运脾和络汤调控SIRT1-FoxO1通路改善2型糖尿病大鼠胰腺脂肪异位沉积的-USB迷|专注于互联网分享

2024年9月7日发(作者：苏炎)

中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年3月第36卷第3期

CJTCMP，March

2021,

Vol

.36,

• 1731 •

•研究报告•

运脾和络汤调控

SIRTl

FoxOl

通路改善2型糖尿病

大鼠胰腺脂肪异位沉积的研究

夏温舒，柴可夫，毛竹君

(浙江中医药大学，杭州310053)

摘要：H的：探讨运脾和络通过SlKTI-FwOI通路改善2型糖尿病（T2DM >大鼠咦腺脂肪异位沉积方

法：ZL大鼠普通饲料喂养作为空白对照组

Z〖)F大鼠高脂词料喂养4周造模成功后，随机分为模型组、给药组、

SIRT1空载组（空载组）和SIRT1过表达组（过表达组）给药组用运脾和络汤灌胃干预8周空载组与过表达

组予腺相关病毒尾静脉一次性注射8周千预结束后各组大鼠取血进行相关生化检测，取空白对照组、模型组，

给药组大鼠胰腺组织运HIHE染色和油红U染色进行镜卜'观察；取5组大鼠胰腺组织运用qPCR和Western Blot分別

检测SIRTI, FnxUI mRNA和蛋白表达结果：与模型组比较，给药组胰腺组织脂昉空泡减少，给药组和过表

达组S1RT1蛋A表达升高（P<0.01 )、FoxOl蛋甶表达降低（P<0.01 );与空载组比较，过表达组相关生化指标

(FBG、FINS、HOMA-IR、血脂四项）改善（P<0.01 )

(P<0.01K

，

S丨RTl mRNA表达升高（ >

，

FoxOl蛋白表达降低

结论：运睥和络汤能改善胰腺组织脂肪异位沉积，该作用可能与8川'丨'丨4’〇：(<>丨通路相关.：

关键词

：

运脾和络汤；自噬；S1RT1; F〇x()l; 2®搪尿病；脂肪异位沉枳；机制；胰腺

基金资助：闹家自然科学基金项目（N«.8I774I77)

Study on the Yunpi Heluo Decoction in inhibiting pancreatic ectopic fat deposition in

type 2 diabetic mellitus rats via SIRTl-FoxOl pathway

XIA

Wen

shu

CHAI

MAO

Zhu-jun

(Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China )

Abstract!

Objective: To investigate the effects of Yunpi Heluo Decoction on pancreatic fat deposition in type 2 diabetic

mellitus (T2DM) rats by SIRTl-FoxOl pathway. Methods: ZL rats fed with normal diet were as blank control group. ZDF rats

fed with high-fat diet for 4 weeks and model establishment were randomly divided into model group, administration group. SIRT1

empty group and SIRT1 overexpression group. The treatment group was given Yunpi Heluo Decoction for 8 weeks. SIRT1 empty

group and SIRT1 overexpression group were injected with adeno-associated virus via tail vein. After 8 weeks of intervention,

blood samples were collected for biochemical detection. Pancreatic tissues of blank control group, model group and administration

group were observed under microscope with HE staining and oil red O staining; the expression of SIRTl-FoxOl pathway related

proteins was detected by qPCR and Western Blot. Results: Compared with the model group, the number of fat vacuoles in

pancreatic tissue in the treatment group decreased, the expression of SIRT1 increased and the expression of FoxOl decreased in

the treatment group and SIRT1 overexpression group (^); compared with the SIRT1 empty group, the related biochemical

indexes (FBG. FINS, HOMA-IR. four item of blood lipids) in the SIRT1 overexpression group were improved (P<0.01), the

mRNA expression of SIRT1 was increased, and the protein expression of FoxOl was decreased (

尸

<0.01). Conclusion: Yunpi

Heluo Decoction can improve the ectopic fat deposition in pancreas, which may be related lo SIRTl-FoxOl pathway.

Key W

〇

rdS!

Yunpi Heluo Decoction; Autophagy; SIRT1; FoxOl; Type 2 diabetic mellitus (T2DM); Heterotopic fat

deposition; Mechanism; Pancreas

Funding!

