2024年8月31日发(作者：仪寄波)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.8
(22)申请日 2014.04.10
(71)申请人 武汉启瑞科技发展有限公司;华中科技大学
地址 430000 湖北省武汉市东湖高新技术开发区庙山小区
(72)发明人 鲁友明 裴磊 朱铃强 徐传瑞
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所
代理人 王敏锋
(51)
C07K14/00
A61K38/16
A61P9/10
A61P25/00
(10)申请公布号 CN 103936838 A
(43)申请公布日 2014.07.23
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
小分子多肽TAT-p53DM及其在制
备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用
(57)摘要
本发明公开了小分子多肽TAT-
p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中
药物中的应用，利用人工合成TAT蛋白转
导结构域和p53DM的融合蛋白多肽TAT-
p53DM，TAT可以携带p53DM蛋白多肽
经血液穿过血脑屏障被神经元摄取，将其
运用到离体和在体的缺血性卒中模型上，
可有效发挥其阻断神经元死亡相关蛋白激
酶1死亡结构域（DAPK1DD）与肿瘤抑制
蛋白p53DNA结合基序（p53DM）结合的
生物学作用，抑制DAPK1下游引起神经
元凋亡与坏死的信号，降低缺血性卒中后
脑损伤，为进一步开发临床治疗缺血性卒
中的药物提供了分子靶点。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种人工合成的小分子多肽，其序列为SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述小分子多肽的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1或权利要求2所述的序列在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：权利要求1或权利要求2所述的序列
在制备治疗或预防缺血性卒中小鼠药物中的应用。
6.权利要求1或权利要求2所述的序列在制备降低缺血后神经元坏死药物中的应用。
7.权利要求1或权利要求2所述的序列在制备降低缺血后神经元凋亡药物中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及医学疾病治疗药物研发领域，具体涉及一种小分子多肽TAT-p53DM，
还涉
用。
技术背景
脑卒中以高发病率、高死亡率、高致残率等特点，被公认为目前严重危害人类健康
和生 命安全的常见难治性疾病，缺血性脑卒中是由于脑血流中断（缺血）
的一类严重神经疾病，患者会突然出现瘫痪，语
通常每40秒就有一例脑卒
的死亡
及小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应
引起的血栓形成或栓塞
言功能损伤或视力丧失甚至死亡。在美国，
中发生，每4分钟就有一例死亡，据2007年的数据统计，脑卒中
率高达41.6%。伴随着人口老龄化，这个绝对数量还在逐渐上升。在幸存者当中，
7 0%的人工作能力受到损害，30%生活不能自理。因此，给家庭和社
和精神负担。在美国，2010年脑卒中的估计花
2万亿美元。在俄罗斯和中
害所采
会都造成了严重的经济
费在73.7亿美元，而到2050年，会达到1.5
国，每十万人口死亡率比美国高5-10倍。然而，针对脑缺血损
取的治疗手段非常有限，目前唯一有效的治疗是运用组织纤溶酶原激活物(tPA)的
溶 栓疗法。出于安全考虑和溶栓治疗的时间窗较窄（<4.5小时），
治疗。迄今为止，实验室针对脑缺血治疗
约200项临床试验，
多数患者只能得到对症支持
所开发的小分子化合物已超过1000种，并开展了
但所有这些方法运用到临床都面临失败，因此，针对缺血性卒中脑损伤，
在局部缺血的情况下，缺氧缺糖会耗尽细胞能量，从而导致广泛的有害细胞反应。
这些 反应包括离子稳态的失衡，活性氧（ROS）和活性氮(RNS)的产生，
探讨新的治疗方法对抗脑损伤减少神经细胞死亡极其重要。
以及线粒体功能障碍。 结果，细胞通过坏死和凋亡两种途径走向死亡。
已知坏死和凋亡是通过多种信号通路如Ca2+超载和
ROS/RNS产生所激活，并和谷氨酸递质（NMDA）受体的过度兴奋有关。然而，
谷氨酸受体也参与正常基因表达，神经可塑性和神经元存活等重要生理功能，
谷氨酸受体并不是治疗缺血性卒中的理想靶点。 因此直接拮抗
TAT称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides)，是近年来发现的一种新型的高效运输
载 体。TAT能穿透细胞膜、细胞核膜，携带肽、蛋白质和DNA分子等
和胞核发挥生物效应。为提高靶细胞在体内外的
简便的方法。目前的体内及
织细胞，
通过受体转运进入胞质
基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、
体外试验显示HIV-TAT，可以穿过包括神经元细胞在内的所有组
且未观察到明显的毒副作用。TAT可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟
内 转导进入细胞，而且在体内可以通过血液
质细胞内，被带入细循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶
胞的多肽或蛋白质则保留了它们各自原有的生物活性，从而发挥其生物
基于申请人最近的研究与TAT技术，申请人合成了一个由p53DM的氨基酸271-
282序列 （270RVCACPGRDRRT281）组成的膜渗透性小分子多肽
体的缺血性卒中模型上，有效发挥
制DAPK1下
学作用。
TAT-p53DM，通过运用到离体和在
其阻断神经元DAPK1DD与p53DM结合的生物学作用，抑
游引起神经元凋亡与坏死的信号，降低缺血性卒中后脑损伤，为进一步开发临
发明内容
本发明目的在于提供了一种小分子多肽TAT-p53DM，其序列为SEQ ID NO.1所示。
床治疗缺血性卒中的药物提供了分子靶点。
本 发明将TAT穿膜肽(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-
3蛋白的DNA结合基序（p53DM）的一
s-Pro-Gly-Arg-Asp-
Arg,YGRKKRRQRRR)与p5
段氨基酸序列（氨基酸270-281，Arg-Val-Cys-Ala-Cy
Arg-Arg-Thr,RVCACPGRDRRT）连接，得到具有生物活性的TAT-p53D
M小分子多肽，利用TAT的穿膜功能将p53DM多肽输送进入血液穿过血
经细胞摄取从而发挥其生物学功能。 脑屏障，并被大脑神
本发明的目的还在于提供了小分子多肽TAT-p53DM对应的核苷酸序列，具体为
SEQ ID NO.2所示（tatggccgcaaaaaacgccgccagcgccgccgc-
但不局限于该序列，所有编
cgcgtgtgcgcgtgcccgggccgcgatcgccgcacc），
码TAT-p53DM多肽的核苷酸序列都为本发明的保护范围。
本发明的另一个目的在于提供了一种小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺
血 性卒中药物中的应用，将其与神经元细胞共同孵育或是静脉注射，发
卒中后神经元死亡(坏死与凋亡)，并明显改善缺
现其可有效降低缺血性
血后神经系统症状与行为学的效应。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明的思路如下：
申请人发现，缺血性卒中后，死亡相关蛋白激酶1
（Death Associated Protein Kinase1,
DAPK1）的死亡功能域
（Death Domain,DD）和肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合基序（D
NA binding Motif,DM）相互作用，并介导下游神经元坏死与凋亡。阻断
3DM的相互作用，能有效降低缺血性卒中后神经元死
