2024年8月31日发(作者：花如曼)
１５２
．
《中国神经肿瘤杂志》２０１１，９（３）：１５２—１５９
论著．
抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺
敏感性及其相关机制
王 翔 ，陈锦秀 ，毛 庆 ，刘艳辉 ，游 潮
（１．四川大学华西医院神经外科，四川成都 ６１００４１；２．四川省肿瘤医院，四川成都 ６１００４１）
【摘要】背景与目的：胶质瘤化疗耐药是胶质瘤治疗效果差的一个瓶颈。导致化疗耐药的分子机制目前尚
未完全清楚 突变ＴＰ５３的“获得功能”被认为是决定肿瘤发生及发展中的重要因素 本研究目的在于探讨突变
ＴＰ５３“获得功能”在多形性胶质母细胞瘤化疗耐药中的作用及其相关机制 方法：对人脑胶质瘤母细胞株Ｔ９８Ｇ
细胞进行ｍＲＮＡ测序．确定其ＴＰ５３基因是否突变及突变位点 采用脂质体法包裹化学合成的突变ＴＰ５３干扰小
ＲＮＡ片段ｆｓｉＲＮＡ１转染Ｔ９８Ｇ细胞 运用ＲＴ—ＰＣＲ方法在转染后的第１天至第５天检测肿瘤中突变ＴＰ５３在
ｍＲＮＡ水平的表达．及相应时点６一氧甲基鸟嘌呤一ＤＮＡ甲基转移酶（ＭＧＭＴ）ｍＲＮＡ的表达 将转染ｓｉＲＮＡ的
Ｔ９８Ｇ细胞接种于９６孑Ｌ板中．加入梯度浓度（１０～１０００ｔｘｍｏｌ／Ｌ）的替莫唑胺 模拟人体用药，替莫唑胺组在头５天
内每天更换培养基．加入替莫唑胺：对照组加入司莫司汀 用ＭＴＴ法观察各组在突变ＴＰ５３沉默前后的化疗敏感
性变化 结果：Ｔ９８Ｇ细胞的２３７号密码子发生突变，且高表达突变ＴＰ５３及ＭＧＭＴ ｍＲＮＡ。设计的ｓｉＲＮＡ可以
有效地沉默Ｔ９８Ｇ细胞株内突变ＴＰ５３基因．使其在ｍＲＮＡ水平不表达或者低表达．沉默作用时间可达５天 沉
默突变ＴＰ５３基因后．Ｔ９８Ｇ细胞株对替莫唑胺的敏感性增加４倍．对司莫司汀的敏感性无明显改变．．沉默突变
ＴＰ５３基因后，可使ＭＧＭＴ的表达降低，两者呈正相关。结论：突变型ＴＰ５３能增强胶质母细胞瘤细胞对替莫哗
胺化疗的耐药性．其耐药机制可能是通过上调ＭＧＭＴ的表达实现的
关键词：胶质母细胞瘤；突变；６ 氧甲基鸟嘌呤一ＤＮＡ甲基转移酶；肿瘤抑癌基因ＴＰ５３；ＲＮＡ干扰
中图分类号：Ｒ７３９．４１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１７２６—８１９２（２０１１）Ｏ３—０ｌ５２—０８
Ｄｏｗｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ
Ｘｉａｎｇ Ｗａｎｇ ，Ｊｉｎ—ｘｉｕ Ｃｈｅｎ ，Ｑｉｎｇ Ｍａｏ ，Ｙａｎ—ｈｕｉ Ｌｉｕ ，Ｃｈａｏ Ｙｏｕ
．
Ｄｅｐ￣ｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ
６１００４１，Ｐ Ｒ．Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＲａｄｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，
Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１．Ｐ Ｒ．Ｃｈｉｎａ
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ＆ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｂｓｔａｃｌｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ
ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｎｏｔ ｆｕｌｌｙ ｕｎｄｅｒｓｔｏｏｄ．Ｔｈｅ“ｇａｉｎ ｏｆ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ”ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｅｄ
ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ．
ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｉｎ Ｔ９８Ｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ａ ｈｕｍａｎ
ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｔ ｃｏｄｏｎ
２３７ ｏｆ ｇｅｎｅ ＴＰ５３，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ＤＮＡ
收稿日期：２０１１－０９—１０
通讯作者：王翔
修回日期：２０１１－０９—２７
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３
ｍＲＮＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ “ｓｉｌｅｎｃｅｄ”ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｔｏ：Ｘｉａｎｇ Ｗａｎｇ
Ｔｅｌ：８６．．２８．．８５４２２４８７
Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇ
ｘｉａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—
ＰＣＲ１ ｉｎ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ５ ｄａｙｓ．Ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌ１
王翔．等．抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺敏感性及其相关机制 １５３
ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｆ１０ １０００ｌｘｍｏｌ／Ｌ）．Ｔｈｅ
ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｒｅｍｏｖｅｄ ａｎｄ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｅｖｅｒｙ ｄａｙ ａｔ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ５ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ０６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ
ＤＮＡ—ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆＭＧＭＴ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ａｓ ｗｅｌ１．
ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｂｏｔｈ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ａｎｄ ＭＧＭＴ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔ９８Ｇ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ
ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｄａｙ ｔｏ ｆｉｆｔｈ ｄａｙ ｗａｓ ８３％，９５％，９３％，７６％，ａｎｄ７２％
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｌｅｄ ｔｏ ａ ｆｉｖｅｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ９８Ｇ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｃｅｌｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ．ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＧＭＴ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
