2024年10月7日发(作者：匡瑞灵)
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中国康复医学杂志，２００８年，第２３卷，第１期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｅ，Ｊａｎ．２００８，Ｖｏ１．２３，Ｎ０．１ｎ
基础研究・
中药新制剂（ＹＮ一３）干预慢性应激模型大鼠
海马ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ表达的研究
史榕荇 图 娅 ・２
摘要 目的：探讨中药新制剂（ＹＮ一３）对慢性应激模型大鼠海马ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含量的调节作用。方法：将３２只
ＳＤ雄性大鼠随机分为空白组、模型组、中药组（ＹＮ一３）、氟西汀组，每组８只。采用放射免疫法检测海马皮质醇（ＣＯＲＴ）．
比色法测定海马内Ｇｌｕ含量，ＰＣＲ法测定海马内ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含量。结果：与空白组相比，模型组海马内
ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ、ＮＲ２ＡｍＲＮＡ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含量明显升高，ＹＮ一３组和氟西汀组有效抑制海马内ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ、ＮＲ２Ａ
ｍＲＮＡ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ的过量表达。结论：慢性应激引起大鼠海马内ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含量增加．ＹＮ一３可能通过调整
ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ含量对抗海马内神经毒性作用。
关键词 慢性应激；中药；ＮＲ２ＡｍＲＮＡ；ＮＲ２ＢｍＲＮＡ；谷氨酸
中图分类号：Ｒ７４９．４．Ｒ４９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—１２４２（２００８）一０１—００３０—０４
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＹＮ－３ ｏｎ ＮＲ２Ａ，ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ／Ｓｉｌｌ
Ｒｏｎｇｘ，ｌｎｇ，ＴＵ ＹＭＩ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，２３（１）：３ 一３３
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＹＮ－３ ｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＮＲ２Ａ ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ
ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｉｒｔｙ—ｔｗｏ ｍａｌｅ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｅｖｅｎｌｙ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｏｌ，ｓｔｒｒｅｓｓ－ｍｏｄｅｌ，ａｎｄ
ＹＮ－３ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｐｒｏｚａｅ２２０ ｇｒｏｕｐ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｉｘｅｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ
ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ （ＣＯＲＴ）ａｎｄ Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ（Ｇｌｕ）ｉｎ ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｏ－ｃｈｅｍｉｒｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＮＲ２Ａ，ＮＲ２ＢｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｒａｔｓ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ＮＲ２Ａ ａｎｄ ＮＲ２ＢｍＲＮＡ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｏｌｒ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｒａｔｓ ＮＲ２Ａ，
ＮＲ２ＢｍＲＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｌｏｗｅｒｅｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｉｎ ＹＮ－３ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｍａｙ ｃａｕｓｅ ｈｉｇｌ１ ｌｅｖｅｌ
ＮＲ２Ａ ａｎｄ ＮＲ２ＢｍＲＮＡ ｉｎ ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ，ｗｈｅｒｅａｓ ＹＮ－３ ｃａｎ ａｄｊｕｓｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＲ２Ａ ａｎｄ ＮＲ２ＢｍＲＮＡ ｉｎ
ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ．
Ａｕｔｈｏｒ ｓ ａｄｄｒｅｓｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｃｕ—ｍｏｘｉｂｕｓｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＴＣＭ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００２９
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ；ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ；ＮＲ２Ａ；ＮＲ２Ｂ；Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ
抑郁症（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）是一种主要表现为显著而 性变、癫痫、肿瘤等许多重要的生理病理过程Ｉ２１。
现已发现ＮＭＤＡＲ至少存在７个亚单位．即
ＮＲ１亚单位、４种ＮＲ２亚单位（分为ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、
ＮＲ２Ｃ和ＮＲ２Ｄ）以及２种ＮＲ３亚单位（包括
ＮＲ３Ａ和ＮＲ３Ｂ）Ｉ３１。构成ＮＭＤＡＲ的亚单位常以受体
复合物的形式存在ｉ４１，其中ＮＲ１是受体复合物的功
能亚单位，ＮＲ２是调节亚单位，不同ＮＲ２的参与可
赋予通道复合物以不同的电生理学和药理学特性，
其基因表达的紊乱将导致受体复合物功能活性的改
变 。本研究采用荧光定量ＰＣＲ技术对慢性应激模
型大鼠海马ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ表达进行检测并观
基金项目：国家自然科学基金资助（３０４７２１８１）
ｌ北京中医药大学针灸推拿学院，１０００２９
２通讯作者：图娅（北京中医药大学针灸推拿学院，ｔｕｙａｂ＠２６３．ｎｅｔ）
作者简介：史榕荇，女，博士研究生
收稿日期：２００７－０３—０５
持久的心境低落的神经精神疾患，发病率呈上升趋
势，其病因至今尚不清楚。ＹＮ一３是治疗抑郁症的经
验方研制成的中药新制剂．实验证明，ＹＮ一３具有明
显的抗抑郁作用。本研究采用慢性应激大鼠模型，通
过测定海马内皮质醇（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ，ＣＯＲＴ）、谷氨酸
（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｇｌｕ）水平及ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含
量．研究ＹＮ一３是否通过对海马内Ｎ一甲基一Ｄ一天门
冬氨酸受体（Ｎ～ｍｅｔｈｙｌ—Ｄ—ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，
ＮＭＤＡＲ或ＮＲ）的影响起到抗抑郁作用。
近年来研究表明．ＮＭＤＡＲ调控药物具有潜在
抗抑郁效应，是兴奋性氨基酸——Ｇ１ｕ受体的重要亚
型．属配基门控的离子通道，ＮＭＤＡＲ介导的Ｇｌｕ神
经兴奋毒性作用在脑损伤的众多环节中起着关键作
用Ｉ１１。ＮＭＤＡＲ在中枢神经系统中广泛参与学习、记
忆、突触可塑性、神经发育、缺血性脑损伤、神经退行
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里堕星 学杂志，２００８年，第２３卷，第１期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｅ，Ｊｎａｎ．２００８，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１
察ＹＮ一３的干预作用。
１材料与方法
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刺激３次，共计２１ｄ，造成大鼠慢性应激抑郁模型，
每１３按ｌｍｌ／ｋｇ灌服生理盐水１次。③中药组：造模
同时，于每１３应激刺激前１ｈ灌胃给予ＹＮ一３，大鼠
１．１试剂与仪器
Ｔｒｉｚｏｌ ＲＮＡ提取试剂盒（美国Ｇｉｂｃｏ公司）；逆转
录一聚合酶链反应试剂盒、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、
按１．２ｍｇ／ｋｇ体重，浓度１．００ｇ／ｍｌ，共２１ｄ。④西药组
（氟西汀，ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ，商品名：百优解，美国产，批号
１０４０４１）：造模同时，于每日应激刺激前１ｈ灌胃给
药，大鼠按０．１８ｍｇ／ｋｇ ＢＷ，浓度为０．０１８ｍｇ／ｍｌ，共
２１ｄ。
Ａｃｃｅｓｓ（大连）；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ试剂盒
（美国应用生物公司）；琼脂糖（西班牙Ｂｉｏｗｅｓｔ公司）；
其他试剂均为国产分析纯。
５４１５Ｒ型高速离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；
１．４药物
ＹＮ一３由中国中医科学院药物研究所药物研究
室鉴定，使用前按照灌胃剂量煎药浓缩，浓度１．ｏ０ｇ，
ｍｌ，贮存于４℃冰箱中备用，用前加温。
１－５ ＲＮＡ提取
Ｇｅｎｅ １／型ＤＮＡ／ＲＮＡ测定仪（瑞典Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ公司）；ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００型普通ＰＣＲ仪及
ＰＲＩＳＭ ７０００型荧光定量ＰＣＲ仪（美国应用生物公
司）；ＤＹＣＰ一３１Ｄ型琼脂糖水平电泳槽（北京）；Ｉｍａｇｅ
ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ扫描仪（瑞典）。
ＣＯＲＴ放免试剂盒，由北京华英生物技术有限
公司提供。Ｇｌｕ生化试剂盒由南京建成生物工程研
究所提供
ＲＮＡ提取按Ｔｒｉｚｏｌ提取试剂盒操作说明书进
行。每个海马组织样本加入ｌｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ后吹打。１５—
３０℃孵育５ｍｉｎ；加入氯仿，盖紧盖子，用力摇动１５ｓ，
１５—３０℃孵育２—３ｍｉｎ，４ｏＣ １２０００ｇ离心１５ｍｉｎ。取
上清液至新ＥＰ管内，加入异丙醇（０．５ｍｌ异丙醇／１Ｉｌｌｌ
１．２动物分组及造模方法
雄性ＳＤ大鼠３２只，体重１７０＋＿１０ｇ，由北京维通
利华实验动物技术有限公司提供。通过开野实验将
水平运动次数加垂直运动次数不足３０次或超过
Ｔｒｉｚｏ１），１５—３０℃孵育样品１０ｍｉｎ，４￣Ｃ １２０００ｇ离心
ｌＯｍｉｎ，弃上清液；７５％冷乙醇洗涤沉淀一次，４℃
７５００ｄｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃乙醇，空气或真空干燥５—
