
4.94
×
10
5
8.11
×
10
5
2.474.0631.0
30
2
×
10
5
3.89
×
10
5
7.50
×
10
5
1.953.7522.5
2
1
2
硫芥对
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞的细胞毒作用
硫芥对
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞的毒性作用见表
2
。随着
染毒剂量的增加
,
细胞接种效率
(
PE0
)
、相对存活率
(
RS
)
、相对
悬浮增长率
(
RSG
)
、总相对增长率
(
RTG
)
均相应下降
(
图
1
)
。
表
2
硫芥与
L5178Y
细胞毒性指标之间的关系
(%)
Tab2
RelationshipofPE0,RS,andRTGwithconcentrationofsulfur
mustard(%)
Concentrationofsulfur
mustand
μ
(
mol
Π
L
)
PE0RS0RSGRTG
086.6100.0100.0100.0
1070.681.593.449.0
1542.048.565.826.0
2019.722.747.315.2
259.911.431.06.2
309.110.522.55.0
ENU
(
10
μ
g
Π
ml
)
54.763.233.117.4
图
1
硫芥
3h
处理后
L5178Y
细胞的细胞毒性与突变频率
Fig1
Cytotoxicityrepresentedbyrelativesurvival(RS0),relative
suspensiongrowth(RSG),andmutationfrequency(MF)at
the
tk
locusinL5178Ycellstreatedwithsulfurmustardfor3h
2
1
3
硫芥诱发
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞
tk
基因突变
率的变化情况
由表
3
可知
,
随硫芥剂量的增加
,
tk
基因的突变频率亦随
之增加。硫芥诱发的突变频率是自发突变频率的
2
～
15
倍
,
为
明确的阳性结果。观察到两种表型的突变集落
,
即大集落
(
largecolony
)
和小集落
(
smallcolony
)
。大集落超过微孔直径的
1
Π
4,
呈薄层分布
,
小集落在微孔直径的
1
Π
4
以下
,
致密
,
呈块状
分布
(
图
2
)
。硫芥对
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞
tk
位点的诱发突
变主要以小克隆为主。
表
3
硫芥对
L5178Y
细胞
tk
基因的致突变性
Tab3
tk
genemutationfrequency(MF)andpercentageofsmall
coloniesinducedbysulfurmustardinL5178Ycells
Concentrationof
Sulfurmustrad
μ
(
mol
Π
L
)
PE2
(
%
)
RS2
(
%
)
MF
(
×
10
-5
)
SC
(
%
)
0127100.010.951.6
1066.752.531.046.2
1550.239.544.456.5
2040.832.176.358.4
2525.319.9165.773.4
3028.322.3120.669.5
ENU
(
10
μ
g
Π
ml
)
66.752.551.272.6
第 三 军 医 大 学 学 报 第
26
卷
1428
A:Smallcolony;B:Largecolony
图
2
96
孔平板微孔底部生长的突变
L5178Y
细胞大、小克隆
(
×
400
)
Fig2
ThelargeandsmallcoloniesofmutantL5178Ycellsgrewatthe