National Natural Science Foundation of China (No.81774177)

糖尿病逐渐从少见病变成流行病，201 3年患病率达到

10.4%,其中绝大部分为2划糖尿病（type 2 (lial)etes mellitus,

T2DM )，其发病隐蔽性和后期多种并发症严重威胁到患

者身体健康和社会公共安全m胰岛P细胞的功能缺陷和

等[21。机体过剩的脂肪在非脂肪组织（如胰腺）异位沉积

并程度加深时，胰岛P细胞的功能会受到影响，甚至逐渐

丧失131。本课题组前期研究结果证明，运脾和络颗粒可以明

显降低糖尿病大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG)、

胆固醇（total cholesterol，TC )、甘油一.酯（triglyceride，T(;)

水平' 但其作用机制尚不明确，本研究从SIRT卜FoxOl通

破坏都是T2DIV1的病因，ft噬作为一种细胞的自我吞噬，失

调时可能导致代谢紊乩，包括胰岛素抵抗、糖硤病、肥胖

通信作者：毛竹君，浙江行杭州市滨江区滨文路

号浙江中医药大学药学院，邮编：

310053

，电话：

*************

E-mail

：

*********************

• 1732 •

中华中医药杂志(原中国医药学报>202丨年3月第36卷第3期

CJTCMP

March

2021,

Vol

.36,

作.-801：冰箱保存：注射完成后，2组尺鼠转移至负压SPF环境

饲养.灌胃期N各组大鼠饮食不变，卩丨由饮水十预治疗8周，在

给药期间每阛根据大鼠体质量变化及时调整给药童：以丨:实验

未有大鼠损伤或死f:

动物根据预实验100%的成模率，由北京维通利华

过程进展顺利，

路人手探究运脾和络汤付T 2 D M胰腺脂肪异位沉枳的调控

机制.

材料

实验动物技术有限公U'购8周龄雄性SPF级ZD1•'模锻大鼠

(fa/fa)40只（以下简称ZDF大鼠），ZDF对照大鼠（fa/+>10只

(以下简称ZL大鼠），体质量180~220g,动物许可证号：SCXK

(京）2016-0006,词养于浙江中医药大学动物丈验中心大鼠实

验饲养室，SPF实验动物分笼饲养实验动物许可i£号：SYXK

(浙）2018-0012,动物环境设施：光照12h,室温丨8~26t,湿度

50<7r~70%,噪音<50(IB

2. 药物与制备运脾和络汤由汉防己15g、黄迄30g,往术

20g、赤芍20；；、金银花I5S、丐归丨化、玄参丨2g、威灵仙丨2S等组

成，浙江中医药大学中药饮片有限公提供3饮片煎制：全部药

材粉碎后加5倍水煎煮2次，ih/次.2次煎煮完成r〖合并滤液于

一处，调整pH值至7.0,浓缩定容至生药含M2g/mL,微孔滤膜

过滤除菌后分装于200ml.中药袋，放置丁-4t冰箱备川

3. 试剂与仪器苏木精、伊红（SIGMA公n'』）.EC丄Plus

发光试剂盒.BCA蛋浓度测定试剂，Western及IP细胞裂解

液（碧云天生物技术），P(:R引物（上海生T生物_「.程有限公

匀），血脂检测试剂盒（南京建成生物丨:程研究所）.sm’i相

关腺病毐丨汉恒生物科技（上海）有限公司

AU2700型全自动生化分析仪（日本OLYMPUS公司），超低

温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific) , SpectraMax Plus384型

全波长酶标仪（美国Molecular Devices公司），CFX384多遺实

时荧光定量PCR仪、Mini-PR()TEAN电泳系统、Mini Trans-Blol

转印系统（美国Bin-RA[>公

_J )