ＣｏＮＣＬＵＳ１０Ｎ：Ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ ｔｏ
ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｃｒｅａｓｅ ＭＧＭＴ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
ＫＥＹ ＷｏＲＤＳ：Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ；Ｍｕｔａｔｉｏｎ；０６＿ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ—ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；Ｔｕｍｏｒ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ５３
胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤．约占所有
赠。替莫唑胺原料２ｍｇ用５０ Ｌ二甲亚砜（ＤＭＳＯ）
溶解．然后在１０ｍＬ的ＤＭＥＭ培养基稀释（ＤＭＳＯ
浓度不超过０．５％）．配制成替莫唑胺浓度为
１０００Ｉｘｍｏｌ／Ｌ的母液 在此基础上进行稀释配成１０～
中枢神经系统肿瘤的４２％．其中３／４以上为高级别
胶质瘤 虽然以手术为主的综合治疗使胶质瘤的疗
效有了明显提高 特别是低级别的星形细胞瘤和少
突胶质细胞瘤患者可以达到３～５年的平均生存时
间．但高级别胶质瘤（间变性星形细胞瘤和胶质母
细胞瘤）患者的平均生存时间还只有１２ ｌ５个月
胶质母细胞瘤患者１年生存率约为３０％．五年生存
率还不足５％ 目前围际上对胶质母细胞瘤的治疗
是以术后替莫唑胺化疗为主辅以同步放疗的方式．
ｌＯ００ｔｘｍｏｌ／Ｌ不同浓度的实验用液 司莫司汀在四川
省肿瘤医院购得．在ＤＭＳＯ中溶解后可以最高配成
浓度为４００Ｉｘｇ／ｍＬ的母液．稀释成梯度浓度的实验
用液 Ｔ９８Ｇ细胞株由四川大学移植免疫实验室（卫
生部重点实验室）提供：大多数文献已证实Ｔ９８Ｇ
细胞是多种药物化疗耐药的细胞株 ，１１］ ＲＮＡ干
但２年的总体生存率也不过２６％ｌｌ＿２１ 化疗反应患者
个体差异较大．因此替莫唑胺化疗耐药成为胶质母
细胞瘤治疗疗效不佳的瓶颈
肿瘤抑癌基因ＴＰ５３（Ｔｕｍ０ｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ
ｐ５３．ＴＰ５３）在３０％～５０％的胶质母细胞瘤中均发生
突变＿３＿ 突变型ＴＰ５３基因不仅仅表现为原来抑癌功
能的丧失（即ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ） 还被证明具有了更多
原癌基因的功能（即ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ｌ ４】。正常细胞的
扰转染试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司
１．２ ＴＰ５３ ｍＲＮＡ测序
ＴＰ５３的ｍＲＮＡ全序列有２６３０个碱基．分布于
１１个区 选择其中突变热点的４—８区进行测序 测
序引物为５ 一ＣＡＧＴＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＧ一３ 和
５ 一１ＴＩ１Ｃ 丌Ｃ１］ ＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧ一３ ．测序范围包
含１６８０个碱基 选取不同样本反复测序３次 反应
试剂为ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｐ５３突变后易发生癌变．肿瘤细胞内的ＴＰ５３突变
后会使该肿瘤细胞的恶性程度增加．肿瘤细胞生长
及抗凋亡的能力增加 而且突变ＴＰ５３会提高卵巢
癌、肺癌、骨肉瘤、前列腺癌以及直肠癌的化疗耐药
性和放疗抵抗性 突变ＴＰ５３的表达与多药耐药
因子在这些肿瘤中的表达是成正相关的［９１ 突变
Ｋｉｔ．测序仪为ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３０ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ
１．３细胞培养与细胞转染
Ｔ９８Ｇ细胞１．５×１０ ／：ｆＬ．接种６孔板．在含５％
小牛血清的ＤＭＥＭ培养基，ＣＯ 培养箱（３７ 、０
１９％、ＣＯ ５％）中进行培养，培养２４ｈ使转染前细胞
汇合度达到５０％～６０％ 转染在无血清培养基中进
行．干扰片段ｓｉＲＮＡ寡核苷酸与转染试剂脂质体在
稀释后按一定比例混匀．室温放置３０ｍｉｎ形成
ＴＰ５３是否在胶质瘤中也具有增强化疗耐药性的作
用，目前还尚未见报道。本课题旨在通过脂质体转
染人胶质母细胞瘤细胞．ＲＮＡ干扰技术沉默突变
型ＴＰ５３的表达．研究突变型ＴＰ５３在胶质瘤化疗
ｓｉＲＮＡ与脂质体复合物．再加人含细胞的培养基
中。转染后的细胞在ＣＯ，培养箱中３７℃温育１２ｈ后
耐药方面的作用．并探讨其相关机制 更换培养基．继续培养１２～３６ｈ后．进行转染后的其
它检测步骤 最佳转染条件及ｓｉＲＮＡ与脂质体的最
佳比例由ＦＡＭ荧光标记ｓｉＲＮＡ寡核苷酸转染
Ｔ９８Ｇ细胞确定 突变ＴＰ５３干扰的ｓｉＲＮＡ寡核苷
酸序列为２１ｂＤ的小片段（正义链为５ 一
１材料与方法
１．１ 材料
替莫唑胺由中国天士力公司（Ｔａｓｌｙ．Ｃｈｉｎａ）￣
１５４ 王 翔．等．抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺敏感性及其相关机制
ＣＵＡＣＵＵＣＣＵＧＡＡＡＡＣＡＡＣＧｄＴｄＴ一３ ．反义链为
特异性ｓｉＲＮＡ寡核苷酸转染组），脂质体对照组（只
加人脂质体转染试剂）和空白对照组。转染后ＲＮＡ
干扰观察时间为５天。分组及样本编号见表１。
５ 一ＣＧＵＵＧＵＵＵＵＣＡＧＧＡＡ ＧＵＡ ＧｄＴｄＴ一３ ）。分别
设立实验组和对照组。对照组包括阴性对照组（非
表１ ｓｉＲＮＡ细胞干扰试验分组情况（样本编号）
１．４逆转录ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ１
应用Ｔｒｉｚｏｌ体系提取ＲＮＡ．ＲＴ—ＰＣＲ实验按常
规方法进行。ｃＤＮＡ在一２０ 保存备用 进行ＰＣＲ分
析的引物．突变型ＴＰ５３为５ 一ＡＣＡＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡ
ＡＡＣＣＡＣＣ一３ 和５ 一ＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＧ
曲线，并计算ＩＣ∞。
２ 结 果
２．１ Ｔ９８Ｇ细胞株ＴＰ５３的突变
有２个位点的密码子不同 第１个是第７２位
ＡＡ一３ ，扩增产物长度是３５０ｂｐ：ＭＧＭＴ为５ 一ＧＴＣ
ＧＴＦＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＧＴＴＡ一３ 和５ 一ＡＣＡＧＧＡｒｒｒＩ’
氨基酸密码子ＣＣＣ．而正常野生型ＴＰ５３是ＣＧＣ
第２个不同位点是第２３７位氨基酸密码子ＡＴＡ．而
正常野生型ＴＰ５３是ＡＴＧ 第１个位点属于正常的
单核苷酸多态性ｆｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．
ＧＣＣＴＣＴＣＡ ｒｒＧＣＴＣ一３ ．扩增产物长度是１４０ｂｐ；
内参对照物为ＧＡＰＤＨ 反应条件：９４℃预变性
５ｍｉｎ．然后进入ＰＣＲ循环（９４￣Ｃ变性２０ｓ．５８ｃｃ退火
ＳＮＰ）．不属于突变位点：第２个不同位点是一个错
义突变位点 故Ｔ９８Ｇ细胞株存在ＴＰ５３基因的单
位点变异，突变点在２３７号密码子，Ｇ突变成Ａ，直
接导致编码的甲硫氨酸突变成异亮氨酸ｆ图１１ 这
一
３０ｓ，７２℃延伸５０ｓ），共３５个循环。最后７２℃后保持
１０ｒａｉｎ．取出产物４ＣＣ保存 １．５％琼脂糖凝胶电泳分
析并照相 利用凝胶电泳成像分析系统对扩增带进
行强度分析．分别计算每条泳道的突变ＴＰ５３／
ＧＡＰＤＨ、ＭＧＭＴ／ＧＡＰＤＨ总强度比值．用来表示样
品中突变ＴＰ５３和ＭＧＭＴ ｍＲＮＡ水平
１．５细胞药敏实验
将对数生长期的１．０ Ｘ １０４细胞／－Ｒ接种９６孔
