2024年9月8日发(作者：山璞玉)
阳离子交换树脂如何进行前处理
你先用乙醇浸泡,然后用5%盐酸洗涤至强酸性,用蒸馏水洗涤至中性,在用5%氢氧化钠洗
涤至强碱性,然后水洗至中性,酸-水-碱-水,洗涤三次,然后洗涤至强酸性,蒸馏水洗涤至中性,
就可以使用了
732阳离子交换树脂的活化方法
阳离子交换树脂,可在体内活化活化.液用量为树脂体积的2倍.活化液用浓度为3.0MOL/L
的盐酸配制,以1.2-4.0M/H的流速通过树脂层，再采用体积为树脂体积的1-2倍、浓度为
2.0-2.5MOL/L的硫酸浸泡3H以上
732阳离子交换树脂如何转型
阳树脂分弱树脂和强树脂两大类。分子式H-R（当然也可以是Na-R型）, H就是氢离子。
树脂高度约0.8米到1.6米。当水从上向下，通过树脂层时，水中的阳离子与树脂的H离子
发生交换，树脂最上层是铁钙镁离子，接着是钾钠氨离子。
出水水质是酸性的，PH值一般小于3。当运行约一天左右时，出水开始出现钠离子，表示反
应到了终点，需要用酸（HCl）反洗，将钠钙离子再置换出来。
再生方法是用水泡3天在加7%盐酸泡2天然后用的，盐酸是36%分析纯的。
刚开始的时候应该先用10%食盐水泡一天，再用水洗至清液，然后用7%盐酸泡一天，用水
洗到中性
谷氨酸等电点3.22
实验四绿豆芽中酸性磷酸脂酶的提取
磷酸酯酶临床试用于迁延性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、心血管系统疾病、
胶原性硬皮病、小儿顽固性牛皮癣、再生性障碍性贫血、白血球减少症及矽肺的
辅助治疗，对于促进或调节人体的正常代谢及以上疾病有较好疗效，且无副作用。
酸性磷酸酯酶（Acid pHospHatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，
植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂
的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。它能专一性水解磷酸单酯键。本实
验选用绿豆芽做材料，运用一系列的提取手段，从中提取磷酸脂酶。
一、实验目的
系统地学习酸性磷酸酯酶粗酶液的制备方法
二、实验原理
绿豆芽细胞破裂后，磷酸脂酶溶于水中，离心分离后得磷酸脂酶原液。
三、实验材料
绿豆芽
四、仪器设备
冷冻离心机、研缸、冰箱
五、实验器皿
石英砂、50容量瓶、冰盘、剪刀、纱布
六、实验步骤
1、萌发5天的绿豆芽，剪去叶、根和头部，取豆芽茎，蒸馏水洗净，置吸
水纸上吸干表面水分，准确称取25g，剪成小段，置研缸中，加少量蒸馏水及少
许石英砂，在冰盘中研磨成匀浆。
2、将绿豆芽匀浆用纱布过滤，去残渣，滤液置冰箱中静置1h充分提取，然
后滤液再6000r/min冷冻离心20—30min，弃去沉淀，上清液再过滤至50ml容量
瓶中，用蒸馏水沉淀至50ml，所得澄清原酶液置冰箱备用。
七、思考题
提取酶活时，为减少酶活损失，操作时有哪些注意点？
实验六pH 对酶活力的影响——最适pH 的测定
影响酶促反应的因素有底物的浓度、温度、pH、抑制剂及激活剂。
pH 对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的pH 即酶的最适
pH，因为通常各种酶只在一定pH范围内才表现它的活力；一种酶在不同pH条
件下所表现出来的活性不同。
pH 之所以对酶活性有很大影响，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基
团的解离状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态，最适于酶与底物
的结合；而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团解离状态不利于酶与底物的
结合，酶活力也相应降低。pH 也可影响底物的解离及反应系统中其它组分的解
离。缓冲系统的离子性质和离子强度，也可能对酶反应产生影响。另外，pH 除
了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有很大影响。过高过低的pH会改变
酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。
一、实验目的
1.本实验考察pH对酶活力的影响；
2.通过pH~酶活力曲线得制作，求出酸性磷酸脂酶的最适pH。
二、实验原理
本实验通过配置一系列不同pH值的缓冲试剂，再将酶加入各缓冲试剂中，
以维持一定的pH值，再分别加入底物β—甘油磷酸钠，酶使β—甘油磷酸钠催
化水解成β—甘油和磷酸氢根离子，反应一定时间后，加入10%三氯乙酸终止反
应。再加入定磷试剂，磷酸氢根离子与定磷试剂反应生成钼蓝，产生的钼蓝在
660纳米处有最大吸收，吸光度的大小在一定范围内与无机磷酸含量成正比，因
此可用光密度O.D 值代替酶活性，作出O.D~pH 曲线，从曲线上可知表现其最
高活力时所处的最适pH值。
三、实验材料
酸型磷酸脂酶原液
四、仪器设备
恒温水浴槽、秒表、721型分光温度计；
五、实验药剂
_________（1）0.01Mβ—甘油磷酸钠；
（2）0.1NHCl；
21
(3) 8.5%NaCl溶液；
(4) 10%三氯乙酸；
(5) 0.143M巴比妥—醋酸钠溶液:称取4.875gNaAc?3H2O 和7.357g巴比妥钠，溶
于500ml蒸馏水中。
(6)系列pH值巴比妥-醋酸缓冲液:取25ml容量瓶6个，各加入5ml0.143M巴比
妥-醋酸钠溶液和2ml8.5% NaCl溶液，再按下表加入0.1N HCl，摇匀后，用pH
计测定pH值，并用0.5 N HCl或0.5N NaOH 调节至所需pH值，最后用蒸馏水
定容至刻度。
pH 0.1 N HCl(ml) pH 0.1 N HCl(ml)
3.5 15.0 5.0 8.0
4.0 12.0 5.5 7.0
4.5 10.0 6.0 6.0
六、实验步骤
取12 支10ml 离心管，编号，按下表操作:
pH3.5 pH4.0 pH4.5 试管编号pH5.0 pH5.5 pH6.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
巴比妥-醋酸缓冲液（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
酶液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10%三氯乙酸（ml） 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0