人将TAT穿膜肽(Tyr-Gly-Arg-
蛋白DNA结
DAPK1DD与p5
亡(坏死与凋亡)。针对这一发现，申请
Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg,YGRKKRRQRRR)与p53
合基序（p53DM）的一段氨基酸序列（氨基酸270-281，Arg-Val-Cys-Ala-Cys-
Pro-Gly-Arg-Asp-Arg-Arg-Thr,RVCACPGRDRRT）
多肽，通过对离体培养的神经元进
在体静脉注射
连接，获得具有生物活性的TAT-p53DM
行孵育，TAT-p53DM多肽直接被神经元摄取；也可通过
方式，使TAT-p53DM多肽进入血液穿过血脑屏障并被大脑神经细胞摄取发挥
一种小分子多肽TAT-p53DM，其序列如下：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Gly-Arg-
Asp-A
TAT-p53DM的对照为TAT-scramble-p53DM（TAT-s-p53DM），其序列为：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Pro-Gly-Glu-Cys-Val-Arg-
Thr-Ar
TAT-p53DM多肽及其对照TAT-s-p53DM为商业化公司合成。
小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应用，其应用过程如
下：
（1）TAT-p53DM在缺血性卒中细胞模型的应用
氧糖剥夺（Oxygen Glucose Deprivation,OGD）被广泛认为是缺血性中风的体外细
胞 模型。我们对体外培养10天的原代神经细胞进行OGD处理60分钟
OGD处理的情况下，PI标记出46%细胞坏死，
经过90分钟OGD处理后，
g-Arg-Arg(YGRKKRRQRRR-CCPGECVRTRRR)。
rg-Arg-Thr（YGRKKRRQRRR-RVCACPGRDRRT）。
其生物学功能。
和90分钟，在60分钟
TUNEL标记出21%的细胞凋亡。当培养物
PI标记出89%细胞，18%细胞对TUNEL出现阳性反应，可见 大部分细胞在
OGD处理下死亡。用5μM的TAT-p53DM对培养的原代神经元进行孵育处
理，OGD处理后的原代培养神经元，被PI和TUNEL标记的细胞数目显著
-p53DM处理可以在细胞水平降低缺血后神经元死亡。 减少，说明TAT
（2）TAT-p53DM在缺血性卒中动物模型的应用
大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）是公认的脑缺血动物模
型，通过向小鼠颈动脉中插入线拴堵塞大脑中动脉能引起大脑中动脉支配的
拔出线拴，则引起血流再灌注，从而引起缺血再灌注损
状。通过TTC染色反映缺血梗死
实验Rotarod
皮层纹状体缺血，
伤，以模拟临床脑梗塞或脑栓塞的症
体积，TUNEL及FJ染色反映缺血后神经元的死亡，转棒
反映动物协调平衡能力，神经系统功能评分（Neurological Score,N.S.）反映
缺血后神经系统症状，水迷宫实验反映动物运动与学习记忆能力。对动物缺
小时和6小时的小鼠股静脉注射1mg/ml的TAT-p53DM溶液，
取出脑组织，TTC染色显示给予TAT-
p53DM或生理盐水
血再灌注后3
动物缺血再灌注第7天处死，
p53DM的小鼠脑缺血梗死体积显著低于对照组TAT-s-
Vehicle组。TUNEL及FJ染色显示，给予TAT-p53DM的小鼠缺血后神
经细胞死亡数量显著低于对照组TAT-s-p53DM或生理
注射的小鼠转棒行为学与水迷宫行
进一步证明，
盐水Vehicle组。此外，TAT-p53DM
为学结果均较TAT-s-p53DM或Vehicle组得到显著改善。
TAT-p53DM对缺血性卒中模型具有确切的治疗作用。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
（1）本发明所涉及的小分子多肽TAT-p53DM合成纯度高，完全可溶，适合静脉
注射， 无毒副作用，便于转化生产；
（2）本发明利用人工合成TAT蛋白转导结构域和p53DM的融合蛋白多肽，意在
采用静 脉注射的方式达到改善缺血性卒中后神经系统症状，减少缺血
的目的。本发明公开的人工合成的TAT-
肽经血液穿过血脑屏
性卒中神经细胞死亡和脑损伤
p53DM重组蛋白多肽，TAT可以携带p53DM蛋白多
障被神经元摄取，可以转化应用于神经系统疾病如缺血性卒中，使其具
附图说明
图1为一种小分子多肽TAT-p53DM的人工合成色谱图。
图2为TAT-p53DM阻断神经元DAPK1DD与p53DM结合的结果示意图。
图3为离体细胞水平TAT-p53DM对缺血性卒中治疗作用的流程图。
图4为TAT-p53DM减少OGD处理后神经元坏死及凋亡的结果统计图。
图5为在体动物水平TAT-p53DM对缺血性卒中治疗作用的实施方案图。
图6为TAT-p53DM减少缺血性卒中后缺血梗死体积与神经元死亡的结果统计图。
图7为TAT-p53DM改善缺血性卒中后运动功能及神经系统症状的结果统计图。
图8为TAT-p53DM改善缺血性卒中后学习与记忆功能的结果统计图。
具体实施方式
有实际操作的可行性。
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有细胞培
养， 凋亡与坏死染色，缺血动物模型，静脉注射以及组织学与行为学的所
术人员所熟知。本发明中未详细阐述的请参见文有操作方法为本领域技
献（①Tu W,Xu X,Peng L,Zhong X,Zh
he
n Y,Lu Y(2010)DAPK1interaction with NMDA receptor NR2B subunits mediate
damage in 140:222-234；s brain
ang W,Soundarapandian MM,Balel C,Wang M,Jia N,Zhang W,Lew F,Chan SL,C
②Yang Y,Shu X,Liu D,Shang Y,Wu Y,Pei L,X
u X,Tian Q,Zhang J,Qian K,Wang YX,Petralia RS,Tu W,Zhu LQ,Wang JZ,Lu Y
on of miR-124and 73:774-788.）的材料
(2012)EPAC null muTATion impairs learning and social interactions via aberrant
regulati
与方法部分说明。
实施例1：
TAT-p53DM的人工合成
TAT-p53DM的序列为SEQ ID NO.1所示，由武汉百意欣生物技术有限公司人工合
成，合成
TAT-p53DM人工合成HPLC报告
表1
报告如下所示，色谱如图1所示。
合成后TAT-p53DM多肽纯度为99%，每只5mg，为白色粉末状，避光保存于-20
度，完全 可溶于水。使用前，用无菌生理盐水按指定浓度进行稀释配制。
于37度温箱预热。 用于细胞或用于动物前，置
TAT-p53DM的对照为TAT-scramble-p53DM（TAT-s-p53DM），其序列为：Tyr-
Gly-Ar g-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Pro-Gly-Glu-Cys-
RKKRRQRRR-CCPGECVRTRRR)，也为Val-Arg-Thr-Arg-Arg-Arg(YG
该公司合成。
实施例2：
TAT-p53DM阻断神经元DAPK1DD与p53DM的结合的生物学作用，抑制DAPK1
下游引
分别用慢病毒包装Flag标记的DAPK1DD质粒（Flag-DAPK1DD）和GST标记的
p53DM 质粒（GST-p53DM）后，共转染体外培养第10天的原代神经
13天），给
起神经元凋亡与坏死的信号
元，转然后第3天（原代培养第
予浓度为5μM的TAT-p53DM合成肽或对照TAT-s-p53DM或Vehicle孵育，2小
时后 提取细胞蛋白。先用抗Flag的抗体沉淀细胞蛋白，再用抗GST的抗
检测到NC膜上黑色印迹表明DAPK1DD
抗GST的抗
体去检测沉淀下来的蛋白，
与p53DM相互作用。结果显示：给予TAT-p53DM后，
体无法检测到NC膜上的GST-p53DM蛋白，提示DAPK1DD与p53DM的相互作
用 被TAT-p53DM所阻断，而在给予TAT-s-p53DM的对照组NC膜上，