结果与ＩＡＲＣ ＴＰ５３ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｗｗｗ－ｐ５３．ｉｒａｅ．ｆｒ）吻
合。
２．２ Ｔ９８Ｇ细胞的替莫唑胺化疗敏感性、突变
ＴＰ５３和ＭＧＭＴ的表达
Ｔ９８Ｇ细胞对替莫唑胺化疗有明显的化疗耐受
性．本细胞实验中仅在最高浓度（１０００￣ｍｏｌ／Ｌ）的替
莫唑胺干预下该细胞有明显的减少ｆ图２Ａ１。该细胞
样品的ＲＴ—ＰＣＲ检测，可见在３５０ｂｐ和１４０ｂｐ的位
置分别 现强表达的条带．分别是突变ＴＰ５３和
板．其中部分细胞进行了细胞转染ＲＮＡ干扰．１天
后（细胞贴壁）分别加入不同浓度梯度（１０～
１０００１￣ｍ０１／Ｌ）的替莫唑胺和司莫司汀实验液．共设
立４个观察组（替莫唑胺干扰组、替莫唑胺未干扰
组、司莫司汀干扰组和司莫司汀未干扰组）和２个
对照组（脂质体组和空白组） 替莫唑胺组每天更换
培养基．每天加入替莫唑胺．连续５天，在第６天或
ＭＧＭＴ（图３Ａ） 因此．Ｔ９８Ｇ细胞高表达突变ＴＰ５３
和ＭＧＭＴ。
２．３ ｓｉＲＮＡ转染Ｔ９８Ｇ细胞后突变ＴＰ５３的沉默
情况
第７天进行细胞数测定 司莫司汀组仅加药１次．
以后视情况更换培养基．尽量减少更换培养基的次
荧光标记阴性对照ｓｉＲＮＡ寡核苷酸转染Ｔ９８Ｇ
细胞．荧光显微镜下观察转染情况．转染效率最好
（视野内出现荧光的细胞占所有细胞的８５％以上１
时的转染条件为：ｓｉＲＮＡ２．５ ｇ，脂质体７．５１ｘｇ（６孑Ｌ
板），在行转染后的１２～２４ｈ．细胞内就开始有荧光
出现（图４）
数．在第６天或第７天进行细胞数测定 观察期结
束时采用ＭＴＴ方法进行细胞数测定 每孔加入
ＭＴＴ２０ ＬＬＬ，３７℃继续培养２ｈ后每孔加入１５０１ｘＬ
ＤＭＳＯ溶解，震荡１５ｍｉｎ，选择５７０ｎｍ波长，在酶联
免疫检测仪上测定各孔光吸收值 以细胞存活率为
纵坐标．不同药物浓度为横坐标绘制细胞的生存率
１５８ 王翔．等．抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺敏感性及其相关机制
莫唑胺化疗是否耐药的主要因素 。野生型Ｐ５３与
ＭＧＭＴ在人胶质瘤标本中免疫组化检测的结果显
示两者有一定的联系．在体外的实验中也显示两者
之间有调节的作用．但就所参考的文献而言．两者
之间呈正相关或负相关均有报道Ｂ７－２０１ 这可能与对
ＴＰ５３的突变忽视有关．肿瘤标本在体外超过３０
ｍｉｎ ＴＰ５３就会发生突变 在细胞中进行ＴＰ５３基因
测序明确突变点以及进行实时的ＴＰ５３含量检测可
以更加真实地反映突变的情况
ＴＰ５３突变后．由于肿瘤细胞自身凋亡能力的
丧失而增加细胞的耐药性是毫无疑问的 而突变
ＴＰ５３的“获得功能”在胶质瘤耐药方面的体现．以
及突变ＴＰ５３与ＤＮＡ修复相关因子ＭＧＭＴ之间的
联系正是本次实验研究的重点 我们的研究结果显
示正常情况下替莫唑胺根本不能抑制该ＴＰ５３突变
胶质母细胞瘤细胞的生长．而沉默突变ＴＰ５３后该
胶质瘤细胞显示出良好的药物反应．提示突变
ＴＰ５３使细胞耐药 ＭＧＭＴ在此次干扰实验中与突
变ＴＰ５３同步变化．两者的表达成正相关．提示突变
ＴＰ５３增加细胞耐药性可能是通过上调细胞内
ＭＧＭＴ的含量，提高了ＤＮＡ自我修复能力实现的
这一过程是否与ＭＧＭＴ启动子甲基化有关．可以
通过后续的甲基化检测来实现。尽管突变ＴＰ５３参
与胶质瘤耐药的途径有多种．但就本研究结果看
来．突变ＴＰ５３调节ＭＧＭＴ的能力很强．干扰突变
ＴＰ５３使ＭＧＭＴ下调的程度大于突变ＴＰ５３自身下
调的程度 突变ＴＰ５３从ＤＮＡ修复的途径参与胶质
瘤耐药．可能是其主要部分。
替莫唑胺是一种新型的细胞毒性烷化剂．自
２００５年被美国ＦＤＡ批准开始用于新发和复发的高
级别胶质瘤治疗．在临床上已显示了较好的治疗效
果和极低的副反应，患者耐受力好。虽然司莫司汀
也是一种细胞毒性的烷化剂．但不同的是替莫唑胺
的活性代谢物为线状三嗪、单甲基三氮烯咪唑碳酰
胺（ＭＴＩＣ） ＭＴＩＣ的细胞毒主要为发生在鸟嘌呤的
０ 位的烷化作用 鸟嘌呤的Ｏ 位也是ＭＧＭＴ发生
修复作用的主要位点．这可以解释突变ＴＰ５３通过
与ＭＧＭＴ的关系来调节肿瘤细胞对替莫唑胺的耐
药性．而不能调节对司莫司汀的耐药性 细胞实验
中实行替莫唑胺５天内每天换液．是为了更好模拟
临床上替莫唑胺５天疗程的用法．而且在这５天内
保证了突变ＴＰ５３较好的“沉默” 虽然替莫唑胺临
床上的用法还在不断改进．包括长期小剂量的使
用．这就要求更长的ＲＮＡ干扰时间．脂质体转染就
不能满足这样的要求．构建质粒虽然较为复杂但可
以达到很长时间的干扰效果
充分认识胶质瘤ＴＰ５３突变的意义．以及突变
型ＴＰ５３作为一个独立因子所起的作用：充分认识
其“获得功能”，以及它对胶质瘤耐药带来的影响．
也许能够开辟新的思路和途径来克服胶质瘤化疗
耐药
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ｇａｉｎｓ ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００５，１ ｌ４（３）：３３１—３３６．
【７】 Ｚａｌｃｅｎｓｔｅｉｎ Ａ，ＳｔａｍｂｏｌｓｋｙＰ，Ｗｅｉｓｚ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｎｔ
ＴＰ５３ ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ一１）
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｕｍｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＴＰ５３ ｍｕｔａｎｔｓ［Ｊ］．
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３，２２（３６）：５６６７—５６７６．
【８】 Ｂｌａｎｄｉｎｏ Ｇ，Ｌｅｖｉｎｅ ＡＪ，Ｏｒｅｎ Ｍ．Ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｇａｉｎ ｏｆ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＴＰ５３ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｎ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１ ８（２）：４７７—４８５．
［９】 Ｓａｍｐａｔｈ Ｊ，Ｓｕｎ Ｄ，Ｋｉｄｄ ＶＪ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３
ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ＥＴＳ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ
ＭＤＲ１ ｎｏｔ ＭＲＰ１ ［Ｊ】．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１，２７６（４２）：
３９３５９—３９３６７．
［１０】Ｎａｔｓｕｍｅ Ａ，Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ Ｔ，Ｉｓｈｉｉ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ．ｂｅｔａ ａｎｄ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ
ｇｌｉｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＰ５３－ｍｅｄｉａｔｅｄ
ＭＧＭＴ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ 【Ｊ］． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
王
一 ＿
Ｕ
翔．等．抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺敏感性及其相关机制
＿ 一＿ 一
１５９
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，６ １（４）：６５３—６５９．
Ｈｅｒｍｉｓｓｏｎ Ｍ，Ｋｌｕｍｐｐ Ａ，Ｗｉｃｋ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｏ
ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ＴＰ５３ ｓｔａｔｕｓ
ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ
［１６］仇志坤，冯冰虹，陈忠平．ＭＧＭＴ在神经胶质瘤中表达
的研究进展ｌ Ｊ１．中国神经肿瘤杂志，２０１０，８（１）：４４—５０．
［１７］Ｏｓａｎａｉ Ｔ，Ｔａｋａｇｉ Ｙ，Ｔｏｒｉｙａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏ ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ—ＤＮＡ
ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ…．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００６，９６（３）：７６６—７７６．
Ｈａｌｅｖｙ Ｏ，Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｔｚ Ｄ，Ｏｒｅｎ Ｍ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｕｍｏｒ—
ｄｅｒｉｖｅｄ ＴＰ５３ ｍｕｔａｎｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
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【Ｊ】．Ｊｐｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００５，３５（３）：１２１—１２５．
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Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ Ｇ，Ｗｉｍａｎ ＫＧ．Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３：
ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＭＧＭＴ）ｂｙ ＤＮＡ ｄａｍａｇｉｎｇ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ１．
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［２０］Ｘｕ ＧＷ，Ｍｙｍｒｙｋ ＪＳ，Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓ ＪＧ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ＴＰ５３ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＰ５３ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ Ｕ８７ＭＧ ｇｌｉｏｍａ
ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ
ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＢＣＮＵ ａｎｄ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｌ Ｊ１．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００５，
ｉｎ ｔｈｅ ＩＡＲＣ ＴＰ５３ ｄａｔａｂａｓｅⅢ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２００７，２８（６）：
１１６ｆ２１：１８７—１９２．
６２２－６２９．
Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ：ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｓ ａ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ．
Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏ１．２０１１ Ａｎｇ １Ｚ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆｐｒｉｎｔ］
Ｓｍｉｔｈ ＳＪ，Ｌｏｎｇ Ａ，Ｂａｒｒｏｗ ＪＨ，Ｍａｃａｒｔｈｕｒ ＤＣ，Ｃｏｙｌｅ Ｂ，Ｇｒｕｎｄｙ ＲＧ；ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｇｒｏｕｐ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ￣Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＮＧ７
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Ｍｉｃｈｉｇａｎ—Ｆｌｉｎｔ，Ｆｌｉｎｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＭＩ ４８５０２，ＵＳＡ ．Ｌ．＾
Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ—ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａｓ（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅｓ ＩＩＩ ａｎｄ ＩＶ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ）ｒｅｍａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｖｅｒｙ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｆｏｒ
ｗｈｉｃｈ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｒｅ ｎｅｅｄｅｄ．Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ—ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）ｉｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏ ｈａｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ—ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＰＡＲＰ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ
ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，ａｎｄ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｅｘａｍｉｎｅｓ ｗｈｅｔｈｅｒ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｂｅ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ—ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ．Ｔｉｓｓｕｅ
ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １ ５０ ｆｏｒｍａｌｉｎ－－ｉｆｘｅｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ－－ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＡＲＰ
ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｆＡＩＦ１．Ｆｕｌｌ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｃｏｈｏ￣．
Ｓｔｒａｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａ］ｙｓｉｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＰＡＲＰ ｓｔａｔｕｓ ｏｎ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＰＡＲＰ
ｉｍｍｕｎｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ｈａｄ ａ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｉｎｖｅｒｓｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（Ｐ＝０．０１９）ｗｉｔｈ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｐｅｄｉａｔｉｒｃ ｈｉｇｈ—ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ．
ＡＩＦ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｎｏｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｔｓ ａｂｓｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｂｕｔ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｎｏｍｒａｌ ｂｒａｉｎ．
ＰＡＲＰ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｍａｎｙ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ—ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａｓ，ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｔｕｍｏｒｓ，ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＰＡＲＰ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ＡＩＦ
ａｐｐｅａｒｓ ｔｏ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｌｏｓｔ．ＰＡＲＰ ｍａｙ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅｓｅ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｗａｒｒａｎｔｓ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ
ｃ】ｉｎｉｃａ１ ｔｒ ａｌｓ
2024年8月31日发(作者：花如曼)
１５２
．
《中国神经肿瘤杂志》２０１１，９（３）：１５２—１５９
论著．
抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺
敏感性及其相关机制
王 翔 ，陈锦秀 ，毛 庆 ，刘艳辉 ，游 潮
（１．四川大学华西医院神经外科，四川成都 ６１００４１；２．四川省肿瘤医院，四川成都 ６１００４１）
【摘要】背景与目的：胶质瘤化疗耐药是胶质瘤治疗效果差的一个瓶颈。导致化疗耐药的分子机制目前尚
未完全清楚 突变ＴＰ５３的“获得功能”被认为是决定肿瘤发生及发展中的重要因素 本研究目的在于探讨突变
ＴＰ５３“获得功能”在多形性胶质母细胞瘤化疗耐药中的作用及其相关机制 方法：对人脑胶质瘤母细胞株Ｔ９８Ｇ
细胞进行ｍＲＮＡ测序．确定其ＴＰ５３基因是否突变及突变位点 采用脂质体法包裹化学合成的突变ＴＰ５３干扰小
ＲＮＡ片段ｆｓｉＲＮＡ１转染Ｔ９８Ｇ细胞 运用ＲＴ—ＰＣＲ方法在转染后的第１天至第５天检测肿瘤中突变ＴＰ５３在
ｍＲＮＡ水平的表达．及相应时点６一氧甲基鸟嘌呤一ＤＮＡ甲基转移酶（ＭＧＭＴ）ｍＲＮＡ的表达 将转染ｓｉＲＮＡ的
Ｔ９８Ｇ细胞接种于９６孑Ｌ板中．加入梯度浓度（１０～１０００ｔｘｍｏｌ／Ｌ）的替莫唑胺 模拟人体用药，替莫唑胺组在头５天
内每天更换培养基．加入替莫唑胺：对照组加入司莫司汀 用ＭＴＴ法观察各组在突变ＴＰ５３沉默前后的化疗敏感
性变化 结果：Ｔ９８Ｇ细胞的２３７号密码子发生突变，且高表达突变ＴＰ５３及ＭＧＭＴ ｍＲＮＡ。设计的ｓｉＲＮＡ可以
有效地沉默Ｔ９８Ｇ细胞株内突变ＴＰ５３基因．使其在ｍＲＮＡ水平不表达或者低表达．沉默作用时间可达５天 沉
默突变ＴＰ５３基因后．Ｔ９８Ｇ细胞株对替莫唑胺的敏感性增加４倍．对司莫司汀的敏感性无明显改变．．沉默突变
ＴＰ５３基因后，可使ＭＧＭＴ的表达降低，两者呈正相关。结论：突变型ＴＰ５３能增强胶质母细胞瘤细胞对替莫哗
胺化疗的耐药性．其耐药机制可能是通过上调ＭＧＭＴ的表达实现的
关键词：胶质母细胞瘤；突变；６ 氧甲基鸟嘌呤一ＤＮＡ甲基转移酶；肿瘤抑癌基因ＴＰ５３；ＲＮＡ干扰
中图分类号：Ｒ７３９．４１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１７２６—８１９２（２０１１）Ｏ３—０ｌ５２—０８
Ｄｏｗｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ
Ｘｉａｎｇ Ｗａｎｇ ，Ｊｉｎ—ｘｉｕ Ｃｈｅｎ ，Ｑｉｎｇ Ｍａｏ ，Ｙａｎ—ｈｕｉ Ｌｉｕ ，Ｃｈａｏ Ｙｏｕ
．
Ｄｅｐ￣ｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ
６１００４１，Ｐ Ｒ．Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＲａｄｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，
Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１．Ｐ Ｒ．Ｃｈｉｎａ
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ＆ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｏｂｓｔａｃｌｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ
ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｎｏｔ ｆｕｌｌｙ ｕｎｄｅｒｓｔｏｏｄ．Ｔｈｅ“ｇａｉｎ ｏｆ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ”ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｅｄ
ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ．
ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｉｎ Ｔ９８Ｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ａ ｈｕｍａｎ
ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｔ ｃｏｄｏｎ
２３７ ｏｆ ｇｅｎｅ ＴＰ５３，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ＤＮＡ
收稿日期：２０１１－０９—１０
通讯作者：王翔
修回日期：２０１１－０９—２７
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３
ｍＲＮＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ “ｓｉｌｅｎｃｅｄ”ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｔｏ：Ｘｉａｎｇ Ｗａｎｇ
Ｔｅｌ：８６．．２８．．８５４２２４８７
Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇ
ｘｉａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—
ＰＣＲ１ ｉｎ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ５ ｄａｙｓ．Ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌ１
王翔．等．抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺敏感性及其相关机制 １５３
ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｆ１０ １０００ｌｘｍｏｌ／Ｌ）．Ｔｈｅ
ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｒｅｍｏｖｅｄ ａｎｄ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｅｖｅｒｙ ｄａｙ ａｔ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ５ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ０６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ
ＤＮＡ—ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆＭＧＭＴ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ａｓ ｗｅｌ１．
ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｂｏｔｈ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ａｎｄ ＭＧＭＴ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔ９８Ｇ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ
ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｄａｙ ｔｏ ｆｉｆｔｈ ｄａｙ ｗａｓ ８３％，９５％，９３％，７６％，ａｎｄ７２％
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｌｅｄ ｔｏ ａ ｆｉｖｅｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ９８Ｇ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｃｅｌｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ．ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＧＭＴ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
ＣｏＮＣＬＵＳ１０Ｎ：Ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＴＰ５３ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ ｔｏ
ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｃｒｅａｓｅ ＭＧＭＴ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
ＫＥＹ ＷｏＲＤＳ：Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ；Ｍｕｔａｔｉｏｎ；０６＿ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ—ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；Ｔｕｍｏｒ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ５３
胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤．约占所有
赠。替莫唑胺原料２ｍｇ用５０ Ｌ二甲亚砜（ＤＭＳＯ）
溶解．然后在１０ｍＬ的ＤＭＥＭ培养基稀释（ＤＭＳＯ
浓度不超过０．５％）．配制成替莫唑胺浓度为
１０００Ｉｘｍｏｌ／Ｌ的母液 在此基础上进行稀释配成１０～
中枢神经系统肿瘤的４２％．其中３／４以上为高级别
胶质瘤 虽然以手术为主的综合治疗使胶质瘤的疗
效有了明显提高 特别是低级别的星形细胞瘤和少
突胶质细胞瘤患者可以达到３～５年的平均生存时
间．但高级别胶质瘤（间变性星形细胞瘤和胶质母
细胞瘤）患者的平均生存时间还只有１２ ｌ５个月
胶质母细胞瘤患者１年生存率约为３０％．五年生存
率还不足５％ 目前围际上对胶质母细胞瘤的治疗
是以术后替莫唑胺化疗为主辅以同步放疗的方式．
ｌＯ００ｔｘｍｏｌ／Ｌ不同浓度的实验用液 司莫司汀在四川
省肿瘤医院购得．在ＤＭＳＯ中溶解后可以最高配成
浓度为４００Ｉｘｇ／ｍＬ的母液．稀释成梯度浓度的实验
用液 Ｔ９８Ｇ细胞株由四川大学移植免疫实验室（卫
生部重点实验室）提供：大多数文献已证实Ｔ９８Ｇ
细胞是多种药物化疗耐药的细胞株 ，１１］ ＲＮＡ干
但２年的总体生存率也不过２６％ｌｌ＿２１ 化疗反应患者
个体差异较大．因此替莫唑胺化疗耐药成为胶质母
细胞瘤治疗疗效不佳的瓶颈
肿瘤抑癌基因ＴＰ５３（Ｔｕｍ０ｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ
ｐ５３．ＴＰ５３）在３０％～５０％的胶质母细胞瘤中均发生
突变＿３＿ 突变型ＴＰ５３基因不仅仅表现为原来抑癌功
能的丧失（即ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ） 还被证明具有了更多
原癌基因的功能（即ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ｌ ４】。正常细胞的
扰转染试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司
１．２ ＴＰ５３ ｍＲＮＡ测序
ＴＰ５３的ｍＲＮＡ全序列有２６３０个碱基．分布于
１１个区 选择其中突变热点的４—８区进行测序 测
序引物为５ 一ＣＡＧＴＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＧ一３ 和
５ 一１ＴＩ１Ｃ 丌Ｃ１］ ＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧ一３ ．测序范围包
含１６８０个碱基 选取不同样本反复测序３次 反应
试剂为ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｐ５３突变后易发生癌变．肿瘤细胞内的ＴＰ５３突变
后会使该肿瘤细胞的恶性程度增加．肿瘤细胞生长
及抗凋亡的能力增加 而且突变ＴＰ５３会提高卵巢
癌、肺癌、骨肉瘤、前列腺癌以及直肠癌的化疗耐药
性和放疗抵抗性 突变ＴＰ５３的表达与多药耐药
因子在这些肿瘤中的表达是成正相关的［９１ 突变
Ｋｉｔ．测序仪为ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３０ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ
１．３细胞培养与细胞转染
Ｔ９８Ｇ细胞１．５×１０ ／：ｆＬ．接种６孔板．在含５％
小牛血清的ＤＭＥＭ培养基，ＣＯ 培养箱（３７ 、０
１９％、ＣＯ ５％）中进行培养，培养２４ｈ使转染前细胞
汇合度达到５０％～６０％ 转染在无血清培养基中进
行．干扰片段ｓｉＲＮＡ寡核苷酸与转染试剂脂质体在
稀释后按一定比例混匀．室温放置３０ｍｉｎ形成
ＴＰ５３是否在胶质瘤中也具有增强化疗耐药性的作
用，目前还尚未见报道。本课题旨在通过脂质体转
染人胶质母细胞瘤细胞．ＲＮＡ干扰技术沉默突变
型ＴＰ５３的表达．研究突变型ＴＰ５３在胶质瘤化疗
ｓｉＲＮＡ与脂质体复合物．再加人含细胞的培养基