bottomsof96
2
wellcultureplate
(
×
400
)
3
讨论
硫芥因其理化性质稳定
,
毒性大
,
穿透性强
,
作用隐
蔽
,
持久性大等特点
,
备受外军青睐
,
是外军装备的最重
要的化学战剂之一和医学防护研究对象
7
。硫芥是一
种烷化作用很强的化合物
,
曾经作为候选抗癌药物进行
动物实验
8
。但长期接触硫芥的生产工人上呼吸道癌
症发生率增加
9
,
接触硫芥的渔民外周血淋巴细胞姐妹
染色单体交换率升高
10
。这些资料提示
,
硫芥很可能具
有遗传毒性的远期危害。本实验选择检测范围广泛的
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞为实验材料
,
研究了硫芥的致
突变作用。结果显示
:
3.1
硫芥的细胞毒作用特点
由表
2
和图
1
数据可以看出
,
细胞培养体系中加入
硫芥后
,L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞的接种效率
(
PE0
)
、相
对存活率
(
RS
)
、相对悬浮增长率
(
RSG
)
和总相对增长率
(
RTG
)
均下降
,
硫芥剂量越大
,
上述指标的下降越明显
,
提示硫芥具有明显的细胞毒作用
,
与杨清武等
11
报道的
淋巴细胞实验结果相吻合。
3.2
硫芥诱导
tk
基因突变的特点
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞接触硫芥
3h
即导致
tk
基
因突变。在
10
～
30
μ
mol
Π
L
剂量范围内
,
硫芥浓度愈大
,
tk
基因突变率愈高
(
图
1
)
。硫芥浓度为
25
μ
mol
Π
L
剂量
时
,
tk
基因突变频率高于对照组的
14
倍
,
说明硫芥有明
确的致突变性。但当硫芥浓度增至
30
μ
mol
Π
L
时
,
突变
频率未见继续增加
,
其原因尚不明了
,
推测可能与硫芥
的烃化作用所造成的细胞坏死或凋亡
12
有关。
Storer
等
13
报道
,L5178Y
tk
+
Π
-
细胞的
tk
基因突变可能伴有
p53
基因突变
,
后者与细胞凋亡的关系正日益得到证实。
3.3
硫芥诱导的
tk
基因突变体以小克隆为主
MLA
大、小克隆形成的机制尚不十分清楚
,
但初步
认为与遗传损伤轻重程度相关。有研究表明
14
,
大克隆
较少发生染色体异常
,
而小克隆可检测到染色体重排
(
缺失、重组
)
等改变。本实验观察到的经硫芥诱导的
tk
基因突变集落以小克隆为主
,
说明存在着大范围的
DNA
损伤。但对于硫芥的致突机制及大、小克隆突变体细胞
的分子生物学及细胞遗传学改变仍有待于进一步深入
研究。
综上所述
,
硫芥能诱发小鼠淋巴瘤
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞
tk
基因突变
,
有明确的致突变性和较强的细
胞毒性。有关的机制尚需深入研究。
(
致谢
:
本实验得到第三军医大学预防医学院卫生毒理学教
研室刘晋 副主任和刘胜学、杨录军、周燕红、袁健、贾庆军等老
师的热情指导和帮助
,
在此深表谢意
!
)
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tk
+
Π
-
celllineisheterozygousforacodon170mutationinthep53
es,1997,373
(
2
)
:157-165.
14LiechtyMC,ScalziJM,SimsKR,
etal
.Analysisoflargeandsmallcol
2
onyL5178Y
tk
-
Π
-
mouselymphomamutantsbylossofheterozygosity
(
LOH
)
andbywholechromosome11painting:
2
tagenesis,1998,13
(
5
)
:461-474.
