2024年9月18日发(作者：迟欣然)
中国人兽共患病学报
２０１２，２８（２）
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ １３５
文章编号：１００２—２６９４（２０１２）０２—０１３５—０４
梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因分析及
实时荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立术
王 莹 ，丁肖青 ，朱 胜 ，楼宏强。
摘 要：目的 确定不同梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因序列的差异性及其跨膜结构，建立基于ＴｐＮ４７基因检测梅毒螺旋体的
荧光定量ＰＣＲ方法。方法 通过使用ＮＣＢＩ／Ｂｌａｓｔ，Ｐｆａｍ，ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０等网络资源分析梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因
编码蛋白的保守功能结构域和跨膜区域。根据参考序列设计引物，采用ＰＣＲ技术从梅毒螺旋体基因组ＤＮＡ中扩增ＴｐＮ４７
基因，将其连接入克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ进行测序，并用ＤＮＡＳＴＡＲ软件比较不同梅毒螺旋体菌株ＴｐＮ４７基因的核苷酸序列。
根据梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因保守区域设计引物，建立基于该目的基因的荧光定量分析ＰＣＲ检测方法并分析其灵敏度、特异
性和稳定性。同时，采用基于ＴｐＮ４７基因的荧光定量ＰＣＲ对梅毒螺旋体感染患者血液样本进行检测。结果 研究表明，梅
毒螺旋体ＴｐＮ４７基因为梅毒螺旋体外膜蛋白编码基因，其产物定位于外膜表面。不同梅毒螺旋体菌株中ＴｐＮ４７基因的核苷
酸序列保守，相似度达９９ 以上。基于ＴｐＮ４７基因的荧光定量ＰＣＲ方法可有效地检测梅毒螺旋体感染患者血清及泌尿道
分泌物样本中的梅毒螺旋体。结论ＴｐＮ４７基因为梅毒螺旋体外膜蛋白编码基因，建立的基于ＴｐＮ４７基因的荧光定量ＰＣＲ
方法具有快速、敏感、稳定等优点，适用于梅毒螺旋体临床实验室诊断。
关键词：梅毒螺旋体；ＴｐＮ４７基因；荧光定量ＰＣＲ
中图分类号：Ｒ３７７文献标识码：Ａ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ
ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ－－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ ，ＤＩＮＧ Ｘｉａｏ—ｑｉｎｇ ，ＺＨＵ Ｓｈｅｎｇ ，ＬＯＵ Ｈｏｎｇ—ｑｉａｎｇ
（１．Ｙｉｗｕ ｊ ｅｒ 口￡ ０ ⅡＺ Ｔｒａｖｅｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ＹｉＷＵ ３２２０００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｉｓ，Ｊｉｎｈｕａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｎｈｕａ ３２１００７，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ
（ＴｐＮ４７），ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｎ—ｌｉｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ＮＣＢＩ，Ｐｆａｍ ａｎｄ ＴＭ—
ＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０．Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｗｏｒｋｅｄ ｏｕｔ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴｐＮ４７．Ｔｈｅ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ ＤＮＡ ｏｆ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｂｙ ＰＣＲ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１８一Ｔ．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＤＮＡＳ—
ＴＡＲ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｑｕｉｃｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｐｅｏｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｔ．
ｐａｌｌｉｄｕｍ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＴｐＮ４７ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｏｕｔｓｉｄｅ ｏｆ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉ—
ｔｉｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｂｏｖｅ ９９ ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｒｅａｌ—
ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ａｌｌ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｅｏｐｌｅ．
Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ丁．ｐａｌｌｉｄｕｍ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｏｎ ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉ—
ｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ａｎｄ ｉｔｓ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｑｕｉｃｋｎｅｓｓ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．
ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ；