2024年6月15日发(作者：褒籁)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.6
(22)申请日 2016.03.24
(71)申请人 南京林业大学
地址 210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路159号
(72)发明人 龙良鲲 丁少军 丁达繁 徐梅娟
(74)专利代理机构 南京申云知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人 邱兴天
(51)
C12N1/15
C12N15/80
C12N9/42
C12R1/885
(10)申请公布号 CN 105647821 A
(43)申请公布日 2016.06.08
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其
构建方法和应用
(57)摘要
本发明公开了一株瑞氏木霉工程菌
CstrxR1及其构建方法和应用。瑞氏木霉工
程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉
Trichoderma？reesei？
CstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏
中心，保藏日期为：2016年3月1日，保
藏编号为CCTCC？NO:？M2016078，保藏
地址为中国湖北武汉武汉大学。本发明的
瑞氏木霉工程菌CstrxR1，其各纤维素酶产
量与瑞氏木霉亲本菌株相比提高0.78倍。
本发明对提高纤维素酶生产效率具有重要
应用价值。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
未缴年费专利权终止IPC(主分
类):C12N 1/15专利
2022-03-11
号:ZL2申请
日:20160324授权公告
日:20181218
法律状态
专利权的终止
权 利 要 求 说 明 书
1.一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉Trichodermareesei
保
CstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年3月1日，
藏编号为CCTCCNO:M2016078，保藏地址为中国湖北武汉武
汉大学。
2.根据权利要求1所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1，其特征在于，在所述的
序
3.构建权利要求2所述瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法，其特征在于：将
基
瑞氏木霉工程菌CstrxR1中克隆有来自于虫拟蜡菌的硫氧还蛋白还原酶基因
列，该基因序列如SEQIDNO.1所示。
序列如SEQIDNO.1所示的DNA片段通过质粒pAg1-CstrxR1导入瑞氏木霉
因组，所述质粒pAg1-CstrxR1是在质粒pAg1-H3的KpnI和
瑞氏木霉纤维二糖水解酶I启动子序列Pcbh1、
A片段和瑞氏木霉纤维二糖水解酶
ApaI位点顺序装入
序列如SEQIDNO.1所示的DN
I终止序列Tcbh1。
4.根据权利要求3所述构建瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法，其特征在于：
5.权利要求1所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1在产纤维素酶中的应用。
所述瑞氏木霉为瑞氏木霉D-86271。
说 明 书
技术领域
本发明属于工程菌技术领域，具体涉及一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其应用。
背景技术
纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖单体的一组酶系的总称，通常包括内切型葡聚
糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶资源对于可持续利用生物质资
源具有重要意义，可广泛应用于生物能源、饲料、洗涤、造纸及植物源活性物质制
备等领域。瑞氏木霉（Trichodermareesei）能够产生完整的纤维素酶系，是
工业生产纤维素酶的重要菌株。当前，传统的诱变育种技术难以继续提升瑞氏木霉
产纤维素酶的能力。借助基因工程手段改良瑞氏木霉的纤维素酶产生能力，成为降
低纤维素酶生产成本的有效途径。
丝状真菌的细胞氧化还原状态能够控制许多重要基因的表达调控。硫氧还蛋白系统
（thioredoxinsystem）是存在于绝大多数生物体中的一类抗氧化系统，具有调控细
胞氧化还原平衡等多种重要功能。硫氧还蛋白从氧化态转化成还原态依赖于硫氧还
蛋白还原酶（thioredoxinreductase，TrxR）的催化作用。因而，TrxR对于胞内的氧
化还原平衡或某些蛋白分子的氧化还原状态具有重要的调控作用。瑞氏木霉细胞中
具有高水平的TrxR会极大的改变其细胞氧化还原状态，进而增强相关蛋白（如纤
维素酶）分子的基因表达。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株瑞氏木霉工程菌
CstrxR1，能高产纤维素酶。本发明的另一目的是提供上述瑞氏木霉工程菌CstrxR1
的构建方法。
技术方案，为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉
TrichodermareeseiCstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：
2016年3月1日，保藏编号为CCTCCNO：M2016078，保藏地址为：中国湖北武
汉武汉大学。
在所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1中克隆有来自于虫拟蜡菌的硫氧还蛋白还原酶基
因序列，该基因序列如SEQIDNO.1所示。
构建所述瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法：将序列如SEQIDNO.1所示的DNA片段
通过质粒pAg1-CstrxR1导入瑞氏木霉基因组，所述质粒pAg1-CstrxR1是在质粒
pAg1-H3的KpnI和ApaI位点顺序装入瑞氏木霉纤维二糖水解酶I启
动子序列Pcbh1、序列如SEQIDNO.1所示的DNA片段和瑞氏木霉纤维二糖水解酶
I终止序列Tcbh1。
所述瑞氏木霉为瑞氏木霉D-86271。
所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1在产纤维素酶中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明成功构建出瑞氏木霉工程菌CstrxR1，通过实
验证明高表达虫拟蜡菌中硫氧还蛋白还原酶编码基因的瑞氏木霉工程菌，其纤维素
酶产量（滤纸酶活）与亲本瑞氏木霉相比提高0.78倍。本发明对工业生产中提高
纤维素酶生产效率具有重要的应用价值。
附图说明
图1是表达质粒pAg1-CstrxR1的图；
图2是基因CstrxR1大肠杆菌重组表达SDS-PAGE电泳检测图；
图3是CstrxR1基因瑞氏木霉转化株的鉴定图；
图4是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株纤维素酶产量的比较图；D-86271为
未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌，CK为含空载体的瑞氏木霉转
化菌株；
图5是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株胞外蛋白的比较结果图；D-86271为
未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌，CK为含空载体的瑞氏木霉转
化菌株；
图6是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株生物量的比较结果图；D-86271为未
转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌；