(
编辑 陈聪连
)
2024年11月3日发(作者：库书艺)
1426
第
26
卷第
16
期第 三 军 医 大 学 学 报
Vol.26,No.16
2004
年
8
月
ACTA
ACADEMIAE
MEDICINAE
MILITARIS
TERTIAEAug.2004
论著
12
文章编号
:1000
2
5404
(
2004
)
16
2
1426
2
03
硫芥诱导
L5178Y
细胞
tk
基因突变的研究
李奇慧
,
朱明学
,
张黎明
,
董兆君
(
1
第三军医大学预防医学院军事毒理学教研室
,
重庆
400038;
2
第二军医大学海医系
防化教研室
,
上海
200433
)
提 要
:
目的 检测硫芥对小鼠淋巴瘤
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞的诱变性。方法 采用
96
孔微孔板接种法检测平板
接种效率和突变频率。结果 硫芥可诱导
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞
tk
位点的突变
,
诱发突变是自发突变的
2
～
15
倍。在
tk
位点诱发了大克隆和小克隆两种不同表型的突变集落
,
以小克隆为主。结论 硫芥有明确的致突变性和较强的细胞毒
21
性
,
产生了大范围的
DNA
损伤。
关键词
:
tk
;
基因
;
突变
;
硫芥
中图法分类号
:R394;R73
2
354;R827.174
文献标识码
:A
tk
genemutationofL5178Ycellsinducedbysulfurmustard
12211
LIQi
2
hui,ZHUMing
2
xue,ZHANGLi
2
ming,DONGZhao
2
jun
(
DepartmentofMilitaryToxicology,CollegeofPreventive
Medicine,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038;DepartmentofNavyMedicine,SecondMilitaryMedical
University,Shanghai200433,China
)
2
Abstract:Objective
Todetectthemutagenicityofsulfurmustardinthe
tk
geneofL5178Y3.7.2c
2
tk
s
Theplatingefficiencyandthemutantfrequencyweredetectedbythemicrotiter
s
Sulfurmustardinduced
tk
locusmutationwithmutationfrequency2-15timeshigherthanthat
+
Π
-
ofspontaneousmutationfrequencyofL5178Y3.7.2c
2
tk
eretwodifferentphenotypesofmutation
coloniesinduced,whichwerelargeandsmallcolonies,sion
Sulfur
poundmayresultinlargerangeof
DNAdamage.
Keywords:
tk
;gene;mutation;sulfurmustard
tk
基因突变试验是一种国外已广泛使用的体外
短期致突变实验。它能够检出包括点突变、大的缺失、
重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内
1
的多种遗传改变。具有很高的灵敏度。小鼠淋巴瘤
+
Π
-
L5178Y3.7.2c
2
tk
细胞是
tk
基因突变试验的标准靶
2
细胞株。应用
L5178Y
细胞建立的小鼠淋巴瘤细胞
突变试验称之为
MLA
(
mouselymphomaassay
)
。硫芥是
3
一种重要的化学战剂
,
也是使用较多的药物。硫芥
4
中毒可对
DNA
产生强烈损伤。除了细胞毒作用外
,
5
硫芥可能尚具有遗传毒作用。本研究应用
MLA
评
价硫芥的致突变性
,
以期进一步阐明硫芥的遗传毒理
学基本特征
,
为探讨硫芥的遗传毒性以及可能的致肿
瘤作用机制提供一定的实验依据。
基金项目
:
全军医学科学技术研究“十五”计划指令性课题
(
01L054
)
SupportedbytheMandatoryScientificResearchProjectofthe
“
Tenth
2
five
YearPlan
”
ofPLA
(
01L054
)
+
Π
-
1
材料和方法
1
1
1
材料