摇匀后，在35℃水浴中保温5min
β-甘油磷酸钠（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
摇匀后，在35℃水浴中准确反应10min
10%三氯乙酸（ml） 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0
取出后，冷却至室温，4000r/min离心5min备用。
取12支10ml刻度试管，编号，按照下表加入对应酶反应液和试剂，摇匀后，
在45℃水浴中保温20min；以奇数管为对照，测出偶数管的值。
试管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对应酶反应液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
定磷试剂3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
O.D660
七、实验结果与分析
以酶活力(O.D600值代替)为纵坐标，pH值为横坐标，绘出O.D600~pH曲线，
求出最适pH。
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八、思考题
pH值影响酶催化的机理是什么？
23
实验七温度对酶活力的影响—最适温度的测定
温度对酶活力的影响有双重作用。一方面，温度加速酶反应的速度；另一方
面，酶是蛋白质，温度升高会加速酶蛋白的变性。因此，在较低范围内酶反应速
度随温度升高而增大；超过一定温度后，反应速度下降，酶反应速度达到最大值
时的温度称最适温度。如果保持其他反应条件恒定，而在一系列变化的温度下测
酶活力，再以温度为横坐标，酶活性为纵坐标作图，可得一条温度—酶活力曲线，
从中可求得最适温度。
一、实验目的
通过温度~酶活力曲线的制作，求出酸性磷酸脂酶表现活力的最适温度
二、实验原理
本实验通过将酶加入pH5.0的巴比妥-醋酸缓冲液中，以维持一定的pH值，
再将试管分别放在一系列温度的恒温水浴槽中保温，加入底物β—甘油磷酸钠，
酶使β—甘油磷酸钠催化水解成β—甘油和磷酸氢根离子，反应一定时间后，加
入10%三氯乙酸终止反应。再加入定磷试剂，磷酸氢根离子与定磷试剂反应生成
钼蓝，产生的钼蓝在660nm 处有最大吸收，吸光度的大小在一定范围内与无机
磷含量成正比，因此可用光密度O.D660值代替酶活性，作出O.D660～温度曲线，
从曲线上可知表现最高活力时所处的最适温度值。
三、实验材料
酸性磷酸酯酶原液
四、仪器设备
恒温水浴槽，秒表，721型分光光度计；
五、实验试剂
(1)0.01Mβ—甘油磷酸钠；
(2)0.1NHCl；
(3)8.5%NaCl溶液；
(4)10%三氯乙酸；
(5)0.143M巴比妥-醋酸钠缓冲液（参见实验六）。
(6)pH5.0巴比妥-醋酸缓冲液（参见实验六）
六、实验步骤
取12支10ml离心管，编号，按表操作:
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试管编号25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 45℃ 50℃
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
巴比妥-醋酸缓冲液（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
酶液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10%三氯乙酸（ml） 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0
摇匀后，在分别在一定温度的水浴槽中保温5min
β-甘油磷酸钠（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
摇匀后，在一定温度的恒温水浴槽中准确反应10min
10%三氯乙酸（ml） 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0
取出后，冷却至室温，4000rpm离心5min备用。
取12支10ml刻度试管，编号，按下表加入对应酶反应液和试剂，摇匀后，
在45℃水浴中保温20min；以奇数管为对照，测出偶数管的O.D值。
试管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对应酶反应液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
定磷试剂3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
O.D660
七、实验结果与分析
以酶活力(O.D600 值代替)为纵坐标，温度为横坐标，绘出O.D600～温度曲
线，求出最适温度。
八、思考题
本实验中如何保证酶反应的时间的准确度？
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实验八酶促反应与时间的关系——初速度时间范围的测定
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时
间范围内选择，可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。所谓进程
曲线是指酶反应时间与产物生成量（或底物减少量）的关系曲线是在酶反应的最
适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以反应时间为横坐标，产物生
成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知在启始一段时间内曲线为直线，其斜率
代表初速度；随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真
实反应初酶活力大小，就应在初速度时间内进行测定。
一、实验目的
通过酶促反应与时间关系进程曲线制作，求初酸性磷酸酯酶反应初速度时间
范围。
二、实验原理
通过将酶加入pH5.0巴比妥-醋酸的缓冲液中，在35℃保温5min，再分别加
入底物β-甘油磷酸钠，酶使β-甘油磷酸钠催化水解成β-甘油和磷酸氢根离子，
反应一定时间后，加入10%三氯乙酸终止反应。再加入定磷试剂，磷酸氢根离子
与定磷试剂反应生成钼蓝，钼蓝660nm 处吸光度的大小在一定范围内与无机磷