图7是瑞氏木霉基因工程菌株发酵培养过程中纤维素酶合成基因的相对表达量结果
图；其中，D-86271为未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。下述实施例中所使用的实验方法如
无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，
均可从商业途径得到。
实施例1基因表达载体pAg1-CstrxR1的构建
1、虫拟蜡菌硫氧还蛋白还原酶编码基因CstrxR1的获得及表达
分析虫拟蜡菌（CeriporiosissubvermisporaB）的全基因组序列（GenBank
号:AEOV00000000.1），获得一个候选的硫氧还蛋白还原酶蛋白编码基因
CstrxR1。采用Trizol试剂分离虫拟蜡菌（Ceriporiopsissubvermispora）
FP-105752-Sp（由ForestProductsLaboratory
（CentreforForestMycologyResearch）,Madison,WI,USA提供）的总RNA，并以反
转录试剂盒（TransGen，北京）进行cDNA第一链的合成（oligo（dT）引物），
并作为模板以引物CstrxR_f1（含NdeI识别序列和保护碱基）和CstrxR_r1
（含HindIII识别序列和保护碱基）扩增获得CsTrxR1的cDNA片段。
将获得的cDNA片段克隆到载体pEASY-Blunt（TransGen，北京），并由上海英骏
生物技术公司进行测序分析（Invitrogen,上海），经测序验证正确，其序列如
SEQIDNO.1所示，推测得出对应的蛋白序列如SEQIDNO.2所示。各引物的序列如
下：
CstrxR_f1：5′-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-3′；
CstrxR_r1：5′-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-3′。
对CstrxR1基因的cDNA片段进行NdeI/HindIII双酶切，并连
接入大肠杆菌（）表达载体pET23b（Novagen，Germany）的相应位
点，获得质粒pET-CstrxR1。根据产品操作说明，将pET-CstrxR1转入大肠杆菌表
达菌株（）Rosseta菌株（TransGen，北京），并以异丙基-1-硫代β-D
吡喃型半乳糖（IPTG）进行诱导表达。借助表达的CstrxR1重组蛋白具有C端融
合的组氨酸标签，对其进行His·Bind柱（Novagen，Germany）纯化，并进行SDS-
PAGE电泳检测（如图1所示）。图1显示，获得的重组CstrxR1分子大小与理论
分子量（38.4kD,包括His标签）相符。
2、构建瑞氏木霉基因表达质粒pAg1-CstrxR1
以瑞氏木霉（Trichodermareesei）D-86271（=Rut-C30）（购买于
VTTculturecenter，Finland）基因组DNA为模板，在高保真酶（Fastpfu）作用下，
以引物Tcbh1_f（含XhoI识别序列和保护碱基）/Tcbh1_r（含ApaI识
别序列和保护碱基）扩增获得长1088bp的纤维二糖水解酶I终止序列（Tcbh1），
并将其插入pAg1-H3（Zhang,A.,Lu,P.,Dahl-
Roshak,A.M.,Paress,P.S.,Kennedy,S.,Tkacz,J.S.,An,Z.,entdisruptionofapolyke
tidesynthasegene（pks1）
requiredformelaninsynthesisthroughAgrobacterium-
mediatedtransformationofGlarealozoyensis.MolGenGenomics268,645-
655.）的XhoI/ApaI位点，获得质粒pAg1-Tcbh1。同时，以瑞氏木霉
（Trichodermareesei）D-86271基因组DNA为模板，以引物
Pcbh1_f/Pcbh1_r扩增获得891bp纤维二糖水解酶I启动子序列（Pcbh1）。以质粒
pET-CstrxR1为模板，以引物CstrxR_f2/CstrxR_r2扩增获得CstrxR1基因序列。通
过HieffCloneTMOneStepPcr克隆试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司,上海）将以
上获得的Pcbh1和CstrxR1基因序列同源重组方式克隆到质粒pAg-Tcbh1（经过
KpnI/XhoI双酶切），产生质粒pAg1-CstrxR1。基因表达质粒pAg1-
CstrxR1的物理图谱如图2所示。各引物序列如下：
CstrxR_f2：5′-catgtctagaatggcacccctcacgaatg-3′；
CstrxR_r2：5′-ctttcgcacggagctctcgagctagtggtggtggtggtggtgctc-3′；
Pcbh1_f：5′-agtgaattcgagctcggtaccgatagcagtgtctagtagca-3′；
Pcbh1_r：5′-tgaggggtgccattctagacatgatgccagtccgcggttg-3′；
Tcbh1_f：5′-gactcgagagctccgtgcgaaagcctgacgca-3′；
Tcbh1_r：5′-ctgggcccatcgtaaccgagaatccagagctg-3′。
实施例2构建表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株
1、基因表达质粒pAg1-CstrxR1转化根癌农杆菌
取1μg质粒pAg1-CstrxR1的DNA加入根癌农杆菌
（Agrobacteriumtumefaciens）AGL-1
（Mullins,E.D.,Chen,X.,Romaine,P.,Raina,R.,Geiser,D.M.,Kang,S.,2001.Agrobacteri
um-
mediatedtransformationofFusariumoxysporum:anefficienttoolforinsertionalmutag
enesisandgenetransfer.Phytopathology.91:173-180.）的感受态细胞中混匀，放
入液氮中5分钟。取出，立即在42℃热激2分钟后加入700μLLB液体培养基，28℃
振荡培养2小时。将菌液均匀涂布在含有75μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，28℃
倒置培养2天，得到含有重组质粒pAg1-CstrxR1的根癌农杆菌单菌落。
2、根癌农杆菌介导的遗传转化及菌株的初步抗性筛选
将获得的含有重组质粒pAg1-CstrxR1的根癌农杆菌单菌落接种于5mLMM液体培
养基中，28℃振荡培养2天。用IM培养基将菌体稀释到
OD600=0.15，28℃振荡培养6小时，至
OD600=0.6。取100μL菌液与等体积的瑞氏木霉
（Trichodermareesei）D-86271孢子悬液混合（悬液浓度=2×106
个孢子/mL），均匀涂布在CM琼脂平板（铺有玻璃纸）上，24℃正置共培养3天。
将共培养菌体转接至含有75μg/mL潮霉素B和400μg/mL噻孢霉素钠的PDA琼脂
平板上，28℃倒置培养4-5天至含有潮霉素B抗性基因的转化子长出。
3、PCR筛选表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株
将获得的潮霉素B抗性的转化子接种于Mandels培养基（以1%乳糖作为碳源），
28℃、180rmp振荡培养2天。根据前述方法提取其总DNA和RNA后，分别进行
如下PCR和RT-PCR反应：
PCR（图3A）：根据hph（潮霉素抗性基因）设计引物hph_f/hph_r，目的
产物为0.9kb；RT-PCR（图3B）：根据CstrxR的特异性引物
CstrxR_f1/CstrxR_r1，目的产物为1.032kb；各引物序列如下：
CstrxR_f1：5′-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-3′；
CstrxR_r1：5′-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-3′；
hph_f：5′-aagttcgacagcgtctcc-3′；
hph_r：5′-ttccactatcggcgagta-3′。