1.1.1
实验用毒剂硫芥由军事医学科学院第六研究所提供
,
纯度为
97.5%,
用
1,3
2丙二醇配成
3%
母液
,
实验当日用无菌生
理盐水配成工作液使用。
1.1.2
细胞株
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞株由日本国立卫生
研究所惠赠。
1.1.3
主要试剂
RPMI1640
培养液为
Hyclone
公司产品
,
马
血清
(
horseserum
)
为
GIBCO
公司产品
,
次黄嘌呤
(
hypoxanthine
)
购自衢州化学工业公司
,
氨甲喋呤
(
aminopterin
)
、脱氧胞苷
(
de
2
oxycytidine
)
为瑞士进口产品
,
脱氧胸腺嘧啶核苷
(
thymidine
)
购自
中科院上海生化所
,
三氟胸苷
(
trifluorothymidine,TFT
)
及阳性
N
2
ethyl
2
N
2
nitrosourea
对照
(
ENU
)
均为
Sigma
公司产品。
1
1
2
方法
1.2.1
细胞培养 采用
RPMI1640
培养液
,
加入
100U
Π
ml
青霉
素
,100
μ
g
Π
ml
链霉素和
200
μ
g
Π
ml
丙酮酸钠
,
另加
10%
、
20%
灭活马
血清作为生长培养基和集落培养基
,
分别用于细胞增殖和在
96
孔
培养板中培养细胞。细胞在含
5%CO
2
、
37
℃恒温培养箱中培养。
6
培养期间每天计数细胞
,
使细胞浓度不超过
1
1
5
×
10
Π
ml
。
作者简介
:
李奇慧
(
1976-
)
,
女
,
黑龙江省肇东市人
,
硕士研究生
,
主治医师
,
主要从事遗传毒理学方面的研究。电话
:
(
023
)
68752356
通信作者
:
董兆君
,
电话
:
(
023
)
68752285
收稿日期
:2003
2
10
2
31;
修回日期
:2003
2
12
2
28
第
16
期 李奇慧
,
等1硫芥诱导
L5178Y
细胞
tk
基因突变的研究
1427
1.2.2
自发突变细胞的清除 将对数增长期的细胞配制成
3
×
10
5
Π
ml,100ml,
加入
1ml100
×
THMG,
培养
24h
后离心细胞
(
800r
Π
min,5min
)
,
弃去上清
,
加入新培养基
,
配制成
1
×
10
5
～
3
×
10
5
Π
ml
(
100ml
以上
)
。加入
1%
量的
100
×
THG,
培养
2d,
注意
避免过度培养。
1.2.3
硫芥剂量设计实验
(
doserangefindingtest
)
剂量设计
实验在与正式实验相同的条件下处理细胞
,
处理后
2d
(
48h
)
每
天测定细胞浓度
,
求算细胞日细胞增长率
(
DCG
)
和相对增殖率
(
RSG
)
。将使细胞增殖率为阴性对照组的
10%
～
20%
剂量设为
最高剂量
,
其它剂量从最高剂量以等比或等差设定。同时设溶
剂对照组。
1.2.4
诱变实验
1.2.4.1
染毒处理 将处于对数增长期的细胞用
RPMI10
培养基配成
10
6
Π
ml
(
1
次处理约需
10
7
个细胞
)
,
按细胞悬液
:RP
2
MI10
∶培养基∶
150mmol
Π
LKCl
∶硫芥
=10
∶
8.8
∶
1
∶
0.2
的比例配
制受试物混合液。将
20ml
容量的受试物混合液置
37
℃处理
3
h,
然后用无血清培养液洗涤细胞
2
次
,
重新悬浮于
RPMI10
培
养基中
,
将细胞浓度调整为
2
×
10
5
Π
ml,
进行
48h
的表达培养
,
期间每天计数细胞浓度
,
同时计算
DCG
、
RSG
。
1.2.4.2
平板接种效率
(
PE0
)
测定 取少量经染毒处理的
细胞
,
逐步稀释至细胞密度为
8
个Π
ml,
接种于
96
孔板
,
每孔
0.2
ml,
即平均每孔约
1.6
个细胞。在
5%CO
2
、
37
℃
,
饱和湿度下
培养
12
～
14d,
计数每块平板有集落生长的孔数。
1.2.4.3
表达
2d
的平板接种效率
(
PE2
)
和
TFT
抗性突变频率
(
MF
)
测定 将经过
2d
表达培养的细胞用
RPMI20
培养基调
整为
1
×
10
4
Π
ml,
取少量逐步稀释至
8
个Π
ml,
于
96
孔板中每孔接
种
0.2ml,
按照
PE0
方法接种
,
每孔
1.6
个细胞。将剩余之细胞
(
1
×
10
4
Π
ml
)
加入
TFT,
使
TFT
终浓度为
3
μ
g
Π
ml,
混匀后接种于
96
孔板
,
每孔
0.2ml,
即每孔约
2000
个细胞。每个剂量作