含量成正比，因此可用光密度O.D660 值代替产物生成量，作出O.D660～时间
曲线，从曲线上可求出酸性磷酸酯酶反应初速度时间范围。
三、实验材料
酸性磷酸酯酶原液
四、仪器设备
恒温水浴槽，秒表，721型分光光度计；
五、实验试剂
(1)0.01Mβ-甘油磷酸钠；
(2)0.1NHCl；
(3)8.5%NaCl溶液；
(4)10%三氯乙酸；
(5)0.143M巴比妥-醋酸钠缓冲液（参见实验六）；
(6)pH5.0巴比妥-醋酸缓冲液（参见实验六）
六、实验步骤
取12支10ml离心管，编号，按下表操作：
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试管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH5.0 巴比妥-醋酸缓冲液（ml）2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
酶液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
摇匀后，35℃预热5min
β-甘油磷酸钠（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
在 35℃水浴中准确反应
时间（min） 0 2 4 6 8 10 15 20 25 30 35 40
10%三氯乙酸（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
取出后，冷却至室温，4000rpm离心5min备用。
取12支10ml刻度试管，编号，按下表加入对应酶反应液室试剂，摇匀后，
在45℃水浴中保温20min；以1 号试管为对照，测出各管的值。
试_____管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对应酶反应液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
定磷试剂3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
O.D660
七、实验结果与分析
以产物生成量(O.D600 值代替)为纵坐标，时间为横坐标，绘出O.D600～时
间曲线，求出反应初速度时间范围。
八、思考题
初速度时间范围确定有何意义？
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实验九底物浓度和抑制剂对酶活力的影响
------Km和Ki 的测定
在酶学分析中，Km是酶的一个特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的
性质。Km 与底物浓度、酶浓度无关，而与pH、温度、离子强度等因素有关。
Km与Vmax的测定是酶学工作的基本内容之一。
抑制剂是影响酶促反应的因素之一，根据抑制剂与酶结合的特点可分：不可
逆抑制和可逆抑制两类。其中可逆抑制又可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争
性抑制和反竞争性抑制。
（1）竞争性抑制类型：酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表
现米氏常数K′m增加，Vmax不变：
V′= Vmax[S] / ( K′m+[S])
K′m = Km（1+[I]/Ki）
（2）非竞争性抑制类型：抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进
一步分解为产物，K′m不变，V′max下降：
V′= V′max[S] / ( K′m+[S])
V′= Vmax /（1+[I]/Ki）
（3）反竞争性抑制类型：抑制剂必须在酶和底物结合之后才能与酶形成复合
物，但此物不能分解为产物。K′m、K′max都发生变化：
V′= V′max[S] / ( K′m+[S])
V′max= Vmax /（1+[I]/Ki） K′m =（1+[I]/Ki）
测定Km、Vmax 一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是
Lineweaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/V 对1/[S]作图，
直线在横轴上的截距为-1/Km，纵轴上的截距为1/Vmax，从而可求Km与Vmax。
对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用作图法，求出Km、Ki、K′m，并利
用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。
一、实验目的
通过实验，学习和掌握抑制剂类型的判断以及Km和Ki、Vmax求得得方法
和原理。
二、实验原理
通过将酶加入的缓冲液中，以维持一定的pH值，再加入各种抑制剂，在35
℃保温5min，再分别加入底物β-甘油酸钠，酶催化β-甘油酸钠水解成甘油和磷
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酸氢根离子，反应10min 后，加入三氯乙酸终止反应。再加入定磷试剂，磷酸氢
根离子与定磷试剂反应生成钼蓝，产生的钼蓝在660nm 处有最大吸收，吸光度
的大小在一定范围内与无机磷含量成正比（每0.1 代表含磷是2.26ug），因此可
由光密度值知道产物生成量[P]，速度可用表示[P]/t，求出1/[S]、1/V，作出1/V～
1/[S]图，从曲线上查出－1/Km及1/Vmax，即可求出Km、Vmax。
三、实验材料
酸性磷酸酯酶原液
四、仪器设备
恒温水浴槽，秒表，721型分光光度计；
五、实验试剂
（1）0.01Mβ-甘油磷酸钠；
（2）0.1NHCl；
（3）8.5%NaCl溶液；
（4）10%三氯乙酸；
（5）7mMNa2C2O4；
（6）3.5mMNaF；
（7）pH5.0巴比妥－醋酸缓冲液（参见实验六）
六、实验步骤
取12支10ml离心管，编号，按下表操作：
空白无抑制剂Na2C2O4 NaF
试管编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
巴比妥－醋酸缓冲液(ml) 2.7 2.4 2.0 2.7 2.4 2.0 2.4 2.1 1.7 2.4 2.1 1.7
酶液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