同时，以未经转化的瑞氏木霉（Trichodermareesei）D-86271、空载体pAg1-
Tcbh1的瑞氏木霉转化菌株（CK）和无菌水（NC）为对照，PCR扩增产物进行琼
脂糖电泳检测。结果如图3所示。图3A中，以质粒pAg1-CstrxR1和空载体pAg1-
Tcbh1转化的瑞氏木霉的菌株均能获得0.9kb的条带；未转化菌株D-86271和无菌
水（NC）均无扩增条带。图3B中，含质粒pAg1-CstrxR1的瑞氏木霉基因工程菌
可获得1.032kb的目标条带，而未转化菌株D-86271、pAg1-Tcbh1转化菌（CK）
和无菌水（NC）均无扩增条带。
从筛选的9株高表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株中取一株编号为
CstrxR1，2016年3月1日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），分类名称
为瑞氏木霉（Trichodermareesei）CstrxR1，保藏编号为CCTCCNO：
M2016078。
瑞氏木霉CstrxR1在正常培养条件下菌落呈广铺的棉絮状，起初为白色致密的平坦
菌丝，而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区，反面无色；分生孢子梗菌丝的短侧枝，
透明，多分枝；小梗瓶形，中部弯曲，形成大量的分生孢子，分生孢子椭圆形或长
形，单细胞，透明，无色，壁光滑，成堆时绿色；该菌可正常利用葡萄糖、淀粉、
甘油等碳源，及蛋白胨、尿素、硫酸铵等氮源。
实施例3瑞氏木霉基因工程菌株的发酵及纤维素酶的产量测定
取瑞氏木霉基因工程菌株CstrxR1接种于PDA斜面，28℃培养7天，等待产生分
生孢子。取1×108个瑞氏木霉孢子接种于100mLMandels培养基（以1%
葡萄糖作为碳源），28℃，180rpm培养2天。取1mL菌悬液接入固态发酵培养基
中，并于30℃、70%湿度条件下黑暗发酵培养15天。
固态发酵培养基配方：麦杆（粉碎至1-3mm，且脱木素）1.5g，麸皮1.5g，
10×Mandels培养基（同上述，不含碳源）5mL，以上组分装入250-mL三角瓶中，
充分混匀，高压灭菌。麦杆的脱木素方法：按每10g麦杆加入20mL4%NaOH溶液，
混匀后，121℃、20min处理，并以流水去除褐色物质，处理后的麦杆晾干备用。
发酵结束后，按每三角瓶加入30mL无菌水（含0.1%Tween-80），搅拌均匀，并
于28℃、120rpm振荡浸提2h。继续以7000rpm离心20min，将粗酶液转入新的离
心管中，于4℃冰箱保存。
滤纸酶活的测定，以WhatmanNO.1滤纸（3cm×0.5cm）作为底物，50℃反应
60min；内切型纤维素酶（EG）活的测定以1%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）作
为底物，50℃反应30min；最后均以3,5-二硝基水杨酸法DNS的方法
（Miller,G.L.,initrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugar.
AnalChem,31,426-428.）测定还原糖的生成量，通过标准葡萄糖曲线，换算获
得酶活（IU/g基质干重）。β-葡萄糖苷酶的活性测定，以5mM的4-硝基苯基-β-D-
吡喃葡萄糖苷（pNPG）作为底物，50℃反应30min，并根据标准曲线，计算酶活
性（IU/g基质干重）。以上酶活测定均在pH4.8的50mM的柠檬酸缓冲液中进行，
每处理3-4次重复。
滤纸酶或CMC酶单位酶活定义为：该实验条件下，每分钟催化相应底物生成
1μmol葡萄糖的酶量。β-葡萄糖苷酶单位酶活定义为：该实验条件下，每分钟催化
pNPG生成1μmol4-硝基苯酚的酶量。
结果如图4所示，表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产β-
葡萄糖苷酶、CMC酶和滤纸酶活性均显著高于未转化的亲本瑞氏木霉（D-86271）。
发酵13天后，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的β-葡萄糖苷酶、CMC酶和滤纸酶的
产量分别比亲本菌株D-86271增加了0.84、0.48和0.78倍。同时，对照质粒pAg1-
Tcbh1转化菌（CK）各种酶的产量与未转化的瑞氏木霉亲本菌株（D-86271）一致。
实施例4固态发酵瑞氏木霉胞外蛋白的分析
取实施例3中各菌株的发酵液，按一定比例稀释后，以BCA检测试剂盒
（ThermoTech，USA）测定菌株发酵所产胞外蛋白总量。结果如图5所示，在发
酵7到15天，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产胞外蛋白量显著高于未转化的瑞
氏木霉亲本菌株D-86271。在发酵13天后，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产胞
外蛋白量比未转化的瑞氏木霉亲本菌株D-86271增加了1.4倍。
实施例5、固态发酵过程中瑞氏木霉菌体生物量的测算分析
通过测定发酵基质中菌丝体的核酸含量，间接法换算出菌体的生物量。取2g固态
发酵物70℃，烘干12小时，并于液氮中充分研磨至粉状。取0.04g研磨物放入
1.5mL无菌离心管中，并加入1mL5%三氯乙酸后充分混合。混合物于80℃水浴锅
处理30分钟（每5分钟混匀一次），后置于冰上3分钟。10,000g离心10分钟，
上清转入新的离心管中。样品稀释100倍后，测定波长260nm下的吸光值，并根
据标准曲线计算菌体生物量。
标准曲线的制作：以Mandels培养基（以1%葡萄糖作为碳源）培养获得纯的瑞氏
木霉菌丝体，并烘干至恒重。分别取0、2.5、5、10、20、40mg干菌丝按照以上方
法测定其中的核酸含量，并以菌丝干重为纵坐标和核酸含量为横坐标，绘制出标准
曲线。
结果如图6显示：发酵5到15天，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的生物量低于未
转化的瑞氏木霉亲本菌株D-86271。因此，CstrxR1基因的表达并没有增加
瑞氏木霉的菌体生物量。
实施例6瑞氏木霉基因工程菌株中纤维素酶合成相关基因的转录分析
用Trizol试剂分别提取经实施例3发酵培养5天、7天、9天和11天瑞氏木霉基因
工程菌株CstrxR1和瑞氏木霉亲本菌株D-86271的菌体样品总RNA。取1μg的
RNA用TransScript?RT/RIEnzymeMix（引物oligo（dT）和6-mers随机引物）
（Transgene，北京）合成cDNA。以该cDNA为模板，用引物Qcel1a_f/Qcel1a_r、
QeglI_f/QeglI_r和Qcbh1_f/Qcbh1_r分别对β-葡萄糖苷酶合成基因cel1a
（Genbank号：XM_006963374）、内切型纤维素酶合成基因eglI（Genbank
号：XM_006965612）和纤维二糖水解酶合成基因cbh1（Genbank号：
XM_006969162）进行实时定量PCR（ABIStepOnePlus,USA）。反应程序：94℃预
变性30s；94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸10s（40个热循环）。设置不添
加反转录产物的阴性对照。同时，以β-actin基因表达为内参，Pfaffl’s方法计算目
标基因的相对转录水平（即相对表达量），结果如图7所示。所用引物的序列如下：
Qcbh1_f：5′-cttggcaacgagttctctt-3′；
Qcbh1_r：5′-tgttggtgggatacttgct-3′；
Qcel1a_f：5′-cgtgctcttcaccaacaa-3′；
Qcel1a_r：5′-tcttgctgatccacacca-3′；
QeglI_f：5′-cttctgctgcaacgagatgg-3′；
QeglI_r：5′-tcttggaggtgtcaacggtat-3′；
Qactin_f：5′-tccatcatgaagtgcgac-3′；
Qactin_r：5′-gtagaaggagcaagagcagtg-3′。
其中引物Qcbh1_f、Qcbh1_r、Qcel1a_f、Qcel1a_r、Qactin_f及Qactin_r源自文献
Xu,J.T.,Zhao,G.L.,Kou,Y.B.,Zhang,W.X.,Zhou,Q.X.,Chen,G.J.,Liu,W.F.,ellul
arbeta-