2
个
平行板。培养
12
～
14d
后
,
分别计数有大小克隆生长的孔数。
据此计算出突变频率
(
MF
)
。
1
1
3
统计学方法
按照泊松分布计算平板接种效率和突变频率
6
。
2
结果
2
1
1
硫芥剂量设计实验结果
硫芥剂量设计实验结果见表
1
。在硫芥终浓度为
10
、
15
、
20
、
25
、
30
μ
mol
Π
L
时
,L5178Y
细胞的相对悬浮增长率
(
RSG
)
分别
为
93.4%,65.8%,47.3%,31.0%,22.5%
。符合剂量设计要求。
表
1
硫芥处理
L5178Y
细胞后的日细胞增长率
(DCG)
和相对悬浮
生长率
(RSG)
Tab1
Dailycellgrowth(DCG)andrelativesuspensiongrowth
(RSG)ofL5178Ycellstreatedwithsulfurmustard
Concentrationof
DCG
sulfurmustand
d0d1d2
μ
(
mol
Π
L
)
cellnumbercellnumbercellnumber
d1d2
RSG
(
%
)
0
2
×
10
5
9.17
×
10
5
14.11
×
10
5
4.597.06100
10
2
×
10
5
7.53
×
10
5
16.05
×
10
5
3.778.0393.4
15
2
×
10
5
7.17
×
10
5
11.83
×
10
5
3.595.9165.8
20
2
×
10
5
6.33
×
10
5
9.72
×
10
5
3.174.8647.3
25
2
×
10
5
4.94
×
10
5
8.11
×
10
5
2.474.0631.0
30
2
×
10
5
3.89
×
10
5
7.50
×
10
5
1.953.7522.5
2
1
2
硫芥对
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞的细胞毒作用
硫芥对
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞的毒性作用见表
2
。随着
染毒剂量的增加
,
细胞接种效率
(
PE0
)
、相对存活率
(
RS
)
、相对
悬浮增长率
(
RSG
)
、总相对增长率
(
RTG
)
均相应下降
(
图
1
)
。
表
2
硫芥与
L5178Y
细胞毒性指标之间的关系
(%)
Tab2
RelationshipofPE0,RS,andRTGwithconcentrationofsulfur
mustard(%)
Concentrationofsulfur
mustand
μ
(
mol
Π
L
)
PE0RS0RSGRTG
086.6100.0100.0100.0
1070.681.593.449.0
1542.048.565.826.0
2019.722.747.315.2
259.911.431.06.2
309.110.522.55.0
ENU
(
10
μ
g
Π
ml
)
54.763.233.117.4
图
1
硫芥
3h
处理后
L5178Y
细胞的细胞毒性与突变频率
Fig1
Cytotoxicityrepresentedbyrelativesurvival(RS0),relative
suspensiongrowth(RSG),andmutationfrequency(MF)at
the
tk
locusinL5178Ycellstreatedwithsulfurmustardfor3h
2
1
3
硫芥诱发
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞
tk
基因突变
率的变化情况
由表
3
可知
,
随硫芥剂量的增加
,
tk
基因的突变频率亦随
之增加。硫芥诱发的突变频率是自发突变频率的
2
～
15
倍
,
为
明确的阳性结果。观察到两种表型的突变集落
,
即大集落
(
largecolony
)
和小集落
(
smallcolony
)
。大集落超过微孔直径的
1
Π
4,
呈薄层分布
,
小集落在微孔直径的
1
Π
4
以下
,
致密
,
呈块状
分布
(
图
2
)
。硫芥对
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞
tk
位点的诱发突
变主要以小克隆为主。
表
3
硫芥对
L5178Y
细胞
tk
基因的致突变性
Tab3
tk
genemutationfrequency(MF)andpercentageofsmall
coloniesinducedbysulfurmustardinL5178Ycells