7mMNa2C2O4(ml) 0.3 0.3 0.3
3.5mMNaF 0.3 0.3 0.3
10%三氯乙酸1.0 1.0 1.0
35℃保温5min
0.01Mβ-甘油磷酸钠0.3 0.6 1.0 0.3 0.6 1.0 0.3 0.6 1.0 0.3 0.6 1.0
35℃精确反应10min
10%三氯乙酸1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
取出后，冷却至室温，4000rpm离心5min备用。
取12支10ml刻度试管，编号，按下表加入对应酶反应液和试剂，摇匀后，
在45℃水浴中保温20min；以相应空白管为对照，测出各管的OD660 值。
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试管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对应管酶反应液(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
定磷试剂(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
OD660
[S]
V([P]/t)
1/[S]
1/[V]
七、数据处理
[S]=X×M/3.5
X：为底物加入的ml数；3.5：为反应液的体积；M：为加入时底物浓度；
[I]=Y×M/3.5
Y：加入抑制剂的ml数；N：加入抑制剂的浓度；
[P]=2.26/0.1×OD660(μg)
通过计算求得[S]、V、1/[S]、1/V 和I 等值，然后以1/V 为纵坐标，1/[S]为横坐
标，绘出1/V～1/[S]曲线，数条曲线作在同一图上，然后求Km、Vmax、Ki 等
值及抑制类型。
八、思考题
Km的大小能说明酶的什么性质？
实验五酸性磷酸酯酶的固定化
固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳
定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的
酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。酶的固定化方法有载体结合法、
交联法、共价偶联法及包埋法等。
载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。根据固定方式的不同，
这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。物理吸附法是指将
酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。离子结
合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载
体有离子交换树脂等。共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方
法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。
交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用
的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。
包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分
子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，后者
包埋成微胶囊型。
一、实验目的
了解磷酸酯酶固定化的原理及实验操作技术。
二、实验原理
利用吸附力、离子键、共价键等不同的联结方式，将酶与不溶性载体联结，
制成水不溶性酶。通过测定酶液固定前后的酶活可以计算酶固定化的效率。通过
测定固定化酶的活性，可测定固定化酶的酶活力回收率。
三、实验材料
绿豆芽（用于酸性磷酸酶临时制备）、活性炭
四、仪器设备
（一）全班共用：（ 1 ） 电力搅拌器1 台；（ 2 ）冷冻离心机4000~1000rpm
1 台；（ 3 ） 721 分光光度计2-4 台；（ 4 ）水浴箱2 台；（ 5 ）台式天
平（离心平衡用） 2 台；（ 6 ）大漏斗1个，纱布1块；（ 7）蒸馏水瓶（ 25L
或50L ） 1 个。
（二）每组配置：洗瓶1个，离心管（10ml）2根。
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五、玻璃器皿（以组为单位）
试管（ 6 ），100 ml 烧杯（ 1 ），吸管（ 2 ）、玻棒（ 1 ），移液管或移
液器5ml(1) 、1ml(2) 、0.5ml （ 1 ），漏斗（ 3），滤纸（ 3~6 ），容量
瓶100ml（1）
六、实验试剂
1、pH4.9巴比妥乙酸缓冲液
2、0.01Mβ-甘油磷酸钠
3、三氯醋酸：5%三氯醋酸
4、定磷试剂：（参见附录九）
七、实验步骤
1、粗酶液的制备
将生长5—7天绿豆芽去子叶和根，用蒸馏水洗数次，置吸水纸上吸干表面水
分。取50g，剪成小段，置研钵中加少量蒸馏水和少许石英砂，置冰盘中研成匀
浆。然后双层纱布过滤，滤液于10000r/min离心10min，取上清，蒸馏水定容到
50ml，备用。（酶液制备分四组）
2、酶液固定化
称取0.5g活性炭，经110℃活化0.5h，倒入盛有20ml粗酶液的烧杯中，间隙搅
动，处理10min。用滤纸滤出活性炭。
3、酶活力的测定
A、测定滤液、原酶液以及固定化后的活性炭（先称量滤纸滤出的活性炭总
重M，然后取0.2g用于酶活测定）的酶活。酶反应如下表所示：
试管号1（对照） 2（原酶液） 3（滤液） 4（固定化酶）
缓冲液 2 2 2 2
β-甘油磷酸钠0.5 0.5 0.5 0.5
蒸馏水1 1 1 1
三氯醋酸1 0 0 0
酶液0.5 0.5 0.5 0.2g固定酶
35℃反应10min
三氯醋酸0 1 1 1
第4管补加0.5ml酶液。
B、显色与比色按下表操作：
各管4000r/min离心10min后，取上清液显色。
19
1 2 3 4
反应管上清液1 1 1 1
蒸馏水2 2 2 2
定磷试剂3 3 3 3
45℃，保温20min
OD662
C、查标准曲线并计算酶活
酶活力单位：在上述条件下，以每分钟释放1μmol磷酸为一个酶单位。
八、计算
九、思考题
固定化效率和回收率大小说明什么问题？
注：活性碳活化与酶液的制备可以预先制备好，以保证一个上午可完成实验
磷酸mmol数?查表磷酸mmol*显色用反应液体积
反应液总体积?