则说明DAPK1DD与p53DM的相互作用
我们对感染了
有明显检测到的黑色印迹，
不能被对照多肽TAT-s-p53DM所阻断（图2A）。同时
含有Flag-DAPK1DD与GST-p53DM病毒的神经元进行了MTT检测，该检测能
反映神经元生存活力（Viability）。给予5μM的TAT-p53DM合成肽或对照
hicle孵育，结果显示，与TAT-s-p53DM（9%±4%）或
DM能显著增加神经细胞的活力
K1DD与
TAT-s-p53DM或Ve
Vehicle（6%±2%）比较，TAT-p53
（58%±7%）(图2B)，说明TAT-p53DM阻断了神经元DAP
p53DM结合的生物学作用，抑制DAPK1下游引起神经元凋亡与坏死的信号。
实施例3：
TAT-p53DM在缺血性卒中细胞模型中的应用
（1）原代神经元培养与缺血性卒中OGD细胞模型的构建
从母鼠子宫取出胚胎期第20天的小鼠，迅速浸入75%乙醇，断头后，于解剖液
（D-Han k’s Solution）中取出大脑皮层组织，用木瓜消化酶试剂盒
ngton Biochemical Corporation）消化分离
赖氨酸和层粘连蛋白
（papain dissociation kit,Worthi
皮层细胞，细胞种植于包被有30微克/毫升的多聚
的19平方毫米盖玻片，细胞种植密度约为100–150个细胞/平方毫米，
盖玻片置于含新鲜无血清Neurobasal培养基(21103,GIBCO)与2%B27的12
天更换新鲜相同培养基。通过对培养的神经元进行神经
细胞染色证明所培养细胞85%以上为神
孔板中，每隔4
元标记物β-tubulin III(Tuj1)的免疫
经元。
为模拟缺血性卒中的细胞模型，12孔板中的神经元在培养第10天
（Days in vitro10,D IV10）给予氧糖剥夺（OGD）处理，即将培养神经元
的12孔板放入含5%CO2，10%H2和85%
N2的厌氧培养箱中。用500μl的去氧无糖碳酸氢盐溶液置换此
然后将细胞置于37℃厌氧培养箱分别维前的培养液，并润洗三次，
持60分钟和90分钟。随后，再用含氧含糖(葡萄糖，2
换去氧无糖培养液，并在37℃含
0mM)的碳酸氢盐置
5%CO2/10%H2/85%O2的潮湿培养箱
中维持培养72小时。至此，缺血性卒中的细胞模型建立完成，随即可对培
AT-p53DM治疗(图3)。 养的神经元进行T
（2）TAT-p53DM在缺血性卒中OGD细胞中的应用
为了明确TAT-p53DM的最佳应用浓度，上述原代培养的神经元在OGD处理后，
恢复到 常规培养箱和培养基条件2小时，
度TAT-12孔板每孔500μl的培养基给予10μl37度预热的不同浓
p53DM（1μM，3μM和5μM）进行孵育，观察其抑制DAPK1与p53相互作用的
效果。因为DAPK1与p53的相互作用是引起下游细胞死亡信号的触发因素。
1与p53相互作用的TAT-p53DM的最佳浓度被选择用
应用效果评价。
因此抑制DAPK
于后续OGD处理后细胞凋亡与坏死的
原代培养的神经元在OGD处理后，恢复到常规培养箱和培养基条件下培养2小时，
12孔 板每孔500μl的培养基给予37度预热的10μl上述最佳治疗浓度的
液孵育，继续在37℃含TAT-p53DM生理盐水溶
5%CO2/10%H2/85%O2的潮湿培养箱中继续维
持培养70小时后进行P
3)。
（3）TAT-p53DM应用效果评估
碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在坏
死 的细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此PI染色可大致反
步骤为：先用PBS稀释10μM PI溶液，将PI溶
I与TUNEL染色观察坏死与凋亡的细胞数量(图
映细胞的坏死程度。具体
液用微量加样枪按1/10体积加入细胞培养液中 （50μl/500μl）。随后在
API1μl37oC条件下孵育15分钟，用PBS润洗两次后，加入细胞核染液D
孵育10分钟后，直接在荧光显微镜下以535nm的激发光照射下观察拍照。红色标
记
细胞发生凋亡时，细胞内源性核酸内切酶激活导致核染色质DNA双链的断裂，大
量DN A片段暴露出的3’羟基末断在末断转移酶
聚酶的作用下，与
细胞为阳性坏死细胞。
(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)和DNA多
FITC荧光素标记的核苷酸结合，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。
因此用凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL）所标记的细胞多少反
具体步骤为：贴壁细胞先用PBS润洗，随后用含
上孵育细胞2分钟，新鲜配
孔加入
映细胞凋亡程度。
0.1%Trition-X-100的0.1%柠檬酸钠溶液在冰
制TUNEL反应液（酶溶液/标记溶液，1:9混合）后，按12孔板每
50μl反应液于贴壁细胞中，37℃条件下孵育1小时，最后直接在荧光显微镜下以
488
TAT-p53DM的最佳应用浓度：通过提取不同浓度TAT-p53DM孵育的细胞蛋白，
进行免 疫共沉淀实验，先用抗DAPK1的抗体去沉淀细胞蛋白，再用
的蛋白进行免疫印迹染色，通过化学发光
1所沉淀的p53蛋白，
nm激发光照射下观察拍照。绿色标记细胞为阳性凋亡细胞。
抗p53的抗体对沉淀在NC膜上
对免疫印迹膜进行曝光成像，黑色条带显示DAPK
提示DAPK1与p53的相互作用。当给予5μM TAT-p53DM时，NC膜上
的黑色条带消失，说明该浓度完全抑制DAPK1与p53的相互作用，也说明
M是最佳的治疗给药浓度（图4A）。 5μM TAT-p53D
接下来，我们对体外培养10天的原代神经细胞进行OGD处理60分钟和90分钟，
在60分 钟OGD处理的情况下，PI标记出46%细胞坏死，TUNEL标
经过90分钟OGD处理后，18%细胞对
分细胞在OGD处理
记出21%的细胞凋亡。当培养物
TUNEL出现阳性反应，PI标记出89%细胞，可见大部
下死亡。用5μM的TAT-p53DM对培养的原代神经元进行孵育处理，OG
D处理90分钟后的原代培养神经元，被PI和TUNEL标记的细胞数目显著
凋亡和坏死率分别是3%和12%，说明TAT-
亡，表明TAT-
减少(图4B)，其细胞
p53DM处理可以在细胞水平降低缺血后神经元死
p53DM具有治疗缺血性卒中的作用。
实施例4：
TAT-p53DM在缺血性卒中小鼠模型中的应用
（1）缺血性卒中小鼠模型的建立
运用大脑中动脉栓塞MCAO小鼠模型模拟缺血性脑卒中，具体方法为：术前麻醉
小鼠， 颈部做1-2cm长正中切口后，分离右侧颈总动脉，暴露颈外
向颈内插入直径约0.1mm尖端包被
CA,USA)，插入深度
与颈内动脉分叉，从颈外动脉
0.2mm直径硅胶的尼龙线栓(Doccol Co.,Redlands,
约0.8-1.0cm，至大脑中动脉前段起始部。1小时后，小心移除线栓，
恢复颈总动脉灌注，缝合伤口。假手术组动物(Sham)除了不插入线栓外，其
AO模型动物相同。整个手术过程中，尽量减少污染，
Apparatus,Holliston,MA,USA)维持
余步骤均与MC
施行无菌操作，并用加热毯(Harvard
动物体温于37℃±0.5℃。
（2）TAT-p53DM静脉注射
在小鼠脑缺血再灌注后3小时以及6小时，用注射器经股静脉缓慢单次注射
1mg/kg TAT-p53DM(TAT-RVCACPGRDRRT)或对照TAT-s-
菌生理盐水(Vehicle)。多肽浓度为
在缺血再灌注
p53DM(TAT-CCPGECVRTRRR)或无
1mg/ml,用无菌生理盐水溶解。TAT-p53DM静脉注射后，
7天后的小鼠脑组织切片进行TTC染色观察梗死病灶，FJ染色观察细胞死亡
情况，第7天至第14天进行水迷宫行为检测，评估TAT-p53DM的治疗效
小鼠28天内指定时间点连续观测转棒行为，并在第28
一步明确TAT-p53DM对缺血性卒
果，缺血再灌注
天进行神经系统症状评分（N.S.）进
中的治疗作用(图5)。
（3）TAT-p53DM治疗效果评估
TTC染色检测缺血梗死体积：TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏
感复 合物，1894年首次合成用来检测种子的生存能力，1958年开始用来
缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统
呈红色，而缺血组织内脱氢
染色检测哺乳动物组织的
的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而
酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。具体操作步骤
如下：MCAO模型动物于缺血再灌注7天后麻醉处死，迅速
分钟，新鲜配置2%TTC PBS溶液，避光
后作连续冠状切片，
取出完整脑组织，-20℃速冻20
于37℃保存备用。-20℃取出脑组织后，迅速从前向
切片厚度约1毫米。然后将切片置于2%TTC PBS溶液中，37℃避光孵
育30分钟。染色结果可见，正常脑组织区域为红色，而缺血区不被着色。
4%多聚甲醛PBS溶液中固定，最后对固定的脑切片缺
后各0.3厘米区域的连续6张切片，
染色后，切片置于
血面积进行统计分析。选取前囟点前
运用图像分析软件(Image J1.37v,Wayne Rasband,avail
able through National Institutes of Health)计算分析缺血体积
（Infarction,mm3）。
Fluoro-Jade C（FJ-C）与TUNEL染色：缺血再灌注第7天，麻醉小鼠后经心脏主
动脉灌 流，分别用0.9%生理盐水和冰冷的4%多聚甲醛PBS溶液灌
在相同多聚甲醛液中后固定6-8小时后，
片厚30μm，切片保
流固定脑组织。取出脑组织后，
置于30%蔗糖溶液，脑组织沉底后进行冰冻切片，
存于PBS溶液中，进行随后的FJ-C与TUNEL染色。①FJ-C染色：切片贴
于明胶载玻片后晾干，先置于100%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟以及双蒸
含0.01%Fluoro-Jade(Millipore)和0.1%醋酸(1:10)的混合
用水进行润洗，二甲苯快速透明后
察绿色标记的
水中1分钟，随后在
液中避光室温下孵育30分钟。随后
用DPX封片剂（Sigma）封片，显微镜用488nm激发光观
阳性细胞，即为变性死亡的细胞。②TUNEL染色原理如上述，具体操作方法
如下：冰冻切片贴于明胶载玻片后晾干，先用PBS润洗，随后用含
的柠檬酸钠溶液在冰上孵育细胞2分钟，新鲜配
合）后，按每张脑切片加入
镜下以
0.1%Trition-X-100的0.1%
制TUNEL反应液（酶溶液/标记溶液，1:9混
50μl反应液在37℃条件下避光孵育1小时，最后直接在荧光显微
532nm激发光照射下观察拍照。红色标记细胞核为阳性凋亡细胞。
分别运用Longa行为障碍评分和转棒仪实验对MCAO模型小鼠运动功能进行检测。
具体 为：①Longa行为障碍评分：0分，无神经功能缺失症状；1分，不
分，爬行时出现对侧转圈；3分，行走时身体向
得分越高表明动物行为障碍
4天，
能完全伸展对侧前爪；2
对侧倾倒；4分，不能自行行走，意识丧失。
越严重。②转棒仪试验：MCAO手术前(第0天),手术后第7天,1
21天和28天运用大鼠转棒仪(Ugo Basile,Italy)测试手术前后动物的运动功能。转棒
仪 工作模式如下：在4转/分(rpm)的匀速模式下，从放置动物到动物落
为滞留时间，反映动物的四肢肌力及运动协调能
记录并计算平均滞留时间以
天。滞
下的时间被记录下来作
力。实验前，动物训练两天，每天训练3次，
获得稳定的基础值。转棒仪正式实验每天进行3次，间隔检测28
留时间RT值越低，表明动物运动功能越差。
Morris水迷宫实验是1981年由Morris建立，通过让实验动物游泳并学习寻找隐藏
在水中 平台的方法来测试实验动物对空间位置觉和空间定位的学习记
间记忆实验：忆能力。具体操作如下：①空
实验历时6天。实验开始前半小时将小鼠置于水迷宫房间适应环境，每天每只
小鼠训练4次。实验者将小鼠以手托起令其面向池壁，轻轻放入水中。小鼠
到平台，则记录其搜寻并登上平台所需要的时间，即潜
未能找到平台，潜伏期记为60秒，
的参照物来进
在60秒内能寻找
伏期（Latency）。若小鼠在60秒内
并由实验者引导至平台上停留30秒，以让其根据4个象限
行空间学习和记忆。每只小鼠总计训练24次，计算每天各组小鼠潜伏期，游泳
距离(Length)。②空间探索实验用于测量动物对平台空间位置的记忆能力。
随机选择入水点，将小鼠按上述方法置于水中，游泳
adrant）的滞留时间(Time)反映动
在第7天撤除平台，
60秒，测量小鼠在目标象限（target qu
物的空间位置记忆能力。
对动物缺血再灌注后3小时，6小时的小鼠股静脉注射1mg/ml TAT-p53DM溶液，
动 物缺血再灌注第7天处死，取出脑组织，TTC染色显示小鼠脑缺血
m3），给予TAT-p53DM后脑缺血梗死体积（infarction,m
梗死体积为12.3±2.4mm3，虽然高于Sham组的1.6±0.
3mm3，但显著低于对照组TAT-s-p53DM的
16.5±2.1mm3或生理盐水Vehicle组的17.2
±2.3mm3(图6A)。FJ-C与TUNEL染色显示，给予TAT-p53DM
亡数量分别为：28±2和7±1个，显著低于对照
2个或生理盐水vehicle组136±21
1个)（图6B）。此外，小
停留在
的小鼠神经细胞坏死与凋
组TAT-s-p53DM的133±24和32±1
和48±12个，且接近于Sham组水平(15±2和5±
鼠转棒行为学结果显示，缺血后第7天，TAT-p53DM注射的小鼠
转轮上的时间（Stay on rotarod）为64±4秒，虽然低于Sham组102±15秒，但
较TAT-s-p53DM注射小鼠的38±3秒与Vehicle注射小鼠的40±4秒显著延
续到第28天（图7A）。缺血后第28天的神经功能评
射小鼠的评分为1.5±0.4，尽管高
的3.5±0.5与
长，且一直持
分（N.S）的结果显示，TAT-p53DM注
于Sham组的0.1，但显著低于TAT-s-p53DM注射组小鼠
Vehicle注射组小鼠的3.5±0.7（图7B），证明TAT-p53DM具有显著的改善
神经系统症状的效果。缺血后第7天的水迷宫行为学检测结果表明，TAT-
p53DM注射小鼠 在第6天找到平台的潜伏期为16±5秒，较TAT-s-
±5秒显著减少，且接近于Sham组
probe测试中在目标
e组的
p53DM的26±4秒或Vehicle组的25
15±4秒（图8A）；TAT-p53DM注射小鼠在第7天的
象限停留的时间为42±3秒，较TAT-s-p53DM的18±3秒或Vehicl
20±2秒显著延长，且接近于Sham组水平的51±5秒（图8C）。图8B显示水迷宫
训练第6天，TAT-p53DM注射小鼠的游泳距离为287±12厘米，接近于
16厘米，但显著低于注射TAT-s-p53DM的游泳距离
离378±36厘米。上述结果表明：TAT-
记忆能力。
Sham组的293±
356±21厘米和Vehicle组的游泳距
p53DM注射后，显著改善缺血性卒中小鼠的学习与
上述组织学与行为学的实验研究统计结果一致表明，在缺血性卒中动物模型，小分
子多 肽TAT-p53DM静脉注射，具有确切的缓解缺血后神经系统症状，降
缺血后神经细胞死亡以及改善缺血后运动与学习
治疗药物的靶点。
低缺血梗死体积，减少
记忆功能的作用，是潜在的开发缺血性卒中
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉启瑞科技发展有限公司
华中科技大学
<120> 小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应
用
<130> 小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应
用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Val Cys Ala Cys
1 5 10 15
Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr
20
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tatggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc cgccgcgtgt gcgcgtgccc gggccgcgat 60