１０ｍｉｎ；加ＤＥＰＣ处理水溶解ＲＮＡ，提取的ＲＮＡ质
１２０次的大鼠剔除，然后按体重随机分组，分为空白
组、模型组、中药组、西药组，每组８只。实验前各组
大鼠在２５℃安静环境内饲养１周，自然光照，通风良
量由Ａ２６０／Ａ２８０比值和１．５％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
１．６ ｃＤＮＡ制备
取１ｌｘｇ ＲＮＡ。以Ｏｌｉｇｏ ｄＴ为引物进行ＲＴ反转
录。２０１ｘｌ体系中含有５ｘＭ—ＭＬＶ缓冲液４ｌｘｌ，ｄＮＴＰ
１０ｍｍｏｌ，Ｒｎａｓｅｉｎ ２０Ｕ，Ｍ—ＭＬＶ ＩＯＯＵ，Ｏｌｉｇｏ ｄＴ
好，自由进食水。
１．３各组的处理方法
①空白组：每笼５只饲养，正常饮食饮水。②模
型组：采用慢性应激模型【５】结合孤养方式造模。每笼
１只饲养，慢性多种应激程序每１３随机安排以下一
２０ｐｍｏｌ，ＲＮＡ １ ｇ。逆转录反应条件为：２０￣Ｃ ５ｍｉｎ，
４２ｏＣ ６０ｍｉｎ，７０ｏＣ ５ｍｉｎ，冰浴冷却后置一２０℃保存。
１．７荧光定量ＰＣＲ
种：禁水（２４ｈ）、禁食（２４ｈ）、昼夜颠倒（２４ｈ）、夹尾
（１８０ｓ）、束缚（３ｈ）、冷水游泳（１４￣Ｃ，５ｍｉｎ）、电击足底（电
压为３０Ｖ，电击５ｓ，间歇５ｓ，共进行１２０ｓ），平均每种
Ｏｌｉｇｏ
ＮＲ２Ａ
根据ＮＣＢＩ数据库中的ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ及Ｂ—ａｃｔｉｎ
基因序列。以Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计引物，由北京赛
百盛基因技术有限公司合成（序列见表１）。在ＡＢＩ
表１荧光定量ＰＣＲ引物序列
引物序列 Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｓｉｚｅ（ｂｐ）
ＮＭ Ｏ１２５７３
Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｐｒｉｍｅｒ
５＇－ＴＡＧＧＡＧ１１ＧＣＴＧＴＣＧＧ ＩＴＡ一３
ＮＭ Ｏ１２５７４
ＮＲ２Ｂ
Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒ
ＲｅＶｅｒｓｅ
Ｐｒｉｍｅｒ
－
５ ＿ＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴＧＡＧ－３
５ ＿ＡＧＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＴ一３
ａｃｆｉｎ
Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｒｅｖｅ￣ｅ
Ｐ ｍ ｒ
５＇－ＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣ１ＩＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧ－３
５ 一Ｃ１ＩＧＡＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣ－３
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３２ 中国康复医学杂志，２００８年，第２３卷，第１期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉ０ｎ Ｍｅｄｗｉｅ ｎ
的ＰＲＩＳＭ ７７００型荧光定量ＰＣＲ仪进行实时定量
ＰＣＲ，按以下反应体系进行：２０ｔｚｌ ＰＣＲ体系中含２×
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｌ０ ｌ，ｃＤＮＡ ２ｔｚｌ，上
游引物ｌ ｌ，下游引物ｌ ｌ。扩增条件为９５ｃｃ ５ｍｉｎ
变性，９４ｃｃ ３０ｓ，５ｌｃｃ ３０ｓ，７２ｃｃ １ｍｉｎ，共４２个循环。
最后是７２ｃｃ ７ｍｉｎ延伸。
运用ＰＥ７７００全自动荧光定量ＰＣＲ仪，待反应
结束后，由电脑自动分析并计算结果。反应完毕后对
扩增产物作熔解曲线。
结果以Ｃｔ值表示。以２一地方法比较各组之间
ＮＲ２Ａ和ＮＲ２Ｂ基因表达差异，公式如下：
ＡＡＣｔ＝（ＡＣ ． 一△Ｃ ，Ｂ一 ）ｘ－（ａｃ ， 一△Ｃ Ｂ一 ）ｃ ｌ
ｘ表示任意组，Ｃｏｎｔｒｏｌ为空白组。计算各样本的
２ 。
１．８海马ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ含量测定
海马ＣＯＲＴ含量测定：将海马称重后加入到含
１０％ＥＤＴＡ・Ｎａ２ ３０ｔｄ的试管中，匀浆，混匀。４ｃｃ，
３０００ｒ／ｍｉｎ离心ｌＯｍｉｎ。取上清测定，按试剂盒说明书
操作。
海马Ｇｌｕ含量测定：将海马称重后置于煮沸的
生理盐水ｌｍｌ中煮沸３ｍｉｎ，再加１Ｎ冰醋酸０．５ｍｌ
于匀浆器中匀浆，再用１Ｎ ＮａＯＨ ０．５ｍｌ中和，混匀。
４ｃｃ，３０００ ｒ／ｍｉｎ离心ｌＯｍｉｎ。取上清液测定。按谷氨
酸生化试剂盒说明书操作。
１．９统计学分析
实验结果以均数±标准差表示。用统计学软件
对原始数据进行单因素方差分析。以Ｐ＜０．０５作为差
异显著性水平。
２结果
ＹＮ一３对慢性应激模型大鼠海马内ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ
含量的影响。见表２。ＹＮ一３对慢性应激模型大鼠海
马ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ表达的影响．见表３。由表２
可见，慢性应激刺激后大鼠海马中ＣＯＲＴ（ ０．０１）、
Ｇｌｕ（Ｐ＜０．０５）含量的明显升高。ＹＮ一３和氟西汀治疗后
可明显改善海马中ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ含量（Ｐ＜０．０５）。
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７５ ８０ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（￣（：）
图２ ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ及１３－ａｃｔｉｎ扩增产物溶解曲线图
表２ ＹＮ一３对慢性应激模型大鼠
呈 Ｑ ！ 的 堕 堑１
组别 鼠数 ＣＯＲＴ（ｎｇ／ｍ１） Ｇｌｕ（ｍｍｏｌ／Ｌ）
模型组８ １２４．１４￣７．１５② ４．０７＋０－３６①
中药组８ ７７．５９￣３．７８ １．７４＋０．２６
塑垫塑 堑：箜主 ： ！：兰 主 ：！！兰
与空白组相比：①Ｐ（Ｏ．０５，②Ｐ（０．０１；与模型组相比：③Ｐ（Ｏ．０５