中。转染后的细胞在ＣＯ，培养箱中３７℃温育１２ｈ后
耐药方面的作用．并探讨其相关机制 更换培养基．继续培养１２～３６ｈ后．进行转染后的其
它检测步骤 最佳转染条件及ｓｉＲＮＡ与脂质体的最
佳比例由ＦＡＭ荧光标记ｓｉＲＮＡ寡核苷酸转染
Ｔ９８Ｇ细胞确定 突变ＴＰ５３干扰的ｓｉＲＮＡ寡核苷
酸序列为２１ｂＤ的小片段（正义链为５ 一
１材料与方法
１．１ 材料
替莫唑胺由中国天士力公司（Ｔａｓｌｙ．Ｃｈｉｎａ）￣
１５４ 王 翔．等．抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺敏感性及其相关机制
ＣＵＡＣＵＵＣＣＵＧＡＡＡＡＣＡＡＣＧｄＴｄＴ一３ ．反义链为
特异性ｓｉＲＮＡ寡核苷酸转染组），脂质体对照组（只
加人脂质体转染试剂）和空白对照组。转染后ＲＮＡ
干扰观察时间为５天。分组及样本编号见表１。
５ 一ＣＧＵＵＧＵＵＵＵＣＡＧＧＡＡ ＧＵＡ ＧｄＴｄＴ一３ ）。分别
设立实验组和对照组。对照组包括阴性对照组（非
表１ ｓｉＲＮＡ细胞干扰试验分组情况（样本编号）
１．４逆转录ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ１
应用Ｔｒｉｚｏｌ体系提取ＲＮＡ．ＲＴ—ＰＣＲ实验按常
规方法进行。ｃＤＮＡ在一２０ 保存备用 进行ＰＣＲ分
析的引物．突变型ＴＰ５３为５ 一ＡＣＡＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡ
ＡＡＣＣＡＣＣ一３ 和５ 一ＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＧ
曲线，并计算ＩＣ∞。
２ 结 果
２．１ Ｔ９８Ｇ细胞株ＴＰ５３的突变
有２个位点的密码子不同 第１个是第７２位
ＡＡ一３ ，扩增产物长度是３５０ｂｐ：ＭＧＭＴ为５ 一ＧＴＣ
ＧＴＦＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＧＴＴＡ一３ 和５ 一ＡＣＡＧＧＡｒｒｒＩ’
氨基酸密码子ＣＣＣ．而正常野生型ＴＰ５３是ＣＧＣ
第２个不同位点是第２３７位氨基酸密码子ＡＴＡ．而
正常野生型ＴＰ５３是ＡＴＧ 第１个位点属于正常的
单核苷酸多态性ｆｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．
ＧＣＣＴＣＴＣＡ ｒｒＧＣＴＣ一３ ．扩增产物长度是１４０ｂｐ；
内参对照物为ＧＡＰＤＨ 反应条件：９４℃预变性
５ｍｉｎ．然后进入ＰＣＲ循环（９４￣Ｃ变性２０ｓ．５８ｃｃ退火
ＳＮＰ）．不属于突变位点：第２个不同位点是一个错
义突变位点 故Ｔ９８Ｇ细胞株存在ＴＰ５３基因的单
位点变异，突变点在２３７号密码子，Ｇ突变成Ａ，直
接导致编码的甲硫氨酸突变成异亮氨酸ｆ图１１ 这
一
３０ｓ，７２℃延伸５０ｓ），共３５个循环。最后７２℃后保持
１０ｒａｉｎ．取出产物４ＣＣ保存 １．５％琼脂糖凝胶电泳分
析并照相 利用凝胶电泳成像分析系统对扩增带进
行强度分析．分别计算每条泳道的突变ＴＰ５３／
ＧＡＰＤＨ、ＭＧＭＴ／ＧＡＰＤＨ总强度比值．用来表示样
品中突变ＴＰ５３和ＭＧＭＴ ｍＲＮＡ水平
１．５细胞药敏实验
将对数生长期的１．０ Ｘ １０４细胞／－Ｒ接种９６孔
结果与ＩＡＲＣ ＴＰ５３ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｗｗｗ－ｐ５３．ｉｒａｅ．ｆｒ）吻
合。
２．２ Ｔ９８Ｇ细胞的替莫唑胺化疗敏感性、突变
ＴＰ５３和ＭＧＭＴ的表达
Ｔ９８Ｇ细胞对替莫唑胺化疗有明显的化疗耐受
性．本细胞实验中仅在最高浓度（１０００￣ｍｏｌ／Ｌ）的替
莫唑胺干预下该细胞有明显的减少ｆ图２Ａ１。该细胞
样品的ＲＴ—ＰＣＲ检测，可见在３５０ｂｐ和１４０ｂｐ的位
置分别 现强表达的条带．分别是突变ＴＰ５３和
板．其中部分细胞进行了细胞转染ＲＮＡ干扰．１天
后（细胞贴壁）分别加入不同浓度梯度（１０～
１０００１￣ｍ０１／Ｌ）的替莫唑胺和司莫司汀实验液．共设
立４个观察组（替莫唑胺干扰组、替莫唑胺未干扰
组、司莫司汀干扰组和司莫司汀未干扰组）和２个
对照组（脂质体组和空白组） 替莫唑胺组每天更换
培养基．每天加入替莫唑胺．连续５天，在第６天或
ＭＧＭＴ（图３Ａ） 因此．Ｔ９８Ｇ细胞高表达突变ＴＰ５３
和ＭＧＭＴ。
２．３ ｓｉＲＮＡ转染Ｔ９８Ｇ细胞后突变ＴＰ５３的沉默
情况
第７天进行细胞数测定 司莫司汀组仅加药１次．
以后视情况更换培养基．尽量减少更换培养基的次
荧光标记阴性对照ｓｉＲＮＡ寡核苷酸转染Ｔ９８Ｇ
细胞．荧光显微镜下观察转染情况．转染效率最好
（视野内出现荧光的细胞占所有细胞的８５％以上１
时的转染条件为：ｓｉＲＮＡ２．５ ｇ，脂质体７．５１ｘｇ（６孑Ｌ
板），在行转染后的１２～２４ｈ．细胞内就开始有荧光
出现（图４）
数．在第６天或第７天进行细胞数测定 观察期结
束时采用ＭＴＴ方法进行细胞数测定 每孔加入
ＭＴＴ２０ ＬＬＬ，３７℃继续培养２ｈ后每孔加入１５０１ｘＬ
ＤＭＳＯ溶解，震荡１５ｍｉｎ，选择５７０ｎｍ波长，在酶联
免疫检测仪上测定各孔光吸收值 以细胞存活率为
纵坐标．不同药物浓度为横坐标绘制细胞的生存率
１５８ 王翔．等．抑制突变ＴＰ５３增强胶质母细胞瘤细胞替莫唑胺敏感性及其相关机制
莫唑胺化疗是否耐药的主要因素 。野生型Ｐ５３与
ＭＧＭＴ在人胶质瘤标本中免疫组化检测的结果显
示两者有一定的联系．在体外的实验中也显示两者
之间有调节的作用．但就所参考的文献而言．两者
之间呈正相关或负相关均有报道Ｂ７－２０１ 这可能与对
ＴＰ５３的突变忽视有关．肿瘤标本在体外超过３０
ｍｉｎ ＴＰ５３就会发生突变 在细胞中进行ＴＰ５３基因
测序明确突变点以及进行实时的ＴＰ５３含量检测可
以更加真实地反映突变的情况
ＴＰ５３突变后．由于肿瘤细胞自身凋亡能力的
丧失而增加细胞的耐药性是毫无疑问的 而突变
ＴＰ５３的“获得功能”在胶质瘤耐药方面的体现．以
及突变ＴＰ５３与ＤＮＡ修复相关因子ＭＧＭＴ之间的
联系正是本次实验研究的重点 我们的研究结果显
示正常情况下替莫唑胺根本不能抑制该ＴＰ５３突变
胶质母细胞瘤细胞的生长．而沉默突变ＴＰ５３后该
胶质瘤细胞显示出良好的药物反应．提示突变
ＴＰ５３使细胞耐药 ＭＧＭＴ在此次干扰实验中与突
变ＴＰ５３同步变化．两者的表达成正相关．提示突变
ＴＰ５３增加细胞耐药性可能是通过上调细胞内
ＭＧＭＴ的含量，提高了ＤＮＡ自我修复能力实现的
这一过程是否与ＭＧＭＴ启动子甲基化有关．可以
通过后续的甲基化检测来实现。尽管突变ＴＰ５３参
与胶质瘤耐药的途径有多种．但就本研究结果看
来．突变ＴＰ５３调节ＭＧＭＴ的能力很强．干扰突变
ＴＰ５３使ＭＧＭＴ下调的程度大于突变ＴＰ５３自身下
调的程度 突变ＴＰ５３从ＤＮＡ修复的途径参与胶质
瘤耐药．可能是其主要部分。
替莫唑胺是一种新型的细胞毒性烷化剂．自
２００５年被美国ＦＤＡ批准开始用于新发和复发的高
级别胶质瘤治疗．在临床上已显示了较好的治疗效
果和极低的副反应，患者耐受力好。虽然司莫司汀
也是一种细胞毒性的烷化剂．但不同的是替莫唑胺
的活性代谢物为线状三嗪、单甲基三氮烯咪唑碳酰
胺（ＭＴＩＣ） ＭＴＩＣ的细胞毒主要为发生在鸟嘌呤的
０ 位的烷化作用 鸟嘌呤的Ｏ 位也是ＭＧＭＴ发生
修复作用的主要位点．这可以解释突变ＴＰ５３通过
与ＭＧＭＴ的关系来调节肿瘤细胞对替莫唑胺的耐
药性．而不能调节对司莫司汀的耐药性 细胞实验
中实行替莫唑胺５天内每天换液．是为了更好模拟
临床上替莫唑胺５天疗程的用法．而且在这５天内
保证了突变ＴＰ５３较好的“沉默” 虽然替莫唑胺临
床上的用法还在不断改进．包括长期小剂量的使
用．这就要求更长的ＲＮＡ干扰时间．脂质体转染就
不能满足这样的要求．构建质粒虽然较为复杂但可
以达到很长时间的干扰效果
充分认识胶质瘤ＴＰ５３突变的意义．以及突变
型ＴＰ５３作为一个独立因子所起的作用：充分认识
其“获得功能”，以及它对胶质瘤耐药带来的影响．
也许能够开辟新的思路和途径来克服胶质瘤化疗
耐药
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ｇｌｉｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＰ５３－ｍｅｄｉａｔｅｄ
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王
一 ＿
Ｕ
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＿ 一＿ 一