2024年9月8日发(作者：山璞玉)
阳离子交换树脂如何进行前处理
你先用乙醇浸泡,然后用5%盐酸洗涤至强酸性,用蒸馏水洗涤至中性,在用5%氢氧化钠洗
涤至强碱性,然后水洗至中性,酸-水-碱-水,洗涤三次,然后洗涤至强酸性,蒸馏水洗涤至中性,
就可以使用了
732阳离子交换树脂的活化方法
阳离子交换树脂,可在体内活化活化.液用量为树脂体积的2倍.活化液用浓度为3.0MOL/L
的盐酸配制,以1.2-4.0M/H的流速通过树脂层，再采用体积为树脂体积的1-2倍、浓度为
2.0-2.5MOL/L的硫酸浸泡3H以上
732阳离子交换树脂如何转型
阳树脂分弱树脂和强树脂两大类。分子式H-R（当然也可以是Na-R型）, H就是氢离子。
树脂高度约0.8米到1.6米。当水从上向下，通过树脂层时，水中的阳离子与树脂的H离子
发生交换，树脂最上层是铁钙镁离子，接着是钾钠氨离子。
出水水质是酸性的，PH值一般小于3。当运行约一天左右时，出水开始出现钠离子，表示反
应到了终点，需要用酸（HCl）反洗，将钠钙离子再置换出来。
再生方法是用水泡3天在加7%盐酸泡2天然后用的，盐酸是36%分析纯的。
刚开始的时候应该先用10%食盐水泡一天，再用水洗至清液，然后用7%盐酸泡一天，用水
洗到中性
谷氨酸等电点3.22
实验四绿豆芽中酸性磷酸脂酶的提取
磷酸酯酶临床试用于迁延性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、心血管系统疾病、
胶原性硬皮病、小儿顽固性牛皮癣、再生性障碍性贫血、白血球减少症及矽肺的
辅助治疗，对于促进或调节人体的正常代谢及以上疾病有较好疗效，且无副作用。
酸性磷酸酯酶（Acid pHospHatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，
植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂
的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。它能专一性水解磷酸单酯键。本实
验选用绿豆芽做材料，运用一系列的提取手段，从中提取磷酸脂酶。
一、实验目的
系统地学习酸性磷酸酯酶粗酶液的制备方法
二、实验原理
绿豆芽细胞破裂后，磷酸脂酶溶于水中，离心分离后得磷酸脂酶原液。
三、实验材料
绿豆芽
四、仪器设备
冷冻离心机、研缸、冰箱
五、实验器皿
石英砂、50容量瓶、冰盘、剪刀、纱布
六、实验步骤
1、萌发5天的绿豆芽，剪去叶、根和头部，取豆芽茎，蒸馏水洗净，置吸
水纸上吸干表面水分，准确称取25g，剪成小段，置研缸中，加少量蒸馏水及少
许石英砂，在冰盘中研磨成匀浆。
2、将绿豆芽匀浆用纱布过滤，去残渣，滤液置冰箱中静置1h充分提取，然
后滤液再6000r/min冷冻离心20—30min，弃去沉淀，上清液再过滤至50ml容量
瓶中，用蒸馏水沉淀至50ml，所得澄清原酶液置冰箱备用。
七、思考题
提取酶活时，为减少酶活损失，操作时有哪些注意点？
实验六pH 对酶活力的影响——最适pH 的测定
影响酶促反应的因素有底物的浓度、温度、pH、抑制剂及激活剂。
pH 对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的pH 即酶的最适
pH，因为通常各种酶只在一定pH范围内才表现它的活力；一种酶在不同pH条
件下所表现出来的活性不同。
pH 之所以对酶活性有很大影响，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基
团的解离状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态，最适于酶与底物
的结合；而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团解离状态不利于酶与底物的
结合，酶活力也相应降低。pH 也可影响底物的解离及反应系统中其它组分的解
离。缓冲系统的离子性质和离子强度，也可能对酶反应产生影响。另外，pH 除
了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有很大影响。过高过低的pH会改变
酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。
一、实验目的
1.本实验考察pH对酶活力的影响；
2.通过pH~酶活力曲线得制作，求出酸性磷酸脂酶的最适pH。
二、实验原理
本实验通过配置一系列不同pH值的缓冲试剂，再将酶加入各缓冲试剂中，
以维持一定的pH值，再分别加入底物β—甘油磷酸钠，酶使β—甘油磷酸钠催
化水解成β—甘油和磷酸氢根离子，反应一定时间后，加入10%三氯乙酸终止反
应。再加入定磷试剂，磷酸氢根离子与定磷试剂反应生成钼蓝，产生的钼蓝在
660纳米处有最大吸收，吸光度的大小在一定范围内与无机磷酸含量成正比，因
此可用光密度O.D 值代替酶活性，作出O.D~pH 曲线，从曲线上可知表现其最
高活力时所处的最适pH值。
三、实验材料
酸型磷酸脂酶原液
四、仪器设备
恒温水浴槽、秒表、721型分光温度计；
五、实验药剂
_________（1）0.01Mβ—甘油磷酸钠；
（2）0.1NHCl；
21
(3) 8.5%NaCl溶液；
(4) 10%三氯乙酸；
(5) 0.143M巴比妥—醋酸钠溶液:称取4.875gNaAc?3H2O 和7.357g巴比妥钠，溶
于500ml蒸馏水中。
(6)系列pH值巴比妥-醋酸缓冲液:取25ml容量瓶6个，各加入5ml0.143M巴比
妥-醋酸钠溶液和2ml8.5% NaCl溶液，再按下表加入0.1N HCl，摇匀后，用pH
计测定pH值，并用0.5 N HCl或0.5N NaOH 调节至所需pH值，最后用蒸馏水
定容至刻度。
pH 0.1 N HCl(ml) pH 0.1 N HCl(ml)
3.5 15.0 5.0 8.0
4.0 12.0 5.5 7.0
4.5 10.0 6.0 6.0
六、实验步骤
取12 支10ml 离心管，编号，按下表操作:
pH3.5 pH4.0 pH4.5 试管编号pH5.0 pH5.5 pH6.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
巴比妥-醋酸缓冲液（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