表３ ＹＮ一３对慢性应激模型大鼠海马
墼△ 壁 里 △麦 的 喧 】
组别 鼠数 ＮＲ２ＡｍＲＮＡ ＮＲ２ＢｍＲＮＡ
模型组８ ８．１１＋０．１６ １１．５１＋６．５
中药组８ ３．９５￣０．３ｌ ５．８２￣４．Ｏ５
耍垫塑 ！：！ 主 ：Ｑ！竺 ！：！ 主 ： 兰
与空白组相比：①Ｐ（０．０１，与模型组相比：②Ｐ（Ｏ．０５，③Ｐ（Ｏ．０１
与人类常见的慢性、持续、低水平的应激源刺激促进
抑郁症的发生及发展的环境接近。当机体感受某种
应激原时，下丘脑一垂体一肾上腺轴（ＨＰＡ轴）兴奋性
提高，若ＨＰＡ轴功能持续亢进。机体长期处于应激
状态，高水平的ＧＣ。会导致耗能增加、免疫受抑、神
经营养因子表达降低。对机体十分不利。甚至威胁生
命。应激和ＧＣＳ增加海马内谷氨酸含量，与海马的
损伤有关。
Ｇｌｕ是中枢内一种重要的神经递质。海马内无
论是传人、传出或是中间神经元，绝大多数都属于
Ｇｌｕ能神经元．对突触的可塑性、学习和记忆均有重
要的作用。Ｇｌｕ为ＨＰＡ轴重要的兴奋物质，它们互
为因果，互相放大。一方面，应激时ＨＰＡ轴激活，引
起ＧＩｕ的堆积。造成海马的毒性；另一方面，细胞外
高水平的Ｇｌｕ又使ＨＰＡ轴功能亢进。使ＧＣ水平更
高。过多的Ｇｌｕ释放及其受体激活，引起神经元持续
去极化。导致离子渗透压力和电化学改变，细胞外谷
氨酸的堆积增加．使兴奋性氨基酸ＮＭＤＡＲ结合蛋
白水平及受体通道结合位点数目增加，离子通道开
放。引起Ｋ 大量外流。Ｃａ 、Ｎａ 、Ｃｌ一、Ｈ Ｏ内流，造成
细胞内钙离子超载。钙超载是神经元损伤的决定性
因素。除造成细胞损害外。还可激活胞内一系列继发
性损伤。
本研究观察长期慢性应激刺激增加大鼠海马内
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！望堡墨垦兰墨查： ！！：兰翌堂：苎 塑 ！竺！！ ！ ！ 竺： ！！： ： ！ ： ： ！： 塑
ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ含量，ＹＮ一３可以明显降低大鼠海马内 法，以调畅肝气，气机通畅，心神得养，郁证自除。中
ＣＯＲＴ的含量，有效纠正海马所处的应激状态，降低 药治疗抑郁等精神疾患具有疗效好、副作用小、不易
由ＨＰＡ轴亢进而导致的海马内Ｇｌｕ含量的增加，从 产生耐药性等优点，在中医理论的指导下，运用现代
而对海马负反馈机制起到良性调整作用。 医药研究方法开发研制安全有效的中药抗抑郁制
现已发现ＮＲ２Ａ和ＮＲ２Ｂ主要分布在包括海马 剂，是需要不断探索的课题。
在内的前脑，本研究采用荧光定量ＰＣＲ技术观察
ＮＲ２Ａ和ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ在慢性应激模型大鼠海马 参考文献
含量的变化，发现在海马表达含量明显升高，这一结 ［１１ Ｍｕｒｕａ ＶＳ，Ｇｏｍｅｚ ＲＡ，Ａｎｄｒｅａ ＭＥ，ｅｔ ａ１．Ｓｈｕｔｔｌｅ２ ｂｏｘ
果与以往研究相符。ＹＮ一３可降低海马ＮＲ２Ａ、 ｄｅ ‘ｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｎｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｔｒｅｓｓ：Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｂｙ
ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ表达，从而抑制ＮＭＤＡ受体门控通道 ｉ ｉｐ ｍｉ“ ｉ“ｉ ‘ ｉ 『ＪＩ．Ｐｈ Ｂｉ ＆Ｂｅｈａｖ，
的过度开放，减少钙离子内流，减轻长期慢性应激刺 ［２１张均田
．
新药发现的药理学基础 ．北京：化学工业出版社，
激产生的细胞内毒性作用。 ２００２
．
３３—３４．
有研究分别针对ＮＲ１、ＮＲ２Ａ和ＮＲ２Ｂ的特异 ［３１张建军，王景霞，高学敏，等．贯郁胶囊对嗅球损毁大鼠血浆促肾
性抗体观察［６１，比较三者在海马结构的详细分布，结 上腺皮质激素和皮质醇的影响『ＪＩ．北京中医药大学学报，
果ＮＲ１的免疫细胞化学表达最强，
ＮＲ２Ａ￣，提示海马ＮＭＤＡ受体复各物的组合
ＮＲ２Ｂ居中，
［４１
？？ ： （ ： …，．
差 Ｍ却ＤＡ…￣：
式，很可能以ＮＲ１／ＮＲ２Ａ／ＮＲ２Ｂ和ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ占多 （２）：１６１
．
数。我们的研究发现，慢性应激模型大鼠海马内 ［５１ Ｋａｔｚ Ｒ，Ｒｏｔｈ Ｋ，Ｃａｒｒｏｌｌ Ｂ．Ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｅｆｅｃｔｓ ｏｎ
ＮＲ２ＢｍＲＮＡ表达变化比ＮＲ２Ａ更为显著，这大概反 ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ
映了与ＮＭＤＡ受体复合物在特定条件下的组合形 ｐｒｅｓｓｉｏｎ『ＪＩ．Ｎ ｉ Ｂｉｏｂ Ｒ ， ９ ， ：２４ ・
式。 ［６１
中医学将抑郁症归人“郁证”范畴，认为其病因 ２００２
．
２５（２）：１２８－－１３２．
多由情志不遂、肝气郁结所致【 。ＹＮ一３是在以往研 ［７１龚绍麟．抑部症『Ｍ 京：人民卫生出版社，２００３．２．
究组方基础上的优化，采用疏肝解郁，宁心化痰之 【８ｌ钱之玉．现代文明病及其药物治疗与进展『Ｍ１．北京：化学工业出
版社．２００４．８．
国家“８６３计划”“脑血管病康复治疗新技术开发应用研究”
启动会议在复旦大学附属华山医院召开
２００８年１月１３日．国家高技术研究发展计划“８６３计划”“脑血管病康复治疗新技术开发应用研究”启动会议在复旦大学
附属华山医院隆重召开。来自北京大学、四ＪｌＩ大学、暨南大学、复旦大学、上海理工大学等大学的专家教授，以及康复医学科主任
胡永善教授、副主任朱玉连副教授、李放副教授和康复医学科的同仁参加了会议。
该项目是由复旦大学附属华山医院康复医学科副主任吴毅教授牵头，联合北京大学第一医院、四ＪｌＩ大学华西医院、暨南大
学附属第一医院．以及上海理工大学医疗器械学院等相关科室开展合作。本次申报的国家“８６３计划”项目，旨在对脑血管病患
者出现的功能障碍．研发新的康复治疗技术和新的康复治疗仪器，从而为脑血管病患者提供更便捷、更全面的康复治疗服务，以
改善脑血管病患者的功能障碍，提高其生活质量。
这次项目的申报成功是国内康复医学界第一次牵头承担国家“８６３计划”项目，这也是由复旦大学附属华山医院康复医学
科主任胡永善教授牵头完成国家“十五”攻关课题后，华山医院康复医学科再次牵头承担的国家级重大课题，这预示着我国的康
复医学事业在不断壮大和发展，科研能力在不断提高，已能够相继承担国家级重大科研项目。我们相信通过本项目的实施可进