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ｄｅｒｉｖｅｄ ＴＰ５３ ｍｕｔａｎｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
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ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＭＧＭＴ）ｂｙ ＤＮＡ ｄａｍａｇｉｎｇ
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Ｐｅｔｉｔｊｅａｎ Ａ，Ｍａｔｈｅ Ｅ，Ｋａｔｏ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ
［２０］Ｘｕ ＧＷ，Ｍｙｍｒｙｋ ＪＳ，Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓ ＪＧ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ＴＰ５３ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＰ５３ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ Ｕ８７ＭＧ ｇｌｉｏｍａ
ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ
ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＢＣＮＵ ａｎｄ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｌ Ｊ１．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００５，
ｉｎ ｔｈｅ ＩＡＲＣ ＴＰ５３ ｄａｔａｂａｓｅⅢ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２００７，２８（６）：
１１６ｆ２１：１８７—１９２．
６２２－６２９．
Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ：ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｓ ａ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ．
Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏ１．２０１１ Ａｎｇ １Ｚ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆｐｒｉｎｔ］
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ｗｈｉｃｈ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｒｅ ｎｅｅｄｅｄ．Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ—ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）ｉｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏ ｈａｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ，
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ—ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＰＡＲＰ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ
ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，ａｎｄ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｅｘａｍｉｎｅｓ ｗｈｅｔｈｅｒ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｂｅ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ—ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ．Ｔｉｓｓｕｅ
ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １ ５０ ｆｏｒｍａｌｉｎ－－ｉｆｘｅｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ－－ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＡＲＰ
ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｆＡＩＦ１．Ｆｕｌｌ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｃｏｈｏ￣．
Ｓｔｒａｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａ］ｙｓｉｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＰＡＲＰ ｓｔａｔｕｓ ｏｎ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＰＡＲＰ
ｉｍｍｕｎｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ｈａｄ ａ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｉｎｖｅｒｓｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（Ｐ＝０．０１９）ｗｉｔｈ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｐｅｄｉａｔｉｒｃ ｈｉｇｈ—ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ．
ＡＩＦ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｎｏｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｔｓ ａｂｓｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｂｕｔ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｎｏｍｒａｌ ｂｒａｉｎ．
ＰＡＲＰ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｍａｎｙ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｈｉｇｈ—ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａｓ，ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｔｕｍｏｒｓ，ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＰＡＲＰ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ＡＩＦ
ａｐｐｅａｒｓ ｔｏ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｌｏｓｔ．ＰＡＲＰ ｍａｙ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅｓｅ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｗａｒｒａｎｔｓ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ
ｃ】ｉｎｉｃａ１ ｔｒ ａｌｓ