酶液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10%三氯乙酸（ml） 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0
摇匀后，在35℃水浴中保温5min
β-甘油磷酸钠（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
摇匀后，在35℃水浴中准确反应10min
10%三氯乙酸（ml） 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0
取出后，冷却至室温，4000r/min离心5min备用。
取12支10ml刻度试管，编号，按照下表加入对应酶反应液和试剂，摇匀后，
在45℃水浴中保温20min；以奇数管为对照，测出偶数管的值。
试管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对应酶反应液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
定磷试剂3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
O.D660
七、实验结果与分析
以酶活力(O.D600值代替)为纵坐标，pH值为横坐标，绘出O.D600~pH曲线，
求出最适pH。
22
八、思考题
pH值影响酶催化的机理是什么？
23
实验七温度对酶活力的影响—最适温度的测定
温度对酶活力的影响有双重作用。一方面，温度加速酶反应的速度；另一方
面，酶是蛋白质，温度升高会加速酶蛋白的变性。因此，在较低范围内酶反应速
度随温度升高而增大；超过一定温度后，反应速度下降，酶反应速度达到最大值
时的温度称最适温度。如果保持其他反应条件恒定，而在一系列变化的温度下测
酶活力，再以温度为横坐标，酶活性为纵坐标作图，可得一条温度—酶活力曲线，
从中可求得最适温度。
一、实验目的
通过温度~酶活力曲线的制作，求出酸性磷酸脂酶表现活力的最适温度
二、实验原理
本实验通过将酶加入pH5.0的巴比妥-醋酸缓冲液中，以维持一定的pH值，
再将试管分别放在一系列温度的恒温水浴槽中保温，加入底物β—甘油磷酸钠，
酶使β—甘油磷酸钠催化水解成β—甘油和磷酸氢根离子，反应一定时间后，加
入10%三氯乙酸终止反应。再加入定磷试剂，磷酸氢根离子与定磷试剂反应生成
钼蓝，产生的钼蓝在660nm 处有最大吸收，吸光度的大小在一定范围内与无机
磷含量成正比，因此可用光密度O.D660值代替酶活性，作出O.D660～温度曲线，
从曲线上可知表现最高活力时所处的最适温度值。
三、实验材料
酸性磷酸酯酶原液
四、仪器设备
恒温水浴槽，秒表，721型分光光度计；
五、实验试剂
(1)0.01Mβ—甘油磷酸钠；
(2)0.1NHCl；
(3)8.5%NaCl溶液；
(4)10%三氯乙酸；
(5)0.143M巴比妥-醋酸钠缓冲液（参见实验六）。
(6)pH5.0巴比妥-醋酸缓冲液（参见实验六）
六、实验步骤
取12支10ml离心管，编号，按表操作:
24
试管编号25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 45℃ 50℃
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
巴比妥-醋酸缓冲液（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
酶液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10%三氯乙酸（ml） 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0
摇匀后，在分别在一定温度的水浴槽中保温5min
β-甘油磷酸钠（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
摇匀后，在一定温度的恒温水浴槽中准确反应10min
10%三氯乙酸（ml） 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0
取出后，冷却至室温，4000rpm离心5min备用。
取12支10ml刻度试管，编号，按下表加入对应酶反应液和试剂，摇匀后，
在45℃水浴中保温20min；以奇数管为对照，测出偶数管的O.D值。
试管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对应酶反应液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
定磷试剂3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
O.D660
七、实验结果与分析
以酶活力(O.D600 值代替)为纵坐标，温度为横坐标，绘出O.D600～温度曲
线，求出最适温度。
八、思考题
本实验中如何保证酶反应的时间的准确度？
25
实验八酶促反应与时间的关系——初速度时间范围的测定
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时
间范围内选择，可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。所谓进程
曲线是指酶反应时间与产物生成量（或底物减少量）的关系曲线是在酶反应的最
适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以反应时间为横坐标，产物生
成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知在启始一段时间内曲线为直线，其斜率
代表初速度；随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真
实反应初酶活力大小，就应在初速度时间内进行测定。
一、实验目的
通过酶促反应与时间关系进程曲线制作，求初酸性磷酸酯酶反应初速度时间
范围。
二、实验原理
通过将酶加入pH5.0巴比妥-醋酸的缓冲液中，在35℃保温5min，再分别加
入底物β-甘油磷酸钠，酶使β-甘油磷酸钠催化水解成β-甘油和磷酸氢根离子，
反应一定时间后，加入10%三氯乙酸终止反应。再加入定磷试剂，磷酸氢根离子
与定磷试剂反应生成钼蓝，钼蓝660nm 处吸光度的大小在一定范围内与无机磷