glucosidasesCEL1aandCEL1bareessentialforcellulaseinductiononlactoseinTrichoder
mareesei.EukaryoticCell,13（8）:1001-1013。
结果表明：纤维素酶合成基因cel1a、egl1和cbh1在瑞氏木霉
基因工程菌（CstrxR1）中的表达水平显著高于未转化的亲本瑞氏木霉菌株D-
86271，这进一步证明了瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的纤维素酶产生能力得到显
著的提高。
SEQUENCELISTING
<110>南京林业大学
<120>一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其构建方法和应用
<130>100
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<210>1
<211>1035
<212>DNA
<213>CeriporiosissubvermisporaB
<400>1
atggcacccctcacgaatggtgcgaatggcgaggtccagaagactggcgagcagagctca60
aagctgcactcgaaagtggtcattatcggctctggaccagcaggacataccgctgctatc120
taccttgcacgtgcaaacctgaaccccgtcctcttcgagggtttcatggcgaacggcttc180
gctgccggtggacaactgacgaccaccaccgagattgagaacttcccgggtttcccctcc240
ggcatccttggccccgagctcatggaccgattccgcgcacaatctctgcgattcggcact300
gacattatcaccgagaccatctcgaaggttgatctctcccagcggccattccgctactgg360
cgcgaaggtcaggagacggaagagcccgagaccgcggacacccttatcattgcgactgga420
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aatcaccccaaggtcaccatcctctggaacaccgtcgcggtcgagtgccagggcgacgga720
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<210>2
<211>344
<212>PRT
<213>CeriporiosissubvermisporaB
<400>2
MetAlaProLeuThrAsnGlyAlaAsnGlyGluValGlnLysThrGly
151015
GluGlnSerSerLysLeuHisSerLysValValIleIleGlySerGly
202530
ProAlaGlyHisThrAlaAlaIleTyrLeuAlaArgAlaAsnLeuAsn
354045
ProValLeuPheGluGlyPheMetAlaAsnGlyPheAlaAlaGlyGly
505560
GlnLeuThrThrThrThrGluIleGluAsnPheProGlyPheProSer
65707580
GlyIleLeuGlyProGluLeuMetAspArgPheArgAlaGlnSerLeu
859095
ArgPheGlyThrAspIleIleThrGluThrIleSerLysValAspLeu
100105110
SerGlnArgProPheArgTyrTrpArgGluGlyGlnGluThrGluGlu
115120125
ProGluThrAlaAspThrLeuIleIleAlaThrGlyAlaSerAlaLys
130135140
ArgLeuGlyLeuLysGlyGluGluAlaTyrTrpGlnSerGlyIleSer
0
AlaCysAlaValCysAspGlyAlaValProIlePheArgAsnLysPro
165170175
LeuAlaValIleGlyGlyGlyAspSerAlaAlaGluGluAlaThrTyr
180185190
LeuThrLysTyrGlySerHisValTyrValLeuValArgArgGlyGlu
195200205
LeuArgAlaSerLysIleMetAlaLysArgLeuMetAsnHisProLys
210215220
ValThrIleLeuTrpAsnThrValAlaValGluCysGlnGlyAspGly
225230235240
AspLeuLeuAsnAsnLeuArgIleLysAsnValLeuThrGlyGluGlu
245250255
GlnAspLeuGlnValAsnGlyLeuPheTyrAlaValGlyHisGluPro
260265270
AlaThrGlyLeuValArgGlyGlnLeuGlnThrAspThrAspGlyTyr
275280285
IleIleThrValProGlyThrThrGlnThrSerValLysGlyValPhe
290295300
AlaAlaGlyAspValGlnAspLysArgTyrArgGlnAlaIleThrSer
3
AlaGlySerGlyCysMetAlaAlaLeuGluAlaGluArgLeuIleSer
325330335
GluGluGluGluGlyIleGluAsp
340
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_f1
<400>3
gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg33
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_r1
<400>4
cgaagcttatcttcgataccctcttcctc29
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_f2
<400>5
catgtctagaatggcacccctcacgaatg29
<210>6
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_r2
<400>6
ctttcgcacggagctctcgagctagtggtggtggtggtggtgctc45
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Pcbh1_f
<400>7
agtgaattcgagctcggtaccgatagcagtgtctagtagca41
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Pcbh1_r
<400>8
tgaggggtgccattctagacatgatgccagtccgcggttg40
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Tcbh1_f
<400>9
gactcgagagctccgtgcgaaagcctgacgca32
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Tcbh1_r
<400>10
ctgggcccatcgtaaccgagaatccagagctg32
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<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_f1
<400>11
gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg33
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_r1
<400>12
cgaagcttatcttcgataccctcttcctc29
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>hph_f
<400>13
aagttcgacagcgtctcc18
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>hph_r