Concentrationof
Sulfurmustrad
μ
(
mol
Π
L
)
PE2
(
%
)
RS2
(
%
)
MF
(
×
10
-5
)
SC
(
%
)
0127100.010.951.6
1066.752.531.046.2
1550.239.544.456.5
2040.832.176.358.4
2525.319.9165.773.4
3028.322.3120.669.5
ENU
(
10
μ
g
Π
ml
)
66.752.551.272.6
第 三 军 医 大 学 学 报 第
26
卷
1428
A:Smallcolony;B:Largecolony
图
2
96
孔平板微孔底部生长的突变
L5178Y
细胞大、小克隆
(
×
400
)
Fig2
ThelargeandsmallcoloniesofmutantL5178Ycellsgrewatthe
bottomsof96
2
wellcultureplate
(
×
400
)
3
讨论
硫芥因其理化性质稳定
,
毒性大
,
穿透性强
,
作用隐
蔽
,
持久性大等特点
,
备受外军青睐
,
是外军装备的最重
要的化学战剂之一和医学防护研究对象
7
。硫芥是一
种烷化作用很强的化合物
,
曾经作为候选抗癌药物进行
动物实验
8
。但长期接触硫芥的生产工人上呼吸道癌
症发生率增加
9
,
接触硫芥的渔民外周血淋巴细胞姐妹
染色单体交换率升高
10
。这些资料提示
,
硫芥很可能具
有遗传毒性的远期危害。本实验选择检测范围广泛的
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞为实验材料
,
研究了硫芥的致
突变作用。结果显示
:
3.1
硫芥的细胞毒作用特点
由表
2
和图
1
数据可以看出
,
细胞培养体系中加入
硫芥后
,L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞的接种效率
(
PE0
)
、相
对存活率
(
RS
)
、相对悬浮增长率
(
RSG
)
和总相对增长率
(
RTG
)
均下降
,
硫芥剂量越大
,
上述指标的下降越明显
,
提示硫芥具有明显的细胞毒作用
,
与杨清武等
11
报道的
淋巴细胞实验结果相吻合。
3.2
硫芥诱导
tk
基因突变的特点
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞接触硫芥
3h
即导致
tk
基
因突变。在
10
～
30
μ
mol
Π
L
剂量范围内
,
硫芥浓度愈大
,
tk
基因突变率愈高
(
图
1
)
。硫芥浓度为
25
μ
mol
Π
L
剂量
时
,
tk
基因突变频率高于对照组的
14
倍
,
说明硫芥有明
确的致突变性。但当硫芥浓度增至
30
μ
mol
Π
L
时
,
突变
频率未见继续增加
,
其原因尚不明了
,
推测可能与硫芥
的烃化作用所造成的细胞坏死或凋亡
12
有关。
Storer
等
13
报道
,L5178Y
tk
+
Π
-
细胞的
tk
基因突变可能伴有
p53
基因突变
,
后者与细胞凋亡的关系正日益得到证实。
3.3
硫芥诱导的
tk
基因突变体以小克隆为主
MLA
大、小克隆形成的机制尚不十分清楚
,
但初步
认为与遗传损伤轻重程度相关。有研究表明
14
,
大克隆
较少发生染色体异常
,
而小克隆可检测到染色体重排
(
缺失、重组
)
等改变。本实验观察到的经硫芥诱导的
tk
基因突变集落以小克隆为主
,
说明存在着大范围的
DNA
损伤。但对于硫芥的致突机制及大、小克隆突变体细胞
的分子生物学及细胞遗传学改变仍有待于进一步深入
研究。
综上所述
,
硫芥能诱发小鼠淋巴瘤
L5178Y3.7.2c
2
tk
+
Π
-
细胞
tk
基因突变
,
有明确的致突变性和较强的细
胞毒性。有关的机制尚需深入研究。
(
致谢
:
本实验得到第三军医大学预防医学院卫生毒理学教
研室刘晋 副主任和刘胜学、杨录军、周燕红、袁健、贾庆军等老
师的热情指导和帮助
,
在此深表谢意
!
)
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,
董兆君
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魏相德
,
等
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编辑 陈聪连
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