含量成正比，因此可用光密度O.D660 值代替产物生成量，作出O.D660～时间
曲线，从曲线上可求出酸性磷酸酯酶反应初速度时间范围。
三、实验材料
酸性磷酸酯酶原液
四、仪器设备
恒温水浴槽，秒表，721型分光光度计；
五、实验试剂
(1)0.01Mβ-甘油磷酸钠；
(2)0.1NHCl；
(3)8.5%NaCl溶液；
(4)10%三氯乙酸；
(5)0.143M巴比妥-醋酸钠缓冲液（参见实验六）；
(6)pH5.0巴比妥-醋酸缓冲液（参见实验六）
六、实验步骤
取12支10ml离心管，编号，按下表操作：
26
试管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH5.0 巴比妥-醋酸缓冲液（ml）2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
酶液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
摇匀后，35℃预热5min
β-甘油磷酸钠（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
在 35℃水浴中准确反应
时间（min） 0 2 4 6 8 10 15 20 25 30 35 40
10%三氯乙酸（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
取出后，冷却至室温，4000rpm离心5min备用。
取12支10ml刻度试管，编号，按下表加入对应酶反应液室试剂，摇匀后，
在45℃水浴中保温20min；以1 号试管为对照，测出各管的值。
试_____管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对应酶反应液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
定磷试剂3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
O.D660
七、实验结果与分析
以产物生成量(O.D600 值代替)为纵坐标，时间为横坐标，绘出O.D600～时
间曲线，求出反应初速度时间范围。
八、思考题
初速度时间范围确定有何意义？
27
实验九底物浓度和抑制剂对酶活力的影响
------Km和Ki 的测定
在酶学分析中，Km是酶的一个特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的
性质。Km 与底物浓度、酶浓度无关，而与pH、温度、离子强度等因素有关。
Km与Vmax的测定是酶学工作的基本内容之一。
抑制剂是影响酶促反应的因素之一，根据抑制剂与酶结合的特点可分：不可
逆抑制和可逆抑制两类。其中可逆抑制又可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争
性抑制和反竞争性抑制。
（1）竞争性抑制类型：酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表
现米氏常数K′m增加，Vmax不变：
V′= Vmax[S] / ( K′m+[S])
K′m = Km（1+[I]/Ki）
（2）非竞争性抑制类型：抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进
一步分解为产物，K′m不变，V′max下降：
V′= V′max[S] / ( K′m+[S])
V′= Vmax /（1+[I]/Ki）
（3）反竞争性抑制类型：抑制剂必须在酶和底物结合之后才能与酶形成复合
物，但此物不能分解为产物。K′m、K′max都发生变化：
V′= V′max[S] / ( K′m+[S])
V′max= Vmax /（1+[I]/Ki） K′m =（1+[I]/Ki）
测定Km、Vmax 一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是
Lineweaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/V 对1/[S]作图，
直线在横轴上的截距为-1/Km，纵轴上的截距为1/Vmax，从而可求Km与Vmax。
对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用作图法，求出Km、Ki、K′m，并利
用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。
一、实验目的
通过实验，学习和掌握抑制剂类型的判断以及Km和Ki、Vmax求得得方法
和原理。
二、实验原理
通过将酶加入的缓冲液中，以维持一定的pH值，再加入各种抑制剂，在35
℃保温5min，再分别加入底物β-甘油酸钠，酶催化β-甘油酸钠水解成甘油和磷
28
酸氢根离子，反应10min 后，加入三氯乙酸终止反应。再加入定磷试剂，磷酸氢
根离子与定磷试剂反应生成钼蓝，产生的钼蓝在660nm 处有最大吸收，吸光度
的大小在一定范围内与无机磷含量成正比（每0.1 代表含磷是2.26ug），因此可
由光密度值知道产物生成量[P]，速度可用表示[P]/t，求出1/[S]、1/V，作出1/V～
1/[S]图，从曲线上查出－1/Km及1/Vmax，即可求出Km、Vmax。
三、实验材料
酸性磷酸酯酶原液
四、仪器设备
恒温水浴槽，秒表，721型分光光度计；
五、实验试剂
（1）0.01Mβ-甘油磷酸钠；
（2）0.1NHCl；
（3）8.5%NaCl溶液；
（4）10%三氯乙酸；
（5）7mMNa2C2O4；
（6）3.5mMNaF；
（7）pH5.0巴比妥－醋酸缓冲液（参见实验六）
六、实验步骤
取12支10ml离心管，编号，按下表操作：
空白无抑制剂Na2C2O4 NaF
试管编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
巴比妥－醋酸缓冲液(ml) 2.7 2.4 2.0 2.7 2.4 2.0 2.4 2.1 1.7 2.4 2.1 1.7
酶液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
7mMNa2C2O4(ml) 0.3 0.3 0.3
3.5mMNaF 0.3 0.3 0.3
10%三氯乙酸1.0 1.0 1.0
35℃保温5min