<400>14
ttccactatcggcgagta18
2024年6月15日发(作者：褒籁)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.6
(22)申请日 2016.03.24
(71)申请人 南京林业大学
地址 210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路159号
(72)发明人 龙良鲲 丁少军 丁达繁 徐梅娟
(74)专利代理机构 南京申云知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人 邱兴天
(51)
C12N1/15
C12N15/80
C12N9/42
C12R1/885
(10)申请公布号 CN 105647821 A
(43)申请公布日 2016.06.08
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其
构建方法和应用
(57)摘要
本发明公开了一株瑞氏木霉工程菌
CstrxR1及其构建方法和应用。瑞氏木霉工
程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉
Trichoderma？reesei？
CstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏
中心，保藏日期为：2016年3月1日，保
藏编号为CCTCC？NO:？M2016078，保藏
地址为中国湖北武汉武汉大学。本发明的
瑞氏木霉工程菌CstrxR1，其各纤维素酶产
量与瑞氏木霉亲本菌株相比提高0.78倍。
本发明对提高纤维素酶生产效率具有重要
应用价值。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
未缴年费专利权终止IPC(主分
类):C12N 1/15专利
2022-03-11
号:ZL2申请
日:20160324授权公告
日:20181218
法律状态
专利权的终止
权 利 要 求 说 明 书
1.一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉Trichodermareesei
保
CstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年3月1日，
藏编号为CCTCCNO:M2016078，保藏地址为中国湖北武汉武
汉大学。
2.根据权利要求1所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1，其特征在于，在所述的
序
3.构建权利要求2所述瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法，其特征在于：将
基
瑞氏木霉工程菌CstrxR1中克隆有来自于虫拟蜡菌的硫氧还蛋白还原酶基因
列，该基因序列如SEQIDNO.1所示。
序列如SEQIDNO.1所示的DNA片段通过质粒pAg1-CstrxR1导入瑞氏木霉
因组，所述质粒pAg1-CstrxR1是在质粒pAg1-H3的KpnI和
瑞氏木霉纤维二糖水解酶I启动子序列Pcbh1、
A片段和瑞氏木霉纤维二糖水解酶
ApaI位点顺序装入
序列如SEQIDNO.1所示的DN
I终止序列Tcbh1。
4.根据权利要求3所述构建瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法，其特征在于：
5.权利要求1所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1在产纤维素酶中的应用。
所述瑞氏木霉为瑞氏木霉D-86271。
说 明 书
技术领域
本发明属于工程菌技术领域，具体涉及一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其应用。
背景技术
纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖单体的一组酶系的总称，通常包括内切型葡聚
糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶资源对于可持续利用生物质资
源具有重要意义，可广泛应用于生物能源、饲料、洗涤、造纸及植物源活性物质制
备等领域。瑞氏木霉（Trichodermareesei）能够产生完整的纤维素酶系，是
工业生产纤维素酶的重要菌株。当前，传统的诱变育种技术难以继续提升瑞氏木霉
产纤维素酶的能力。借助基因工程手段改良瑞氏木霉的纤维素酶产生能力，成为降
低纤维素酶生产成本的有效途径。
丝状真菌的细胞氧化还原状态能够控制许多重要基因的表达调控。硫氧还蛋白系统
（thioredoxinsystem）是存在于绝大多数生物体中的一类抗氧化系统，具有调控细
胞氧化还原平衡等多种重要功能。硫氧还蛋白从氧化态转化成还原态依赖于硫氧还
蛋白还原酶（thioredoxinreductase，TrxR）的催化作用。因而，TrxR对于胞内的氧
化还原平衡或某些蛋白分子的氧化还原状态具有重要的调控作用。瑞氏木霉细胞中
具有高水平的TrxR会极大的改变其细胞氧化还原状态，进而增强相关蛋白（如纤
维素酶）分子的基因表达。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株瑞氏木霉工程菌
CstrxR1，能高产纤维素酶。本发明的另一目的是提供上述瑞氏木霉工程菌CstrxR1
的构建方法。
技术方案，为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉
TrichodermareeseiCstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：
2016年3月1日，保藏编号为CCTCCNO：M2016078，保藏地址为：中国湖北武
汉武汉大学。
在所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1中克隆有来自于虫拟蜡菌的硫氧还蛋白还原酶基
因序列，该基因序列如SEQIDNO.1所示。
构建所述瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法：将序列如SEQIDNO.1所示的DNA片段
通过质粒pAg1-CstrxR1导入瑞氏木霉基因组，所述质粒pAg1-CstrxR1是在质粒
pAg1-H3的KpnI和ApaI位点顺序装入瑞氏木霉纤维二糖水解酶I启
动子序列Pcbh1、序列如SEQIDNO.1所示的DNA片段和瑞氏木霉纤维二糖水解酶
I终止序列Tcbh1。
所述瑞氏木霉为瑞氏木霉D-86271。
所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1在产纤维素酶中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明成功构建出瑞氏木霉工程菌CstrxR1，通过实
验证明高表达虫拟蜡菌中硫氧还蛋白还原酶编码基因的瑞氏木霉工程菌，其纤维素
酶产量（滤纸酶活）与亲本瑞氏木霉相比提高0.78倍。本发明对工业生产中提高
纤维素酶生产效率具有重要的应用价值。
附图说明
图1是表达质粒pAg1-CstrxR1的图；
图2是基因CstrxR1大肠杆菌重组表达SDS-PAGE电泳检测图；
图3是CstrxR1基因瑞氏木霉转化株的鉴定图；
图4是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株纤维素酶产量的比较图；D-86271为
未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌，CK为含空载体的瑞氏木霉转
化菌株；
图5是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株胞外蛋白的比较结果图；D-86271为
未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌，CK为含空载体的瑞氏木霉转
化菌株；
图6是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株生物量的比较结果图；D-86271为未
转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌；