方法

I.造模、分组与给药8周龄雄性ZDF大鼠40只，普通饲料

适应性饲养1周后，改用W脂词料继续喂养4周，卜'彳由进食X周

龄雄性ZL大鼠10只，普通词料喂养.作为空白对照组_所有大鼠

于每周日20: 00禁食12h后，周一8: 00采用剪尾法采血，用快速

血糖仪测其FBG.参照文献丨丨]及本次空丨4对照组大鼠血糖值，

设定成模血糖值，以/L判定ZDF大鼠T2DM造

模成功。4周后选择符合成模条件的ZDF大鼠共40只（成模率

100%),随机数字表法将大鼠平均分为模型组、给药组、sum

空载组（以下简称空载组）、SIK’I'丨过表达组（以下简称过表达

组），每组丨0只。

本课题组前期研究141发现，给药组大鼠予等效剂_境运脾和

络汤（丨2.5g/k)浓缩液蒸馏水稀释后灌胃疗效较!if a死亡率最

低，灌胃频率I次/山灌胃容枳10mL/kg空白对照组和模咽组予

以与给药组相同容积比例的蒸馏水来灌胃_腺相关病毒注射由

浙江中医药大学动物实验研究中心实验人员操作完成，M静脉

一次性注射，每只大鼠30()|^1..过表达组大鼠_)〜HHAAV2/9-r-

Snm-3*-flag-OT注射。空载组大鼠予HBAAV2/9-CMV-GFP注

射丨:述腺相关病毒由汉W生物科技（上海）有限公司包装制

2. 取材4指标检测

2.1血淸采集大鼠在喂养幵始前采用剪尾法取血检测

!•'B(;造模成功后、十预开始前禁食丨2h后采川眼眶后静脉丛

采血法取血lmL,通过全自动生化分析仪检测其FBG、血脂

四项[TG、TC、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein

i.l»>les|prnl. l.l)L-(:)、高密度脂蛋I'lNH间醇（high-density liptein

rholesterol, HDL-C)];通过酶联免疫吸附试验（ELISA)法检测

各组大鼠空腹姨岛素（fasting scrum lisulin, FINS)，计算胰岛素

抵抗指数（HOMA-IR),公式为H0MA-m= FBGxF丨NS/22.5

8周千预结束后、大鼠处死前禁食不禁水I2h, 2%戊巴比妥钠

(45mg/kg>腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血6~8m[.,检测大鼠

FBG、血脂四项、FINS,并计算H0MA-1R。

2.2胰腺组织采集与检测大鼠剖开腹腔取胰腺部分.胰

吆单浊分开于丨〇%中性屮醛固定液中间定24h后进行石蜡包埋和

切片，用于后续HE染色以及油红0染色.其余部分切碎后放入

做好标记的冻存管中放丁•液氮，取材结束后转移至-80T.冰箱冷

冻保存，以备组织研磨后进行

3. 统i卜•法采川SPSS 25.0软件对实验数据进行

计分析，数据)t炫描述对各组数据先进行正态性检验.方

差齐性检验，不同组间比较采用单因素方差分析（dWOM),

P<0.05表水益徉有统计学意义

结果

1.各组人鼠FBG变化见阁I模型组大鼠各时间点较空

A对照组大鼠FBG升高（P<0.01 );十预结束后.与模型组比

较，给药组及过表达组FBG显著降低（尸<0.01 );与空载组比

较，过表达组FBG显著降低（P<0.()丨）.

Esa

始血糖

成模后血槠

干预后血糖

20-

阁1治疗前后各组大鼠FB(;比较

注：A.空内对照组；B.模型组；C.给药组；D.空载组；E.过表达

组.阁2_阁4,阁7-图II同与空白对照组同期比较，><0.01;句模型

组同期比较，M/;与空载组同期比较.“/V0.0I-图2-1?丨3同

2.各组大鼠FINS及HOMA-IK的变化见图2-阁3 f

预前，与空(4对照组比较，模型组大鼠FINS及H0MA-IR升髙

(/><0.01) F预后，与模型组比较.给药组FINS及HOMA-IR显

著降低（P<0.()l );与空裁组比较，过表达组KINS、HOMA-m显

箸降低（P<〇.〇l)。

统

中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年3月第36卷第3期

CJTCMP

March

2021，

Vol

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• 1733 •

6〇 n

|干预前

工

干预后

40-

Iff

图2各组大鼠FINS值比较

60 n

干预前

干预后

40-

图3各组大鼠HOMA-IR值比较

3.各组大鼠血脂四项的变化见图4.与空白对照组大鼠比

较，其余4组大鼠血脂四项（T(;、TC、HDL-C、LDL-C)指标均有

升高（P<0.0丨）；与模型组比较，除给药组LDL-C外.给药组及过

表达组血脂四项指标均显著降低（P<0.05, /^);与空载组

比较，过表达组大鼠血脂四项指标亦显著降低（P<0.01)。

15-

(;

ES3 I .DL-C

把：

Bla

ilk mm

C D

图4干预后各组间大鼠血清血脂四项比较

注：与空白对照组比较，与模型组比较，

P<〇.〇5,

AAP<0.01;与空载组比较，“AcO.O丨:图7-图8,阁10-图丨丨同。

4.各组大鼠胰腺组织病理形态学观察结果

4.1 HE染色镜下观察结果见图5:空白对照组大鼠胰腺

组织结构正常，形态完整，未见病变模型组大鼠胰腺组织腺

泡细胞正常，腺泡小叶间可见脂肪空泡，胰岛内可见腺泡细胞

异位增生和毛细血管扩张给药组大鼠胰岛细胞脂昉空泡减

小，脂肪细胞多单独位于小叶内，未见毛细血管扩张

图5各组大鼠胰腺组织HE染色结果（x200)

注：A.空白对照组；B.模型组；C.给药组•图6同:

4.2油红O染色镜下观察结果见阍6空闩对照组大鼠胰

腺结构正常，未见病变。模型组大鼠胰腺组织可见脂肪浸润和

脂肪空泡，与空内对照组对比明硕给药组大鼠胰腺组织相对

模型组脂肪空泡减小。

图6各组大鼠胰腺组织油红0染色结果（x200)

5. qPCR检测各组大鼠胰腺组织SIRTl-FoxOl相关mRNA

的表达见图7-1^18：*与空白对照组比较，模型组大鼠胰腺组

织中SIRT1 mRNA表达下调（P<0.()1)，FoxOl mRNA表达上调

(P<0.01 );与模型组比较，给药组SIRT1 mRNA表达量上调

(P<0.()1)，给药组和空载组FoxOl mRN A表达下调（P<0.01);

与空载组比较，过表达组SIRT1 mRNA表达上调（/ )。

旧7各组大鼠胰腺组织SIKT1 mKNA表达比较

蓮

劫

螂

契

驿

vmls

丨?18各组大鼠胰腺组织FoxOl m

NA表达比较

6. Western Blot检测各组大鼠胰腺组织SIRTl-FoxOl相关

蛋内的表达见图9-图II。与空白对照组比较，模型组SIRT1

蛋白表达量下调（P<0.01), FoxOl蛋白表达量上调（P<0.01);

与模型组比较，给药组和过表达组SIRT1蛋A表达量上调

(尸<0.05),而Fc«01蛋白表达量下调（P<0.〇n ;空载组S1RT1

蛋白表达量下调（f<〇.〇l > ;与空载组比较，过表达组FoxOl蛋

白表达最下调（户<〇.〇1)

p-arlin

图9各组大鼠胰腺组织F<«01、S1RT1蛋白表达条带

• 1734 .

中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年3月第36卷第3期

CJTCMP

March

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冬

miO各组大鼠胰腺组织SIRT1蛋丨'彳表达比较

图11各组大鼠胰腺组织FoxOl蛋白表达比较

讨论

自噬"了以维持机体平衡和稳态，自噬缺陷的大鼠在高脂喂

养后出现胰岛P细胞的损伤及死亡，最终出现糖耐量减低及糖

尿病，说明n噬缺陷可能是促进脂肪胰向糖味病发展的影响w

素之一丨5-61。

近年来的研究表明，SIKTI-FoxOl通路付噬存在调节作

用FoxO转及因子是一类自噬调控关键因子.其中以FoxOl的作

用最为广泛，FnxO可以通过激活细胞的自噬活性，而其转录激活

能力受其乙酰化与去乙酰化、磷酸化与去磷酸化过程的调节|71,

并在心脏、血管、骨骼肌、肝脏和胰腺等多种器官和组织中.参

与调节细胞增殖、代谢、存活等过程|81。A噬相关基因.

A t g 12和(;a ba rapl 1的表达影响白噬水平，而这3种白噬相关基W

的表达依赖TFoxOl转录因子B前研究发现，SIKT1作为沉默

信息调节因子（Sir2)的重要成员，除了(4 #可以通过调节高游

离脂肪酸引起的氧化应激和直接去乙酰化自噬相关蛋A Atg5、

Atg7, Alg8影响自噬外，还可以通过调节F〇x〇的去乙酰化，在

自噬过程中调节相关基因的表达对自噬产生影响氧化应激

状态下，乙酰化的FoxOl ( A(_:-F在胞质溶胶中表达升高，

且与Ais7相互作用以激活白哩Wu S Y等1121实验证明激活

SIRT河促进(3细胞缺陷新生大鼠的p细胞冉f

脾主运化，过食肥甘厚腻而伤睥气，脾气不足，糖，脂等水

谷精微不得运化，留于血脉、脏腑、肌肉，酿成痰湿，蓄而不化

则腐化成浊《素问•奇病论》云：“肥者，令人内热.甘者令人

中满，故其气上溢.转为消渴”现代亦有医家总结认为通过从

脾论治可调节机体自噬水平，改善脂质代谢蒺乩1141运脾和络

汤由防己黄芪汤化裁而来，防己与黄芪相丨五，补睥益气而清利

湿热；当归与苍术相配，活血养血而燥湿健脾全方补中有清，

润中有燥，和脏腑而畅气血，脾运络和则机体得安，

本实验结果中.给药后的ZI>I•'大鼠血沾相关指标结果和镜

险结果.提小'运脾和络汤对T2UM导致的脂质水平变化存在改

善作用；Slim和F<«OI蛋卜’I含W的变化，提示其可能是通过影

响S1KTI蛋I’h激活提高F〇x(>l的转录调节活性，从而提高细胞

ft噬水平综i:所述，冬研究为运脾和络汤通通

路改善胰腺组织脂肪异位沉枳提供了实验依据

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(收稿H期：2020年1月15日）