一
步促使我国在脑血管病康复治疗新技术、新仪器的研发，推动我国康复医学事业全面发展。
复旦大学附属华山医院康复医学科
2024年10月7日发(作者：匡瑞灵)
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中国康复医学杂志，２００８年，第２３卷，第１期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｅ，Ｊａｎ．２００８，Ｖｏ１．２３，Ｎ０．１ｎ
基础研究・
中药新制剂（ＹＮ一３）干预慢性应激模型大鼠
海马ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ表达的研究
史榕荇 图 娅 ・２
摘要 目的：探讨中药新制剂（ＹＮ一３）对慢性应激模型大鼠海马ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含量的调节作用。方法：将３２只
ＳＤ雄性大鼠随机分为空白组、模型组、中药组（ＹＮ一３）、氟西汀组，每组８只。采用放射免疫法检测海马皮质醇（ＣＯＲＴ）．
比色法测定海马内Ｇｌｕ含量，ＰＣＲ法测定海马内ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含量。结果：与空白组相比，模型组海马内
ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ、ＮＲ２ＡｍＲＮＡ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含量明显升高，ＹＮ一３组和氟西汀组有效抑制海马内ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ、ＮＲ２Ａ
ｍＲＮＡ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ的过量表达。结论：慢性应激引起大鼠海马内ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含量增加．ＹＮ一３可能通过调整
ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ含量对抗海马内神经毒性作用。
关键词 慢性应激；中药；ＮＲ２ＡｍＲＮＡ；ＮＲ２ＢｍＲＮＡ；谷氨酸
中图分类号：Ｒ７４９．４．Ｒ４９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—１２４２（２００８）一０１—００３０—０４
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＹＮ－３ ｏｎ ＮＲ２Ａ，ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ／Ｓｉｌｌ
Ｒｏｎｇｘ，ｌｎｇ，ＴＵ ＹＭＩ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，２３（１）：３ 一３３
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＹＮ－３ ｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＮＲ２Ａ ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ
ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｉｒｔｙ—ｔｗｏ ｍａｌｅ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｅｖｅｎｌｙ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｏｌ，ｓｔｒｒｅｓｓ－ｍｏｄｅｌ，ａｎｄ
ＹＮ－３ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｐｒｏｚａｅ２２０ ｇｒｏｕｐ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｉｘｅｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ
ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ （ＣＯＲＴ）ａｎｄ Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ（Ｇｌｕ）ｉｎ ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｏ－ｃｈｅｍｉｒｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＮＲ２Ａ，ＮＲ２ＢｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｒａｔｓ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ＮＲ２Ａ ａｎｄ ＮＲ２ＢｍＲＮＡ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｏｌｒ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｒａｔｓ ＮＲ２Ａ，
ＮＲ２ＢｍＲＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｌｏｗｅｒｅｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｉｎ ＹＮ－３ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｍａｙ ｃａｕｓｅ ｈｉｇｌ１ ｌｅｖｅｌ
ＮＲ２Ａ ａｎｄ ＮＲ２ＢｍＲＮＡ ｉｎ ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ，ｗｈｅｒｅａｓ ＹＮ－３ ｃａｎ ａｄｊｕｓｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＲ２Ａ ａｎｄ ＮＲ２ＢｍＲＮＡ ｉｎ
ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｔｉｓｓｕｅ．
Ａｕｔｈｏｒ ｓ ａｄｄｒｅｓｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｃｕ—ｍｏｘｉｂｕｓｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＴＣＭ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００２９
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ；ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ；ＮＲ２Ａ；ＮＲ２Ｂ；Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ
抑郁症（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）是一种主要表现为显著而 性变、癫痫、肿瘤等许多重要的生理病理过程Ｉ２１。
现已发现ＮＭＤＡＲ至少存在７个亚单位．即
ＮＲ１亚单位、４种ＮＲ２亚单位（分为ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、
ＮＲ２Ｃ和ＮＲ２Ｄ）以及２种ＮＲ３亚单位（包括
ＮＲ３Ａ和ＮＲ３Ｂ）Ｉ３１。构成ＮＭＤＡＲ的亚单位常以受体
复合物的形式存在ｉ４１，其中ＮＲ１是受体复合物的功
能亚单位，ＮＲ２是调节亚单位，不同ＮＲ２的参与可
赋予通道复合物以不同的电生理学和药理学特性，
其基因表达的紊乱将导致受体复合物功能活性的改
变 。本研究采用荧光定量ＰＣＲ技术对慢性应激模
型大鼠海马ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ表达进行检测并观
基金项目：国家自然科学基金资助（３０４７２１８１）
ｌ北京中医药大学针灸推拿学院，１０００２９
２通讯作者：图娅（北京中医药大学针灸推拿学院，ｔｕｙａｂ＠２６３．ｎｅｔ）
作者简介：史榕荇，女，博士研究生
收稿日期：２００７－０３—０５
持久的心境低落的神经精神疾患，发病率呈上升趋
势，其病因至今尚不清楚。ＹＮ一３是治疗抑郁症的经
验方研制成的中药新制剂．实验证明，ＹＮ一３具有明
显的抗抑郁作用。本研究采用慢性应激大鼠模型，通
过测定海马内皮质醇（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ，ＣＯＲＴ）、谷氨酸
（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｇｌｕ）水平及ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ含
量．研究ＹＮ一３是否通过对海马内Ｎ一甲基一Ｄ一天门
冬氨酸受体（Ｎ～ｍｅｔｈｙｌ—Ｄ—ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，
ＮＭＤＡＲ或ＮＲ）的影响起到抗抑郁作用。
近年来研究表明．ＮＭＤＡＲ调控药物具有潜在
抗抑郁效应，是兴奋性氨基酸——Ｇ１ｕ受体的重要亚
型．属配基门控的离子通道，ＮＭＤＡＲ介导的Ｇｌｕ神
经兴奋毒性作用在脑损伤的众多环节中起着关键作
用Ｉ１１。ＮＭＤＡＲ在中枢神经系统中广泛参与学习、记
忆、突触可塑性、神经发育、缺血性脑损伤、神经退行
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里堕星 学杂志，２００８年，第２３卷，第１期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｅ，Ｊｎａｎ．２００８，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．１
察ＹＮ一３的干预作用。
１材料与方法
３１
刺激３次，共计２１ｄ，造成大鼠慢性应激抑郁模型，
每１３按ｌｍｌ／ｋｇ灌服生理盐水１次。③中药组：造模
同时，于每１３应激刺激前１ｈ灌胃给予ＹＮ一３，大鼠
１．１试剂与仪器
Ｔｒｉｚｏｌ ＲＮＡ提取试剂盒（美国Ｇｉｂｃｏ公司）；逆转
录一聚合酶链反应试剂盒、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、
按１．２ｍｇ／ｋｇ体重，浓度１．００ｇ／ｍｌ，共２１ｄ。④西药组
（氟西汀，ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ，商品名：百优解，美国产，批号
１０４０４１）：造模同时，于每日应激刺激前１ｈ灌胃给
药，大鼠按０．１８ｍｇ／ｋｇ ＢＷ，浓度为０．０１８ｍｇ／ｍｌ，共
２１ｄ。
Ａｃｃｅｓｓ（大连）；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ试剂盒
（美国应用生物公司）；琼脂糖（西班牙Ｂｉｏｗｅｓｔ公司）；
其他试剂均为国产分析纯。
５４１５Ｒ型高速离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；
１．４药物
ＹＮ一３由中国中医科学院药物研究所药物研究
室鉴定，使用前按照灌胃剂量煎药浓缩，浓度１．ｏ０ｇ，
ｍｌ，贮存于４℃冰箱中备用，用前加温。
１－５ ＲＮＡ提取
Ｇｅｎｅ １／型ＤＮＡ／ＲＮＡ测定仪（瑞典Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ公司）；ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００型普通ＰＣＲ仪及
ＰＲＩＳＭ ７０００型荧光定量ＰＣＲ仪（美国应用生物公
司）；ＤＹＣＰ一３１Ｄ型琼脂糖水平电泳槽（北京）；Ｉｍａｇｅ
ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ扫描仪（瑞典）。
ＣＯＲＴ放免试剂盒，由北京华英生物技术有限
公司提供。Ｇｌｕ生化试剂盒由南京建成生物工程研
究所提供
ＲＮＡ提取按Ｔｒｉｚｏｌ提取试剂盒操作说明书进
行。每个海马组织样本加入ｌｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ后吹打。１５—
３０℃孵育５ｍｉｎ；加入氯仿，盖紧盖子，用力摇动１５ｓ，
１５—３０℃孵育２—３ｍｉｎ，４ｏＣ １２０００ｇ离心１５ｍｉｎ。取
上清液至新ＥＰ管内，加入异丙醇（０．５ｍｌ异丙醇／１Ｉｌｌｌ
１．２动物分组及造模方法
雄性ＳＤ大鼠３２只，体重１７０＋＿１０ｇ，由北京维通
利华实验动物技术有限公司提供。通过开野实验将
水平运动次数加垂直运动次数不足３０次或超过
Ｔｒｉｚｏ１），１５—３０℃孵育样品１０ｍｉｎ，４￣Ｃ １２０００ｇ离心
ｌＯｍｉｎ，弃上清液；７５％冷乙醇洗涤沉淀一次，４℃