图7是瑞氏木霉基因工程菌株发酵培养过程中纤维素酶合成基因的相对表达量结果
图；其中，D-86271为未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。下述实施例中所使用的实验方法如
无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，
均可从商业途径得到。
实施例1基因表达载体pAg1-CstrxR1的构建
1、虫拟蜡菌硫氧还蛋白还原酶编码基因CstrxR1的获得及表达
分析虫拟蜡菌（CeriporiosissubvermisporaB）的全基因组序列（GenBank
号:AEOV00000000.1），获得一个候选的硫氧还蛋白还原酶蛋白编码基因
CstrxR1。采用Trizol试剂分离虫拟蜡菌（Ceriporiopsissubvermispora）
FP-105752-Sp（由ForestProductsLaboratory
（CentreforForestMycologyResearch）,Madison,WI,USA提供）的总RNA，并以反
转录试剂盒（TransGen，北京）进行cDNA第一链的合成（oligo（dT）引物），
并作为模板以引物CstrxR_f1（含NdeI识别序列和保护碱基）和CstrxR_r1
（含HindIII识别序列和保护碱基）扩增获得CsTrxR1的cDNA片段。
将获得的cDNA片段克隆到载体pEASY-Blunt（TransGen，北京），并由上海英骏
生物技术公司进行测序分析（Invitrogen,上海），经测序验证正确，其序列如
SEQIDNO.1所示，推测得出对应的蛋白序列如SEQIDNO.2所示。各引物的序列如
下：
CstrxR_f1：5′-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-3′；
CstrxR_r1：5′-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-3′。
对CstrxR1基因的cDNA片段进行NdeI/HindIII双酶切，并连
接入大肠杆菌（）表达载体pET23b（Novagen，Germany）的相应位
点，获得质粒pET-CstrxR1。根据产品操作说明，将pET-CstrxR1转入大肠杆菌表
达菌株（）Rosseta菌株（TransGen，北京），并以异丙基-1-硫代β-D
吡喃型半乳糖（IPTG）进行诱导表达。借助表达的CstrxR1重组蛋白具有C端融
合的组氨酸标签，对其进行His·Bind柱（Novagen，Germany）纯化，并进行SDS-
PAGE电泳检测（如图1所示）。图1显示，获得的重组CstrxR1分子大小与理论
分子量（38.4kD,包括His标签）相符。
2、构建瑞氏木霉基因表达质粒pAg1-CstrxR1
以瑞氏木霉（Trichodermareesei）D-86271（=Rut-C30）（购买于
VTTculturecenter，Finland）基因组DNA为模板，在高保真酶（Fastpfu）作用下，
以引物Tcbh1_f（含XhoI识别序列和保护碱基）/Tcbh1_r（含ApaI识
别序列和保护碱基）扩增获得长1088bp的纤维二糖水解酶I终止序列（Tcbh1），
并将其插入pAg1-H3（Zhang,A.,Lu,P.,Dahl-
Roshak,A.M.,Paress,P.S.,Kennedy,S.,Tkacz,J.S.,An,Z.,entdisruptionofapolyke
tidesynthasegene（pks1）
requiredformelaninsynthesisthroughAgrobacterium-
mediatedtransformationofGlarealozoyensis.MolGenGenomics268,645-
655.）的XhoI/ApaI位点，获得质粒pAg1-Tcbh1。同时，以瑞氏木霉
（Trichodermareesei）D-86271基因组DNA为模板，以引物
Pcbh1_f/Pcbh1_r扩增获得891bp纤维二糖水解酶I启动子序列（Pcbh1）。以质粒
pET-CstrxR1为模板，以引物CstrxR_f2/CstrxR_r2扩增获得CstrxR1基因序列。通
过HieffCloneTMOneStepPcr克隆试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司,上海）将以
上获得的Pcbh1和CstrxR1基因序列同源重组方式克隆到质粒pAg-Tcbh1（经过
KpnI/XhoI双酶切），产生质粒pAg1-CstrxR1。基因表达质粒pAg1-
CstrxR1的物理图谱如图2所示。各引物序列如下：
CstrxR_f2：5′-catgtctagaatggcacccctcacgaatg-3′；
CstrxR_r2：5′-ctttcgcacggagctctcgagctagtggtggtggtggtggtgctc-3′；
Pcbh1_f：5′-agtgaattcgagctcggtaccgatagcagtgtctagtagca-3′；
Pcbh1_r：5′-tgaggggtgccattctagacatgatgccagtccgcggttg-3′；
Tcbh1_f：5′-gactcgagagctccgtgcgaaagcctgacgca-3′；
Tcbh1_r：5′-ctgggcccatcgtaaccgagaatccagagctg-3′。
实施例2构建表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株
1、基因表达质粒pAg1-CstrxR1转化根癌农杆菌
取1μg质粒pAg1-CstrxR1的DNA加入根癌农杆菌
（Agrobacteriumtumefaciens）AGL-1
（Mullins,E.D.,Chen,X.,Romaine,P.,Raina,R.,Geiser,D.M.,Kang,S.,2001.Agrobacteri
um-
mediatedtransformationofFusariumoxysporum:anefficienttoolforinsertionalmutag
enesisandgenetransfer.Phytopathology.91:173-180.）的感受态细胞中混匀，放
入液氮中5分钟。取出，立即在42℃热激2分钟后加入700μLLB液体培养基，28℃
振荡培养2小时。将菌液均匀涂布在含有75μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，28℃
倒置培养2天，得到含有重组质粒pAg1-CstrxR1的根癌农杆菌单菌落。
2、根癌农杆菌介导的遗传转化及菌株的初步抗性筛选
将获得的含有重组质粒pAg1-CstrxR1的根癌农杆菌单菌落接种于5mLMM液体培
养基中，28℃振荡培养2天。用IM培养基将菌体稀释到
OD600=0.15，28℃振荡培养6小时，至
OD600=0.6。取100μL菌液与等体积的瑞氏木霉
（Trichodermareesei）D-86271孢子悬液混合（悬液浓度=2×106
个孢子/mL），均匀涂布在CM琼脂平板（铺有玻璃纸）上，24℃正置共培养3天。
将共培养菌体转接至含有75μg/mL潮霉素B和400μg/mL噻孢霉素钠的PDA琼脂
平板上，28℃倒置培养4-5天至含有潮霉素B抗性基因的转化子长出。
3、PCR筛选表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株
将获得的潮霉素B抗性的转化子接种于Mandels培养基（以1%乳糖作为碳源），
28℃、180rmp振荡培养2天。根据前述方法提取其总DNA和RNA后，分别进行
如下PCR和RT-PCR反应：
PCR（图3A）：根据hph（潮霉素抗性基因）设计引物hph_f/hph_r，目的
产物为0.9kb；RT-PCR（图3B）：根据CstrxR的特异性引物
CstrxR_f1/CstrxR_r1，目的产物为1.032kb；各引物序列如下：
CstrxR_f1：5′-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-3′；
CstrxR_r1：5′-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-3′；
hph_f：5′-aagttcgacagcgtctcc-3′；