0.01Mβ-甘油磷酸钠0.3 0.6 1.0 0.3 0.6 1.0 0.3 0.6 1.0 0.3 0.6 1.0
35℃精确反应10min
10%三氯乙酸1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
取出后，冷却至室温，4000rpm离心5min备用。
取12支10ml刻度试管，编号，按下表加入对应酶反应液和试剂，摇匀后，
在45℃水浴中保温20min；以相应空白管为对照，测出各管的OD660 值。
29
试管编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对应管酶反应液(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
定磷试剂(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
OD660
[S]
V([P]/t)
1/[S]
1/[V]
七、数据处理
[S]=X×M/3.5
X：为底物加入的ml数；3.5：为反应液的体积；M：为加入时底物浓度；
[I]=Y×M/3.5
Y：加入抑制剂的ml数；N：加入抑制剂的浓度；
[P]=2.26/0.1×OD660(μg)
通过计算求得[S]、V、1/[S]、1/V 和I 等值，然后以1/V 为纵坐标，1/[S]为横坐
标，绘出1/V～1/[S]曲线，数条曲线作在同一图上，然后求Km、Vmax、Ki 等
值及抑制类型。
八、思考题
Km的大小能说明酶的什么性质？
实验五酸性磷酸酯酶的固定化
固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳
定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的
酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。酶的固定化方法有载体结合法、
交联法、共价偶联法及包埋法等。
载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。根据固定方式的不同，
这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。物理吸附法是指将
酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。离子结
合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载
体有离子交换树脂等。共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方
法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。
交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用
的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。
包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分
子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，后者
包埋成微胶囊型。
一、实验目的
了解磷酸酯酶固定化的原理及实验操作技术。
二、实验原理
利用吸附力、离子键、共价键等不同的联结方式，将酶与不溶性载体联结，
制成水不溶性酶。通过测定酶液固定前后的酶活可以计算酶固定化的效率。通过
测定固定化酶的活性，可测定固定化酶的酶活力回收率。
三、实验材料
绿豆芽（用于酸性磷酸酶临时制备）、活性炭
四、仪器设备
（一）全班共用：（ 1 ） 电力搅拌器1 台；（ 2 ）冷冻离心机4000~1000rpm
1 台；（ 3 ） 721 分光光度计2-4 台；（ 4 ）水浴箱2 台；（ 5 ）台式天
平（离心平衡用） 2 台；（ 6 ）大漏斗1个，纱布1块；（ 7）蒸馏水瓶（ 25L
或50L ） 1 个。
（二）每组配置：洗瓶1个，离心管（10ml）2根。
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五、玻璃器皿（以组为单位）
试管（ 6 ），100 ml 烧杯（ 1 ），吸管（ 2 ）、玻棒（ 1 ），移液管或移
液器5ml(1) 、1ml(2) 、0.5ml （ 1 ），漏斗（ 3），滤纸（ 3~6 ），容量
瓶100ml（1）
六、实验试剂
1、pH4.9巴比妥乙酸缓冲液
2、0.01Mβ-甘油磷酸钠
3、三氯醋酸：5%三氯醋酸
4、定磷试剂：（参见附录九）
七、实验步骤
1、粗酶液的制备
将生长5—7天绿豆芽去子叶和根，用蒸馏水洗数次，置吸水纸上吸干表面水
分。取50g，剪成小段，置研钵中加少量蒸馏水和少许石英砂，置冰盘中研成匀
浆。然后双层纱布过滤，滤液于10000r/min离心10min，取上清，蒸馏水定容到
50ml，备用。（酶液制备分四组）
2、酶液固定化
称取0.5g活性炭，经110℃活化0.5h，倒入盛有20ml粗酶液的烧杯中，间隙搅
动，处理10min。用滤纸滤出活性炭。
3、酶活力的测定
A、测定滤液、原酶液以及固定化后的活性炭（先称量滤纸滤出的活性炭总
重M，然后取0.2g用于酶活测定）的酶活。酶反应如下表所示：
试管号1（对照） 2（原酶液） 3（滤液） 4（固定化酶）
缓冲液 2 2 2 2
β-甘油磷酸钠0.5 0.5 0.5 0.5
蒸馏水1 1 1 1
三氯醋酸1 0 0 0
酶液0.5 0.5 0.5 0.2g固定酶
35℃反应10min
三氯醋酸0 1 1 1
第4管补加0.5ml酶液。
B、显色与比色按下表操作：
各管4000r/min离心10min后，取上清液显色。
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1 2 3 4
反应管上清液1 1 1 1
蒸馏水2 2 2 2
定磷试剂3 3 3 3
45℃，保温20min
OD662
C、查标准曲线并计算酶活
酶活力单位：在上述条件下，以每分钟释放1μmol磷酸为一个酶单位。
八、计算
九、思考题
固定化效率和回收率大小说明什么问题？
注：活性碳活化与酶液的制备可以预先制备好，以保证一个上午可完成实验
磷酸mmol数?查表磷酸mmol*显色用反应液体积
反应液总体积?