cgccgcacc 69
2024年8月31日发(作者：仪寄波)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.8
(22)申请日 2014.04.10
(71)申请人 武汉启瑞科技发展有限公司;华中科技大学
地址 430000 湖北省武汉市东湖高新技术开发区庙山小区
(72)发明人 鲁友明 裴磊 朱铃强 徐传瑞
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所
代理人 王敏锋
(51)
C07K14/00
A61K38/16
A61P9/10
A61P25/00
(10)申请公布号 CN 103936838 A
(43)申请公布日 2014.07.23
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
小分子多肽TAT-p53DM及其在制
备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用
(57)摘要
本发明公开了小分子多肽TAT-
p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中
药物中的应用，利用人工合成TAT蛋白转
导结构域和p53DM的融合蛋白多肽TAT-
p53DM，TAT可以携带p53DM蛋白多肽
经血液穿过血脑屏障被神经元摄取，将其
运用到离体和在体的缺血性卒中模型上，
可有效发挥其阻断神经元死亡相关蛋白激
酶1死亡结构域（DAPK1DD）与肿瘤抑制
蛋白p53DNA结合基序（p53DM）结合的
生物学作用，抑制DAPK1下游引起神经
元凋亡与坏死的信号，降低缺血性卒中后
脑损伤，为进一步开发临床治疗缺血性卒
中的药物提供了分子靶点。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种人工合成的小分子多肽，其序列为SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述小分子多肽的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1或权利要求2所述的序列在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：权利要求1或权利要求2所述的序列
在制备治疗或预防缺血性卒中小鼠药物中的应用。
6.权利要求1或权利要求2所述的序列在制备降低缺血后神经元坏死药物中的应用。
7.权利要求1或权利要求2所述的序列在制备降低缺血后神经元凋亡药物中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及医学疾病治疗药物研发领域，具体涉及一种小分子多肽TAT-p53DM，
还涉
用。
技术背景
脑卒中以高发病率、高死亡率、高致残率等特点，被公认为目前严重危害人类健康
和生 命安全的常见难治性疾病，缺血性脑卒中是由于脑血流中断（缺血）
的一类严重神经疾病，患者会突然出现瘫痪，语
通常每40秒就有一例脑卒
的死亡
及小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应
引起的血栓形成或栓塞
言功能损伤或视力丧失甚至死亡。在美国，
中发生，每4分钟就有一例死亡，据2007年的数据统计，脑卒中
率高达41.6%。伴随着人口老龄化，这个绝对数量还在逐渐上升。在幸存者当中，
7 0%的人工作能力受到损害，30%生活不能自理。因此，给家庭和社
和精神负担。在美国，2010年脑卒中的估计花
2万亿美元。在俄罗斯和中
害所采
会都造成了严重的经济
费在73.7亿美元，而到2050年，会达到1.5
国，每十万人口死亡率比美国高5-10倍。然而，针对脑缺血损
取的治疗手段非常有限，目前唯一有效的治疗是运用组织纤溶酶原激活物(tPA)的
溶 栓疗法。出于安全考虑和溶栓治疗的时间窗较窄（<4.5小时），
治疗。迄今为止，实验室针对脑缺血治疗
约200项临床试验，
多数患者只能得到对症支持
所开发的小分子化合物已超过1000种，并开展了
但所有这些方法运用到临床都面临失败，因此，针对缺血性卒中脑损伤，
在局部缺血的情况下，缺氧缺糖会耗尽细胞能量，从而导致广泛的有害细胞反应。
这些 反应包括离子稳态的失衡，活性氧（ROS）和活性氮(RNS)的产生，
探讨新的治疗方法对抗脑损伤减少神经细胞死亡极其重要。
以及线粒体功能障碍。 结果，细胞通过坏死和凋亡两种途径走向死亡。
已知坏死和凋亡是通过多种信号通路如Ca2+超载和
ROS/RNS产生所激活，并和谷氨酸递质（NMDA）受体的过度兴奋有关。然而，
谷氨酸受体也参与正常基因表达，神经可塑性和神经元存活等重要生理功能，
谷氨酸受体并不是治疗缺血性卒中的理想靶点。 因此直接拮抗
TAT称细胞穿膜肽(cell penetrating peptides)，是近年来发现的一种新型的高效运输
载 体。TAT能穿透细胞膜、细胞核膜，携带肽、蛋白质和DNA分子等
和胞核发挥生物效应。为提高靶细胞在体内外的
简便的方法。目前的体内及
织细胞，
通过受体转运进入胞质
基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、
体外试验显示HIV-TAT，可以穿过包括神经元细胞在内的所有组
且未观察到明显的毒副作用。TAT可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟
内 转导进入细胞，而且在体内可以通过血液
质细胞内，被带入细循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶
胞的多肽或蛋白质则保留了它们各自原有的生物活性，从而发挥其生物
基于申请人最近的研究与TAT技术，申请人合成了一个由p53DM的氨基酸271-
282序列 （270RVCACPGRDRRT281）组成的膜渗透性小分子多肽
体的缺血性卒中模型上，有效发挥
制DAPK1下
学作用。
TAT-p53DM，通过运用到离体和在
其阻断神经元DAPK1DD与p53DM结合的生物学作用，抑
游引起神经元凋亡与坏死的信号，降低缺血性卒中后脑损伤，为进一步开发临
发明内容
本发明目的在于提供了一种小分子多肽TAT-p53DM，其序列为SEQ ID NO.1所示。
床治疗缺血性卒中的药物提供了分子靶点。
本 发明将TAT穿膜肽(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-
3蛋白的DNA结合基序（p53DM）的一
s-Pro-Gly-Arg-Asp-
Arg,YGRKKRRQRRR)与p5
段氨基酸序列（氨基酸270-281，Arg-Val-Cys-Ala-Cy
Arg-Arg-Thr,RVCACPGRDRRT）连接，得到具有生物活性的TAT-p53D
M小分子多肽，利用TAT的穿膜功能将p53DM多肽输送进入血液穿过血
经细胞摄取从而发挥其生物学功能。 脑屏障，并被大脑神
本发明的目的还在于提供了小分子多肽TAT-p53DM对应的核苷酸序列，具体为
SEQ ID NO.2所示（tatggccgcaaaaaacgccgccagcgccgccgc-
但不局限于该序列，所有编
cgcgtgtgcgcgtgcccgggccgcgatcgccgcacc），
码TAT-p53DM多肽的核苷酸序列都为本发明的保护范围。
本发明的另一个目的在于提供了一种小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺
血 性卒中药物中的应用，将其与神经元细胞共同孵育或是静脉注射，发
卒中后神经元死亡(坏死与凋亡)，并明显改善缺
现其可有效降低缺血性
血后神经系统症状与行为学的效应。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明的思路如下：
申请人发现，缺血性卒中后，死亡相关蛋白激酶1
（Death Associated Protein Kinase1,
DAPK1）的死亡功能域
（Death Domain,DD）和肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合基序（D
NA binding Motif,DM）相互作用，并介导下游神经元坏死与凋亡。阻断
3DM的相互作用，能有效降低缺血性卒中后神经元死
人将TAT穿膜肽(Tyr-Gly-Arg-
蛋白DNA结
DAPK1DD与p5
亡(坏死与凋亡)。针对这一发现，申请
Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg,YGRKKRRQRRR)与p53
合基序（p53DM）的一段氨基酸序列（氨基酸270-281，Arg-Val-Cys-Ala-Cys-
Pro-Gly-Arg-Asp-Arg-Arg-Thr,RVCACPGRDRRT）
多肽，通过对离体培养的神经元进
在体静脉注射
连接，获得具有生物活性的TAT-p53DM
行孵育，TAT-p53DM多肽直接被神经元摄取；也可通过
方式，使TAT-p53DM多肽进入血液穿过血脑屏障并被大脑神经细胞摄取发挥
一种小分子多肽TAT-p53DM，其序列如下：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Gly-Arg-
Asp-A
TAT-p53DM的对照为TAT-scramble-p53DM（TAT-s-p53DM），其序列为：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Pro-Gly-Glu-Cys-Val-Arg-
Thr-Ar
TAT-p53DM多肽及其对照TAT-s-p53DM为商业化公司合成。
小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应用，其应用过程如
下：
（1）TAT-p53DM在缺血性卒中细胞模型的应用
氧糖剥夺（Oxygen Glucose Deprivation,OGD）被广泛认为是缺血性中风的体外细
胞 模型。我们对体外培养10天的原代神经细胞进行OGD处理60分钟
OGD处理的情况下，PI标记出46%细胞坏死，
经过90分钟OGD处理后，
g-Arg-Arg(YGRKKRRQRRR-CCPGECVRTRRR)。
rg-Arg-Thr（YGRKKRRQRRR-RVCACPGRDRRT）。
其生物学功能。
和90分钟，在60分钟
TUNEL标记出21%的细胞凋亡。当培养物
PI标记出89%细胞，18%细胞对TUNEL出现阳性反应，可见 大部分细胞在
OGD处理下死亡。用5μM的TAT-p53DM对培养的原代神经元进行孵育处
理，OGD处理后的原代培养神经元，被PI和TUNEL标记的细胞数目显著
-p53DM处理可以在细胞水平降低缺血后神经元死亡。 减少，说明TAT
（2）TAT-p53DM在缺血性卒中动物模型的应用
大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）是公认的脑缺血动物模
型，通过向小鼠颈动脉中插入线拴堵塞大脑中动脉能引起大脑中动脉支配的
拔出线拴，则引起血流再灌注，从而引起缺血再灌注损
状。通过TTC染色反映缺血梗死
实验Rotarod
皮层纹状体缺血，
伤，以模拟临床脑梗塞或脑栓塞的症
体积，TUNEL及FJ染色反映缺血后神经元的死亡，转棒
反映动物协调平衡能力，神经系统功能评分（Neurological Score,N.S.）反映
缺血后神经系统症状，水迷宫实验反映动物运动与学习记忆能力。对动物缺
小时和6小时的小鼠股静脉注射1mg/ml的TAT-p53DM溶液，
取出脑组织，TTC染色显示给予TAT-
p53DM或生理盐水
血再灌注后3
动物缺血再灌注第7天处死，
p53DM的小鼠脑缺血梗死体积显著低于对照组TAT-s-
Vehicle组。TUNEL及FJ染色显示，给予TAT-p53DM的小鼠缺血后神
经细胞死亡数量显著低于对照组TAT-s-p53DM或生理
注射的小鼠转棒行为学与水迷宫行
进一步证明，
盐水Vehicle组。此外，TAT-p53DM
为学结果均较TAT-s-p53DM或Vehicle组得到显著改善。
TAT-p53DM对缺血性卒中模型具有确切的治疗作用。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
（1）本发明所涉及的小分子多肽TAT-p53DM合成纯度高，完全可溶，适合静脉
注射， 无毒副作用，便于转化生产；
（2）本发明利用人工合成TAT蛋白转导结构域和p53DM的融合蛋白多肽，意在
采用静 脉注射的方式达到改善缺血性卒中后神经系统症状，减少缺血
的目的。本发明公开的人工合成的TAT-
肽经血液穿过血脑屏
性卒中神经细胞死亡和脑损伤
p53DM重组蛋白多肽，TAT可以携带p53DM蛋白多
障被神经元摄取，可以转化应用于神经系统疾病如缺血性卒中，使其具
附图说明
图1为一种小分子多肽TAT-p53DM的人工合成色谱图。
图2为TAT-p53DM阻断神经元DAPK1DD与p53DM结合的结果示意图。
图3为离体细胞水平TAT-p53DM对缺血性卒中治疗作用的流程图。
图4为TAT-p53DM减少OGD处理后神经元坏死及凋亡的结果统计图。
图5为在体动物水平TAT-p53DM对缺血性卒中治疗作用的实施方案图。
图6为TAT-p53DM减少缺血性卒中后缺血梗死体积与神经元死亡的结果统计图。
图7为TAT-p53DM改善缺血性卒中后运动功能及神经系统症状的结果统计图。
图8为TAT-p53DM改善缺血性卒中后学习与记忆功能的结果统计图。
具体实施方式
有实际操作的可行性。
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有细胞培
养， 凋亡与坏死染色，缺血动物模型，静脉注射以及组织学与行为学的所
术人员所熟知。本发明中未详细阐述的请参见文有操作方法为本领域技
献（①Tu W,Xu X,Peng L,Zhong X,Zh
he
n Y,Lu Y(2010)DAPK1interaction with NMDA receptor NR2B subunits mediate
damage in 140:222-234；s brain
ang W,Soundarapandian MM,Balel C,Wang M,Jia N,Zhang W,Lew F,Chan SL,C
②Yang Y,Shu X,Liu D,Shang Y,Wu Y,Pei L,X
u X,Tian Q,Zhang J,Qian K,Wang YX,Petralia RS,Tu W,Zhu LQ,Wang JZ,Lu Y
on of miR-124and 73:774-788.）的材料
(2012)EPAC null muTATion impairs learning and social interactions via aberrant
regulati
与方法部分说明。
实施例1：
TAT-p53DM的人工合成
TAT-p53DM的序列为SEQ ID NO.1所示，由武汉百意欣生物技术有限公司人工合
成，合成
TAT-p53DM人工合成HPLC报告
表1
报告如下所示，色谱如图1所示。
合成后TAT-p53DM多肽纯度为99%，每只5mg，为白色粉末状，避光保存于-20
度，完全 可溶于水。使用前，用无菌生理盐水按指定浓度进行稀释配制。
于37度温箱预热。 用于细胞或用于动物前，置
TAT-p53DM的对照为TAT-scramble-p53DM（TAT-s-p53DM），其序列为：Tyr-
Gly-Ar g-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Pro-Gly-Glu-Cys-
RKKRRQRRR-CCPGECVRTRRR)，也为Val-Arg-Thr-Arg-Arg-Arg(YG
该公司合成。
实施例2：
TAT-p53DM阻断神经元DAPK1DD与p53DM的结合的生物学作用，抑制DAPK1
下游引
分别用慢病毒包装Flag标记的DAPK1DD质粒（Flag-DAPK1DD）和GST标记的
p53DM 质粒（GST-p53DM）后，共转染体外培养第10天的原代神经
13天），给
起神经元凋亡与坏死的信号
元，转然后第3天（原代培养第
予浓度为5μM的TAT-p53DM合成肽或对照TAT-s-p53DM或Vehicle孵育，2小
时后 提取细胞蛋白。先用抗Flag的抗体沉淀细胞蛋白，再用抗GST的抗
检测到NC膜上黑色印迹表明DAPK1DD
抗GST的抗
体去检测沉淀下来的蛋白，
与p53DM相互作用。结果显示：给予TAT-p53DM后，
体无法检测到NC膜上的GST-p53DM蛋白，提示DAPK1DD与p53DM的相互作
用 被TAT-p53DM所阻断，而在给予TAT-s-p53DM的对照组NC膜上，