７５００ｄｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃乙醇，空气或真空干燥５—
１０ｍｉｎ；加ＤＥＰＣ处理水溶解ＲＮＡ，提取的ＲＮＡ质
１２０次的大鼠剔除，然后按体重随机分组，分为空白
组、模型组、中药组、西药组，每组８只。实验前各组
大鼠在２５℃安静环境内饲养１周，自然光照，通风良
量由Ａ２６０／Ａ２８０比值和１．５％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
１．６ ｃＤＮＡ制备
取１ｌｘｇ ＲＮＡ。以Ｏｌｉｇｏ ｄＴ为引物进行ＲＴ反转
录。２０１ｘｌ体系中含有５ｘＭ—ＭＬＶ缓冲液４ｌｘｌ，ｄＮＴＰ
１０ｍｍｏｌ，Ｒｎａｓｅｉｎ ２０Ｕ，Ｍ—ＭＬＶ ＩＯＯＵ，Ｏｌｉｇｏ ｄＴ
好，自由进食水。
１．３各组的处理方法
①空白组：每笼５只饲养，正常饮食饮水。②模
型组：采用慢性应激模型【５】结合孤养方式造模。每笼
１只饲养，慢性多种应激程序每１３随机安排以下一
２０ｐｍｏｌ，ＲＮＡ １ ｇ。逆转录反应条件为：２０￣Ｃ ５ｍｉｎ，
４２ｏＣ ６０ｍｉｎ，７０ｏＣ ５ｍｉｎ，冰浴冷却后置一２０℃保存。
１．７荧光定量ＰＣＲ
种：禁水（２４ｈ）、禁食（２４ｈ）、昼夜颠倒（２４ｈ）、夹尾
（１８０ｓ）、束缚（３ｈ）、冷水游泳（１４￣Ｃ，５ｍｉｎ）、电击足底（电
压为３０Ｖ，电击５ｓ，间歇５ｓ，共进行１２０ｓ），平均每种
Ｏｌｉｇｏ
ＮＲ２Ａ
根据ＮＣＢＩ数据库中的ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ及Ｂ—ａｃｔｉｎ
基因序列。以Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计引物，由北京赛
百盛基因技术有限公司合成（序列见表１）。在ＡＢＩ
表１荧光定量ＰＣＲ引物序列
引物序列 Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｓｉｚｅ（ｂｐ）
ＮＭ Ｏ１２５７３
Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｐｒｉｍｅｒ
５＇－ＴＡＧＧＡＧ１１ＧＣＴＧＴＣＧＧ ＩＴＡ一３
ＮＭ Ｏ１２５７４
ＮＲ２Ｂ
Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒ
ＲｅＶｅｒｓｅ
Ｐｒｉｍｅｒ
－
５ ＿ＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴＧＡＧ－３
５ ＿ＡＧＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＴ一３
ａｃｆｉｎ
Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｒｅｖｅ￣ｅ
Ｐ ｍ ｒ
５＇－ＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣ１ＩＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧ－３
５ 一Ｃ１ＩＧＡＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣ－３
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３２ 中国康复医学杂志，２００８年，第２３卷，第１期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉ０ｎ Ｍｅｄｗｉｅ ｎ
的ＰＲＩＳＭ ７７００型荧光定量ＰＣＲ仪进行实时定量
ＰＣＲ，按以下反应体系进行：２０ｔｚｌ ＰＣＲ体系中含２×
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｌ０ ｌ，ｃＤＮＡ ２ｔｚｌ，上
游引物ｌ ｌ，下游引物ｌ ｌ。扩增条件为９５ｃｃ ５ｍｉｎ
变性，９４ｃｃ ３０ｓ，５ｌｃｃ ３０ｓ，７２ｃｃ １ｍｉｎ，共４２个循环。
最后是７２ｃｃ ７ｍｉｎ延伸。
运用ＰＥ７７００全自动荧光定量ＰＣＲ仪，待反应
结束后，由电脑自动分析并计算结果。反应完毕后对
扩增产物作熔解曲线。
结果以Ｃｔ值表示。以２一地方法比较各组之间
ＮＲ２Ａ和ＮＲ２Ｂ基因表达差异，公式如下：
ＡＡＣｔ＝（ＡＣ ． 一△Ｃ ，Ｂ一 ）ｘ－（ａｃ ， 一△Ｃ Ｂ一 ）ｃ ｌ
ｘ表示任意组，Ｃｏｎｔｒｏｌ为空白组。计算各样本的
２ 。
１．８海马ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ含量测定
海马ＣＯＲＴ含量测定：将海马称重后加入到含
１０％ＥＤＴＡ・Ｎａ２ ３０ｔｄ的试管中，匀浆，混匀。４ｃｃ，
３０００ｒ／ｍｉｎ离心ｌＯｍｉｎ。取上清测定，按试剂盒说明书
操作。
海马Ｇｌｕ含量测定：将海马称重后置于煮沸的
生理盐水ｌｍｌ中煮沸３ｍｉｎ，再加１Ｎ冰醋酸０．５ｍｌ
于匀浆器中匀浆，再用１Ｎ ＮａＯＨ ０．５ｍｌ中和，混匀。
４ｃｃ，３０００ ｒ／ｍｉｎ离心ｌＯｍｉｎ。取上清液测定。按谷氨
酸生化试剂盒说明书操作。
１．９统计学分析
实验结果以均数±标准差表示。用统计学软件
对原始数据进行单因素方差分析。以Ｐ＜０．０５作为差
异显著性水平。
２结果
ＹＮ一３对慢性应激模型大鼠海马内ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ
含量的影响。见表２。ＹＮ一３对慢性应激模型大鼠海
马ＮＲ２Ａ、ＮＲ２ＢｍＲＮＡ表达的影响．见表３。由表２
可见，慢性应激刺激后大鼠海马中ＣＯＲＴ（ ０．０１）、
Ｇｌｕ（Ｐ＜０．０５）含量的明显升高。ＹＮ一３和氟西汀治疗后
可明显改善海马中ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ含量（Ｐ＜０．０５）。
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７５ ８０ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（￣（：）
图２ ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ及１３－ａｃｔｉｎ扩增产物溶解曲线图
表２ ＹＮ一３对慢性应激模型大鼠
呈 Ｑ ！ 的 堕 堑１
组别 鼠数 ＣＯＲＴ（ｎｇ／ｍ１） Ｇｌｕ（ｍｍｏｌ／Ｌ）
模型组８ １２４．１４￣７．１５② ４．０７＋０－３６①
中药组８ ７７．５９￣３．７８ １．７４＋０．２６
塑垫塑 堑：箜主 ： ！：兰 主 ：！！兰