hph_r：5′-ttccactatcggcgagta-3′。
同时，以未经转化的瑞氏木霉（Trichodermareesei）D-86271、空载体pAg1-
Tcbh1的瑞氏木霉转化菌株（CK）和无菌水（NC）为对照，PCR扩增产物进行琼
脂糖电泳检测。结果如图3所示。图3A中，以质粒pAg1-CstrxR1和空载体pAg1-
Tcbh1转化的瑞氏木霉的菌株均能获得0.9kb的条带；未转化菌株D-86271和无菌
水（NC）均无扩增条带。图3B中，含质粒pAg1-CstrxR1的瑞氏木霉基因工程菌
可获得1.032kb的目标条带，而未转化菌株D-86271、pAg1-Tcbh1转化菌（CK）
和无菌水（NC）均无扩增条带。
从筛选的9株高表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株中取一株编号为
CstrxR1，2016年3月1日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），分类名称
为瑞氏木霉（Trichodermareesei）CstrxR1，保藏编号为CCTCCNO：
M2016078。
瑞氏木霉CstrxR1在正常培养条件下菌落呈广铺的棉絮状，起初为白色致密的平坦
菌丝，而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区，反面无色；分生孢子梗菌丝的短侧枝，
透明，多分枝；小梗瓶形，中部弯曲，形成大量的分生孢子，分生孢子椭圆形或长
形，单细胞，透明，无色，壁光滑，成堆时绿色；该菌可正常利用葡萄糖、淀粉、
甘油等碳源，及蛋白胨、尿素、硫酸铵等氮源。
实施例3瑞氏木霉基因工程菌株的发酵及纤维素酶的产量测定
取瑞氏木霉基因工程菌株CstrxR1接种于PDA斜面，28℃培养7天，等待产生分
生孢子。取1×108个瑞氏木霉孢子接种于100mLMandels培养基（以1%
葡萄糖作为碳源），28℃，180rpm培养2天。取1mL菌悬液接入固态发酵培养基
中，并于30℃、70%湿度条件下黑暗发酵培养15天。
固态发酵培养基配方：麦杆（粉碎至1-3mm，且脱木素）1.5g，麸皮1.5g，
10×Mandels培养基（同上述，不含碳源）5mL，以上组分装入250-mL三角瓶中，
充分混匀，高压灭菌。麦杆的脱木素方法：按每10g麦杆加入20mL4%NaOH溶液，
混匀后，121℃、20min处理，并以流水去除褐色物质，处理后的麦杆晾干备用。
发酵结束后，按每三角瓶加入30mL无菌水（含0.1%Tween-80），搅拌均匀，并
于28℃、120rpm振荡浸提2h。继续以7000rpm离心20min，将粗酶液转入新的离
心管中，于4℃冰箱保存。
滤纸酶活的测定，以WhatmanNO.1滤纸（3cm×0.5cm）作为底物，50℃反应
60min；内切型纤维素酶（EG）活的测定以1%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）作
为底物，50℃反应30min；最后均以3,5-二硝基水杨酸法DNS的方法
（Miller,G.L.,initrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugar.
AnalChem,31,426-428.）测定还原糖的生成量，通过标准葡萄糖曲线，换算获
得酶活（IU/g基质干重）。β-葡萄糖苷酶的活性测定，以5mM的4-硝基苯基-β-D-
吡喃葡萄糖苷（pNPG）作为底物，50℃反应30min，并根据标准曲线，计算酶活
性（IU/g基质干重）。以上酶活测定均在pH4.8的50mM的柠檬酸缓冲液中进行，
每处理3-4次重复。
滤纸酶或CMC酶单位酶活定义为：该实验条件下，每分钟催化相应底物生成
1μmol葡萄糖的酶量。β-葡萄糖苷酶单位酶活定义为：该实验条件下，每分钟催化
pNPG生成1μmol4-硝基苯酚的酶量。
结果如图4所示，表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产β-
葡萄糖苷酶、CMC酶和滤纸酶活性均显著高于未转化的亲本瑞氏木霉（D-86271）。
发酵13天后，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的β-葡萄糖苷酶、CMC酶和滤纸酶的
产量分别比亲本菌株D-86271增加了0.84、0.48和0.78倍。同时，对照质粒pAg1-
Tcbh1转化菌（CK）各种酶的产量与未转化的瑞氏木霉亲本菌株（D-86271）一致。
实施例4固态发酵瑞氏木霉胞外蛋白的分析
取实施例3中各菌株的发酵液，按一定比例稀释后，以BCA检测试剂盒
（ThermoTech，USA）测定菌株发酵所产胞外蛋白总量。结果如图5所示，在发
酵7到15天，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产胞外蛋白量显著高于未转化的瑞
氏木霉亲本菌株D-86271。在发酵13天后，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产胞
外蛋白量比未转化的瑞氏木霉亲本菌株D-86271增加了1.4倍。
实施例5、固态发酵过程中瑞氏木霉菌体生物量的测算分析
通过测定发酵基质中菌丝体的核酸含量，间接法换算出菌体的生物量。取2g固态
发酵物70℃，烘干12小时，并于液氮中充分研磨至粉状。取0.04g研磨物放入
1.5mL无菌离心管中，并加入1mL5%三氯乙酸后充分混合。混合物于80℃水浴锅
处理30分钟（每5分钟混匀一次），后置于冰上3分钟。10,000g离心10分钟，
上清转入新的离心管中。样品稀释100倍后，测定波长260nm下的吸光值，并根
据标准曲线计算菌体生物量。
标准曲线的制作：以Mandels培养基（以1%葡萄糖作为碳源）培养获得纯的瑞氏
木霉菌丝体，并烘干至恒重。分别取0、2.5、5、10、20、40mg干菌丝按照以上方
法测定其中的核酸含量，并以菌丝干重为纵坐标和核酸含量为横坐标，绘制出标准
曲线。
结果如图6显示：发酵5到15天，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的生物量低于未
转化的瑞氏木霉亲本菌株D-86271。因此，CstrxR1基因的表达并没有增加
瑞氏木霉的菌体生物量。
实施例6瑞氏木霉基因工程菌株中纤维素酶合成相关基因的转录分析
用Trizol试剂分别提取经实施例3发酵培养5天、7天、9天和11天瑞氏木霉基因
工程菌株CstrxR1和瑞氏木霉亲本菌株D-86271的菌体样品总RNA。取1μg的
RNA用TransScript?RT/RIEnzymeMix（引物oligo（dT）和6-mers随机引物）
（Transgene，北京）合成cDNA。以该cDNA为模板，用引物Qcel1a_f/Qcel1a_r、
QeglI_f/QeglI_r和Qcbh1_f/Qcbh1_r分别对β-葡萄糖苷酶合成基因cel1a
（Genbank号：XM_006963374）、内切型纤维素酶合成基因eglI（Genbank
号：XM_006965612）和纤维二糖水解酶合成基因cbh1（Genbank号：
XM_006969162）进行实时定量PCR（ABIStepOnePlus,USA）。反应程序：94℃预
变性30s；94℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸10s（40个热循环）。设置不添
加反转录产物的阴性对照。同时，以β-actin基因表达为内参，Pfaffl’s方法计算目
标基因的相对转录水平（即相对表达量），结果如图7所示。所用引物的序列如下：
Qcbh1_f：5′-cttggcaacgagttctctt-3′；
Qcbh1_r：5′-tgttggtgggatacttgct-3′；
Qcel1a_f：5′-cgtgctcttcaccaacaa-3′；
Qcel1a_r：5′-tcttgctgatccacacca-3′；
QeglI_f：5′-cttctgctgcaacgagatgg-3′；
QeglI_r：5′-tcttggaggtgtcaacggtat-3′；
Qactin_f：5′-tccatcatgaagtgcgac-3′；
Qactin_r：5′-gtagaaggagcaagagcagtg-3′。
其中引物Qcbh1_f、Qcbh1_r、Qcel1a_f、Qcel1a_r、Qactin_f及Qactin_r源自文献
Xu,J.T.,Zhao,G.L.,Kou,Y.B.,Zhang,W.X.,Zhou,Q.X.,Chen,G.J.,Liu,W.F.,ellul