则说明DAPK1DD与p53DM的相互作用
我们对感染了
有明显检测到的黑色印迹，
不能被对照多肽TAT-s-p53DM所阻断（图2A）。同时
含有Flag-DAPK1DD与GST-p53DM病毒的神经元进行了MTT检测，该检测能
反映神经元生存活力（Viability）。给予5μM的TAT-p53DM合成肽或对照
hicle孵育，结果显示，与TAT-s-p53DM（9%±4%）或
DM能显著增加神经细胞的活力
K1DD与
TAT-s-p53DM或Ve
Vehicle（6%±2%）比较，TAT-p53
（58%±7%）(图2B)，说明TAT-p53DM阻断了神经元DAP
p53DM结合的生物学作用，抑制DAPK1下游引起神经元凋亡与坏死的信号。
实施例3：
TAT-p53DM在缺血性卒中细胞模型中的应用
（1）原代神经元培养与缺血性卒中OGD细胞模型的构建
从母鼠子宫取出胚胎期第20天的小鼠，迅速浸入75%乙醇，断头后，于解剖液
（D-Han k’s Solution）中取出大脑皮层组织，用木瓜消化酶试剂盒
ngton Biochemical Corporation）消化分离
赖氨酸和层粘连蛋白
（papain dissociation kit,Worthi
皮层细胞，细胞种植于包被有30微克/毫升的多聚
的19平方毫米盖玻片，细胞种植密度约为100–150个细胞/平方毫米，
盖玻片置于含新鲜无血清Neurobasal培养基(21103,GIBCO)与2%B27的12
天更换新鲜相同培养基。通过对培养的神经元进行神经
细胞染色证明所培养细胞85%以上为神
孔板中，每隔4
元标记物β-tubulin III(Tuj1)的免疫
经元。
为模拟缺血性卒中的细胞模型，12孔板中的神经元在培养第10天
（Days in vitro10,D IV10）给予氧糖剥夺（OGD）处理，即将培养神经元
的12孔板放入含5%CO2，10%H2和85%
N2的厌氧培养箱中。用500μl的去氧无糖碳酸氢盐溶液置换此
然后将细胞置于37℃厌氧培养箱分别维前的培养液，并润洗三次，
持60分钟和90分钟。随后，再用含氧含糖(葡萄糖，2
换去氧无糖培养液，并在37℃含
0mM)的碳酸氢盐置
5%CO2/10%H2/85%O2的潮湿培养箱
中维持培养72小时。至此，缺血性卒中的细胞模型建立完成，随即可对培
AT-p53DM治疗(图3)。 养的神经元进行T
（2）TAT-p53DM在缺血性卒中OGD细胞中的应用
为了明确TAT-p53DM的最佳应用浓度，上述原代培养的神经元在OGD处理后，
恢复到 常规培养箱和培养基条件2小时，
度TAT-12孔板每孔500μl的培养基给予10μl37度预热的不同浓
p53DM（1μM，3μM和5μM）进行孵育，观察其抑制DAPK1与p53相互作用的
效果。因为DAPK1与p53的相互作用是引起下游细胞死亡信号的触发因素。
1与p53相互作用的TAT-p53DM的最佳浓度被选择用
应用效果评价。
因此抑制DAPK
于后续OGD处理后细胞凋亡与坏死的
原代培养的神经元在OGD处理后，恢复到常规培养箱和培养基条件下培养2小时，
12孔 板每孔500μl的培养基给予37度预热的10μl上述最佳治疗浓度的
液孵育，继续在37℃含TAT-p53DM生理盐水溶
5%CO2/10%H2/85%O2的潮湿培养箱中继续维
持培养70小时后进行P
3)。
（3）TAT-p53DM应用效果评估
碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在坏
死 的细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此PI染色可大致反
步骤为：先用PBS稀释10μM PI溶液，将PI溶
I与TUNEL染色观察坏死与凋亡的细胞数量(图
映细胞的坏死程度。具体
液用微量加样枪按1/10体积加入细胞培养液中 （50μl/500μl）。随后在
API1μl37oC条件下孵育15分钟，用PBS润洗两次后，加入细胞核染液D
孵育10分钟后，直接在荧光显微镜下以535nm的激发光照射下观察拍照。红色标
记
细胞发生凋亡时，细胞内源性核酸内切酶激活导致核染色质DNA双链的断裂，大
量DN A片段暴露出的3’羟基末断在末断转移酶
聚酶的作用下，与
细胞为阳性坏死细胞。
(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)和DNA多
FITC荧光素标记的核苷酸结合，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。
因此用凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL）所标记的细胞多少反
具体步骤为：贴壁细胞先用PBS润洗，随后用含
上孵育细胞2分钟，新鲜配
孔加入
映细胞凋亡程度。
0.1%Trition-X-100的0.1%柠檬酸钠溶液在冰
制TUNEL反应液（酶溶液/标记溶液，1:9混合）后，按12孔板每
50μl反应液于贴壁细胞中，37℃条件下孵育1小时，最后直接在荧光显微镜下以
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TAT-p53DM的最佳应用浓度：通过提取不同浓度TAT-p53DM孵育的细胞蛋白，
进行免 疫共沉淀实验，先用抗DAPK1的抗体去沉淀细胞蛋白，再用
的蛋白进行免疫印迹染色，通过化学发光
1所沉淀的p53蛋白，
nm激发光照射下观察拍照。绿色标记细胞为阳性凋亡细胞。
抗p53的抗体对沉淀在NC膜上
对免疫印迹膜进行曝光成像，黑色条带显示DAPK
提示DAPK1与p53的相互作用。当给予5μM TAT-p53DM时，NC膜上
的黑色条带消失，说明该浓度完全抑制DAPK1与p53的相互作用，也说明
M是最佳的治疗给药浓度（图4A）。 5μM TAT-p53D
接下来，我们对体外培养10天的原代神经细胞进行OGD处理60分钟和90分钟，
在60分 钟OGD处理的情况下，PI标记出46%细胞坏死，TUNEL标
经过90分钟OGD处理后，18%细胞对
分细胞在OGD处理
记出21%的细胞凋亡。当培养物
TUNEL出现阳性反应，PI标记出89%细胞，可见大部
下死亡。用5μM的TAT-p53DM对培养的原代神经元进行孵育处理，OG
D处理90分钟后的原代培养神经元，被PI和TUNEL标记的细胞数目显著
凋亡和坏死率分别是3%和12%，说明TAT-
亡，表明TAT-
减少(图4B)，其细胞
p53DM处理可以在细胞水平降低缺血后神经元死
p53DM具有治疗缺血性卒中的作用。
实施例4：
TAT-p53DM在缺血性卒中小鼠模型中的应用
（1）缺血性卒中小鼠模型的建立
运用大脑中动脉栓塞MCAO小鼠模型模拟缺血性脑卒中，具体方法为：术前麻醉
小鼠， 颈部做1-2cm长正中切口后，分离右侧颈总动脉，暴露颈外
向颈内插入直径约0.1mm尖端包被
CA,USA)，插入深度
与颈内动脉分叉，从颈外动脉
0.2mm直径硅胶的尼龙线栓(Doccol Co.,Redlands,
约0.8-1.0cm，至大脑中动脉前段起始部。1小时后，小心移除线栓，
恢复颈总动脉灌注，缝合伤口。假手术组动物(Sham)除了不插入线栓外，其
AO模型动物相同。整个手术过程中，尽量减少污染，
Apparatus,Holliston,MA,USA)维持
余步骤均与MC
施行无菌操作，并用加热毯(Harvard
动物体温于37℃±0.5℃。
（2）TAT-p53DM静脉注射
在小鼠脑缺血再灌注后3小时以及6小时，用注射器经股静脉缓慢单次注射
1mg/kg TAT-p53DM(TAT-RVCACPGRDRRT)或对照TAT-s-
菌生理盐水(Vehicle)。多肽浓度为
在缺血再灌注
p53DM(TAT-CCPGECVRTRRR)或无
1mg/ml,用无菌生理盐水溶解。TAT-p53DM静脉注射后，
7天后的小鼠脑组织切片进行TTC染色观察梗死病灶，FJ染色观察细胞死亡
情况，第7天至第14天进行水迷宫行为检测，评估TAT-p53DM的治疗效
小鼠28天内指定时间点连续观测转棒行为，并在第28
一步明确TAT-p53DM对缺血性卒
果，缺血再灌注
天进行神经系统症状评分（N.S.）进
中的治疗作用(图5)。
（3）TAT-p53DM治疗效果评估
TTC染色检测缺血梗死体积：TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏
感复 合物，1894年首次合成用来检测种子的生存能力，1958年开始用来
缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统
呈红色，而缺血组织内脱氢
染色检测哺乳动物组织的
的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而
酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。具体操作步骤
如下：MCAO模型动物于缺血再灌注7天后麻醉处死，迅速
分钟，新鲜配置2%TTC PBS溶液，避光
后作连续冠状切片，
取出完整脑组织，-20℃速冻20
于37℃保存备用。-20℃取出脑组织后，迅速从前向
切片厚度约1毫米。然后将切片置于2%TTC PBS溶液中，37℃避光孵
育30分钟。染色结果可见，正常脑组织区域为红色，而缺血区不被着色。
4%多聚甲醛PBS溶液中固定，最后对固定的脑切片缺
后各0.3厘米区域的连续6张切片，
染色后，切片置于
血面积进行统计分析。选取前囟点前
运用图像分析软件(Image J1.37v,Wayne Rasband,avail
able through National Institutes of Health)计算分析缺血体积
（Infarction,mm3）。
Fluoro-Jade C（FJ-C）与TUNEL染色：缺血再灌注第7天，麻醉小鼠后经心脏主
动脉灌 流，分别用0.9%生理盐水和冰冷的4%多聚甲醛PBS溶液灌
在相同多聚甲醛液中后固定6-8小时后，
片厚30μm，切片保
流固定脑组织。取出脑组织后，
置于30%蔗糖溶液，脑组织沉底后进行冰冻切片，
存于PBS溶液中，进行随后的FJ-C与TUNEL染色。①FJ-C染色：切片贴
于明胶载玻片后晾干，先置于100%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟以及双蒸
含0.01%Fluoro-Jade(Millipore)和0.1%醋酸(1:10)的混合
用水进行润洗，二甲苯快速透明后
察绿色标记的
水中1分钟，随后在
液中避光室温下孵育30分钟。随后
用DPX封片剂（Sigma）封片，显微镜用488nm激发光观
阳性细胞，即为变性死亡的细胞。②TUNEL染色原理如上述，具体操作方法
如下：冰冻切片贴于明胶载玻片后晾干，先用PBS润洗，随后用含
的柠檬酸钠溶液在冰上孵育细胞2分钟，新鲜配
合）后，按每张脑切片加入
镜下以
0.1%Trition-X-100的0.1%
制TUNEL反应液（酶溶液/标记溶液，1:9混
50μl反应液在37℃条件下避光孵育1小时，最后直接在荧光显微
532nm激发光照射下观察拍照。红色标记细胞核为阳性凋亡细胞。
分别运用Longa行为障碍评分和转棒仪实验对MCAO模型小鼠运动功能进行检测。
具体 为：①Longa行为障碍评分：0分，无神经功能缺失症状；1分，不
分，爬行时出现对侧转圈；3分，行走时身体向
得分越高表明动物行为障碍
4天，
能完全伸展对侧前爪；2
对侧倾倒；4分，不能自行行走，意识丧失。
越严重。②转棒仪试验：MCAO手术前(第0天),手术后第7天,1
21天和28天运用大鼠转棒仪(Ugo Basile,Italy)测试手术前后动物的运动功能。转棒
仪 工作模式如下：在4转/分(rpm)的匀速模式下，从放置动物到动物落
为滞留时间，反映动物的四肢肌力及运动协调能
记录并计算平均滞留时间以
天。滞
下的时间被记录下来作
力。实验前，动物训练两天，每天训练3次，
获得稳定的基础值。转棒仪正式实验每天进行3次，间隔检测28
留时间RT值越低，表明动物运动功能越差。
Morris水迷宫实验是1981年由Morris建立，通过让实验动物游泳并学习寻找隐藏
在水中 平台的方法来测试实验动物对空间位置觉和空间定位的学习记
间记忆实验：忆能力。具体操作如下：①空
实验历时6天。实验开始前半小时将小鼠置于水迷宫房间适应环境，每天每只
小鼠训练4次。实验者将小鼠以手托起令其面向池壁，轻轻放入水中。小鼠
到平台，则记录其搜寻并登上平台所需要的时间，即潜
未能找到平台，潜伏期记为60秒，
的参照物来进
在60秒内能寻找
伏期（Latency）。若小鼠在60秒内
并由实验者引导至平台上停留30秒，以让其根据4个象限
行空间学习和记忆。每只小鼠总计训练24次，计算每天各组小鼠潜伏期，游泳
距离(Length)。②空间探索实验用于测量动物对平台空间位置的记忆能力。
随机选择入水点，将小鼠按上述方法置于水中，游泳
adrant）的滞留时间(Time)反映动
在第7天撤除平台，
60秒，测量小鼠在目标象限（target qu
物的空间位置记忆能力。
对动物缺血再灌注后3小时，6小时的小鼠股静脉注射1mg/ml TAT-p53DM溶液，
动 物缺血再灌注第7天处死，取出脑组织，TTC染色显示小鼠脑缺血
m3），给予TAT-p53DM后脑缺血梗死体积（infarction,m
梗死体积为12.3±2.4mm3，虽然高于Sham组的1.6±0.
3mm3，但显著低于对照组TAT-s-p53DM的
16.5±2.1mm3或生理盐水Vehicle组的17.2
±2.3mm3(图6A)。FJ-C与TUNEL染色显示，给予TAT-p53DM
亡数量分别为：28±2和7±1个，显著低于对照
2个或生理盐水vehicle组136±21
1个)（图6B）。此外，小
停留在
的小鼠神经细胞坏死与凋
组TAT-s-p53DM的133±24和32±1
和48±12个，且接近于Sham组水平(15±2和5±
鼠转棒行为学结果显示，缺血后第7天，TAT-p53DM注射的小鼠
转轮上的时间（Stay on rotarod）为64±4秒，虽然低于Sham组102±15秒，但
较TAT-s-p53DM注射小鼠的38±3秒与Vehicle注射小鼠的40±4秒显著延
续到第28天（图7A）。缺血后第28天的神经功能评
射小鼠的评分为1.5±0.4，尽管高
的3.5±0.5与
长，且一直持
分（N.S）的结果显示，TAT-p53DM注
于Sham组的0.1，但显著低于TAT-s-p53DM注射组小鼠
Vehicle注射组小鼠的3.5±0.7（图7B），证明TAT-p53DM具有显著的改善
神经系统症状的效果。缺血后第7天的水迷宫行为学检测结果表明，TAT-
p53DM注射小鼠 在第6天找到平台的潜伏期为16±5秒，较TAT-s-
±5秒显著减少，且接近于Sham组
probe测试中在目标
e组的
p53DM的26±4秒或Vehicle组的25
15±4秒（图8A）；TAT-p53DM注射小鼠在第7天的
象限停留的时间为42±3秒，较TAT-s-p53DM的18±3秒或Vehicl
20±2秒显著延长，且接近于Sham组水平的51±5秒（图8C）。图8B显示水迷宫
训练第6天，TAT-p53DM注射小鼠的游泳距离为287±12厘米，接近于
16厘米，但显著低于注射TAT-s-p53DM的游泳距离
离378±36厘米。上述结果表明：TAT-
记忆能力。
Sham组的293±
356±21厘米和Vehicle组的游泳距
p53DM注射后，显著改善缺血性卒中小鼠的学习与
上述组织学与行为学的实验研究统计结果一致表明，在缺血性卒中动物模型，小分
子多 肽TAT-p53DM静脉注射，具有确切的缓解缺血后神经系统症状，降
缺血后神经细胞死亡以及改善缺血后运动与学习
治疗药物的靶点。
低缺血梗死体积，减少
记忆功能的作用，是潜在的开发缺血性卒中
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉启瑞科技发展有限公司
华中科技大学
<120> 小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应
用
<130> 小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应
用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Val Cys Ala Cys
1 5 10 15
Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr
20
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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