与空白组相比：①Ｐ（Ｏ．０５，②Ｐ（０．０１；与模型组相比：③Ｐ（Ｏ．０５
表３ ＹＮ一３对慢性应激模型大鼠海马
墼△ 壁 里 △麦 的 喧 】
组别 鼠数 ＮＲ２ＡｍＲＮＡ ＮＲ２ＢｍＲＮＡ
模型组８ ８．１１＋０．１６ １１．５１＋６．５
中药组８ ３．９５￣０．３ｌ ５．８２￣４．Ｏ５
耍垫塑 ！：！ 主 ：Ｑ！竺 ！：！ 主 ： 兰
与空白组相比：①Ｐ（０．０１，与模型组相比：②Ｐ（Ｏ．０５，③Ｐ（Ｏ．０１
与人类常见的慢性、持续、低水平的应激源刺激促进
抑郁症的发生及发展的环境接近。当机体感受某种
应激原时，下丘脑一垂体一肾上腺轴（ＨＰＡ轴）兴奋性
提高，若ＨＰＡ轴功能持续亢进。机体长期处于应激
状态，高水平的ＧＣ。会导致耗能增加、免疫受抑、神
经营养因子表达降低。对机体十分不利。甚至威胁生
命。应激和ＧＣＳ增加海马内谷氨酸含量，与海马的
损伤有关。
Ｇｌｕ是中枢内一种重要的神经递质。海马内无
论是传人、传出或是中间神经元，绝大多数都属于
Ｇｌｕ能神经元．对突触的可塑性、学习和记忆均有重
要的作用。Ｇｌｕ为ＨＰＡ轴重要的兴奋物质，它们互
为因果，互相放大。一方面，应激时ＨＰＡ轴激活，引
起ＧＩｕ的堆积。造成海马的毒性；另一方面，细胞外
高水平的Ｇｌｕ又使ＨＰＡ轴功能亢进。使ＧＣ水平更
高。过多的Ｇｌｕ释放及其受体激活，引起神经元持续
去极化。导致离子渗透压力和电化学改变，细胞外谷
氨酸的堆积增加．使兴奋性氨基酸ＮＭＤＡＲ结合蛋
白水平及受体通道结合位点数目增加，离子通道开
放。引起Ｋ 大量外流。Ｃａ 、Ｎａ 、Ｃｌ一、Ｈ Ｏ内流，造成
细胞内钙离子超载。钙超载是神经元损伤的决定性
因素。除造成细胞损害外。还可激活胞内一系列继发
性损伤。
本研究观察长期慢性应激刺激增加大鼠海马内
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！望堡墨垦兰墨查： ！！：兰翌堂：苎 塑 ！竺！！ ！ ！ 竺： ！！： ： ！ ： ： ！： 塑
ＣＯＲＴ、Ｇｌｕ含量，ＹＮ一３可以明显降低大鼠海马内 法，以调畅肝气，气机通畅，心神得养，郁证自除。中
ＣＯＲＴ的含量，有效纠正海马所处的应激状态，降低 药治疗抑郁等精神疾患具有疗效好、副作用小、不易
由ＨＰＡ轴亢进而导致的海马内Ｇｌｕ含量的增加，从 产生耐药性等优点，在中医理论的指导下，运用现代
而对海马负反馈机制起到良性调整作用。 医药研究方法开发研制安全有效的中药抗抑郁制
现已发现ＮＲ２Ａ和ＮＲ２Ｂ主要分布在包括海马 剂，是需要不断探索的课题。
在内的前脑，本研究采用荧光定量ＰＣＲ技术观察
ＮＲ２Ａ和ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ在慢性应激模型大鼠海马 参考文献
含量的变化，发现在海马表达含量明显升高，这一结 ［１１ Ｍｕｒｕａ ＶＳ，Ｇｏｍｅｚ ＲＡ，Ａｎｄｒｅａ ＭＥ，ｅｔ ａ１．Ｓｈｕｔｔｌｅ２ ｂｏｘ
果与以往研究相符。ＹＮ一３可降低海马ＮＲ２Ａ、 ｄｅ ‘ｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｎｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｔｒｅｓｓ：Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｂｙ
ＮＲ２Ｂ ｍＲＮＡ表达，从而抑制ＮＭＤＡ受体门控通道 ｉ ｉｐ ｍｉ“ ｉ“ｉ ‘ ｉ 『ＪＩ．Ｐｈ Ｂｉ ＆Ｂｅｈａｖ，
的过度开放，减少钙离子内流，减轻长期慢性应激刺 ［２１张均田
．
新药发现的药理学基础 ．北京：化学工业出版社，
激产生的细胞内毒性作用。 ２００２
．
３３—３４．
有研究分别针对ＮＲ１、ＮＲ２Ａ和ＮＲ２Ｂ的特异 ［３１张建军，王景霞，高学敏，等．贯郁胶囊对嗅球损毁大鼠血浆促肾
性抗体观察［６１，比较三者在海马结构的详细分布，结 上腺皮质激素和皮质醇的影响『ＪＩ．北京中医药大学学报，
果ＮＲ１的免疫细胞化学表达最强，
ＮＲ２Ａ￣，提示海马ＮＭＤＡ受体复各物的组合
ＮＲ２Ｂ居中，
［４１
？？ ： （ ： …，．
差 Ｍ却ＤＡ…￣：
式，很可能以ＮＲ１／ＮＲ２Ａ／ＮＲ２Ｂ和ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ占多 （２）：１６１
．
数。我们的研究发现，慢性应激模型大鼠海马内 ［５１ Ｋａｔｚ Ｒ，Ｒｏｔｈ Ｋ，Ｃａｒｒｏｌｌ Ｂ．Ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｅｆｅｃｔｓ ｏｎ
ＮＲ２ＢｍＲＮＡ表达变化比ＮＲ２Ａ更为显著，这大概反 ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ
映了与ＮＭＤＡ受体复合物在特定条件下的组合形 ｐｒｅｓｓｉｏｎ『ＪＩ．Ｎ ｉ Ｂｉｏｂ Ｒ ， ９ ， ：２４ ・
式。 ［６１
中医学将抑郁症归人“郁证”范畴，认为其病因 ２００２
．
２５（２）：１２８－－１３２．
多由情志不遂、肝气郁结所致【 。ＹＮ一３是在以往研 ［７１龚绍麟．抑部症『Ｍ 京：人民卫生出版社，２００３．２．
究组方基础上的优化，采用疏肝解郁，宁心化痰之 【８ｌ钱之玉．现代文明病及其药物治疗与进展『Ｍ１．北京：化学工业出
版社．２００４．８．
国家“８６３计划”“脑血管病康复治疗新技术开发应用研究”
启动会议在复旦大学附属华山医院召开
２００８年１月１３日．国家高技术研究发展计划“８６３计划”“脑血管病康复治疗新技术开发应用研究”启动会议在复旦大学
附属华山医院隆重召开。来自北京大学、四ＪｌＩ大学、暨南大学、复旦大学、上海理工大学等大学的专家教授，以及康复医学科主任
胡永善教授、副主任朱玉连副教授、李放副教授和康复医学科的同仁参加了会议。
该项目是由复旦大学附属华山医院康复医学科副主任吴毅教授牵头，联合北京大学第一医院、四ＪｌＩ大学华西医院、暨南大
学附属第一医院．以及上海理工大学医疗器械学院等相关科室开展合作。本次申报的国家“８６３计划”项目，旨在对脑血管病患
者出现的功能障碍．研发新的康复治疗技术和新的康复治疗仪器，从而为脑血管病患者提供更便捷、更全面的康复治疗服务，以
改善脑血管病患者的功能障碍，提高其生活质量。
这次项目的申报成功是国内康复医学界第一次牵头承担国家“８６３计划”项目，这也是由复旦大学附属华山医院康复医学
科主任胡永善教授牵头完成国家“十五”攻关课题后，华山医院康复医学科再次牵头承担的国家级重大课题，这预示着我国的康
复医学事业在不断壮大和发展，科研能力在不断提高，已能够相继承担国家级重大科研项目。我们相信通过本项目的实施可进
一
步促使我国在脑血管病康复治疗新技术、新仪器的研发，推动我国康复医学事业全面发展。
复旦大学附属华山医院康复医学科