arbeta-
glucosidasesCEL1aandCEL1bareessentialforcellulaseinductiononlactoseinTrichoder
mareesei.EukaryoticCell,13（8）:1001-1013。
结果表明：纤维素酶合成基因cel1a、egl1和cbh1在瑞氏木霉
基因工程菌（CstrxR1）中的表达水平显著高于未转化的亲本瑞氏木霉菌株D-
86271，这进一步证明了瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的纤维素酶产生能力得到显
著的提高。
SEQUENCELISTING
<110>南京林业大学
<120>一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其构建方法和应用
<130>100
<160>14
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1035
<212>DNA
<213>CeriporiosissubvermisporaB
<400>1
atggcacccctcacgaatggtgcgaatggcgaggtccagaagactggcgagcagagctca60
aagctgcactcgaaagtggtcattatcggctctggaccagcaggacataccgctgctatc120
taccttgcacgtgcaaacctgaaccccgtcctcttcgagggtttcatggcgaacggcttc180
gctgccggtggacaactgacgaccaccaccgagattgagaacttcccgggtttcccctcc240
ggcatccttggccccgagctcatggaccgattccgcgcacaatctctgcgattcggcact300
gacattatcaccgagaccatctcgaaggttgatctctcccagcggccattccgctactgg360
cgcgaaggtcaggagacggaagagcccgagaccgcggacacccttatcattgcgactgga420
gccagcgcgaagcggctgggtctcaagggcgaggaggcgtactggcagagcggcatctcc480
gcgtgcgcagtctgcgacggtgccgtccccatcttcaggaacaagccgcttgctgtgatt540
ggtggcggtgactcggcggcggaggaagcaacctacctgacaaagtacggttcgcacgtc600
tacgtgctcgtgcgccgcggcgagctccgtgcgtcgaagatcatggcgaagcggctcatg660
aatcaccccaaggtcaccatcctctggaacaccgtcgcggtcgagtgccagggcgacgga720
gacctcctgaacaacctccgcatcaagaacgtgctcaccggcgaggaacaggacctccag780
gtgaacggcctgttctacgccgttggtcacgagcccgcgaccggcctcgtccgcggccag840
ctgcagacagacaccgatggctacatcatcaccgtccctggcacgacccagacgagcgtc900
aagggtgtcttcgcggcaggtgacgtgcaggacaagaggtaccgtcaggcgatcaccagt960
gcgggcagcggctgcatggctgccctagaggccgagcgtctgatctccgaagaggaagag1020
ggtatcgaagattag1035
<210>2
<211>344
<212>PRT
<213>CeriporiosissubvermisporaB
<400>2
MetAlaProLeuThrAsnGlyAlaAsnGlyGluValGlnLysThrGly
151015
GluGlnSerSerLysLeuHisSerLysValValIleIleGlySerGly
202530
ProAlaGlyHisThrAlaAlaIleTyrLeuAlaArgAlaAsnLeuAsn
354045
ProValLeuPheGluGlyPheMetAlaAsnGlyPheAlaAlaGlyGly
505560
GlnLeuThrThrThrThrGluIleGluAsnPheProGlyPheProSer
65707580
GlyIleLeuGlyProGluLeuMetAspArgPheArgAlaGlnSerLeu
859095
ArgPheGlyThrAspIleIleThrGluThrIleSerLysValAspLeu
100105110
SerGlnArgProPheArgTyrTrpArgGluGlyGlnGluThrGluGlu
115120125
ProGluThrAlaAspThrLeuIleIleAlaThrGlyAlaSerAlaLys
130135140
ArgLeuGlyLeuLysGlyGluGluAlaTyrTrpGlnSerGlyIleSer
0
AlaCysAlaValCysAspGlyAlaValProIlePheArgAsnLysPro
165170175
LeuAlaValIleGlyGlyGlyAspSerAlaAlaGluGluAlaThrTyr
180185190
LeuThrLysTyrGlySerHisValTyrValLeuValArgArgGlyGlu
195200205
LeuArgAlaSerLysIleMetAlaLysArgLeuMetAsnHisProLys
210215220
ValThrIleLeuTrpAsnThrValAlaValGluCysGlnGlyAspGly
225230235240
AspLeuLeuAsnAsnLeuArgIleLysAsnValLeuThrGlyGluGlu
245250255
GlnAspLeuGlnValAsnGlyLeuPheTyrAlaValGlyHisGluPro
260265270
AlaThrGlyLeuValArgGlyGlnLeuGlnThrAspThrAspGlyTyr
275280285
IleIleThrValProGlyThrThrGlnThrSerValLysGlyValPhe
290295300
AlaAlaGlyAspValGlnAspLysArgTyrArgGlnAlaIleThrSer
3
AlaGlySerGlyCysMetAlaAlaLeuGluAlaGluArgLeuIleSer
325330335
GluGluGluGluGlyIleGluAsp
340
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_f1
<400>3
gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg33
<210>4
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_r1
<400>4
cgaagcttatcttcgataccctcttcctc29
<210>5
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_f2
<400>5
catgtctagaatggcacccctcacgaatg29
<210>6
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CstrxR_r2
<400>6
ctttcgcacggagctctcgagctagtggtggtggtggtggtgctc45
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Pcbh1_f
<400>7
agtgaattcgagctcggtaccgatagcagtgtctagtagca41
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<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Pcbh1_r
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ttccactatcggcgagta18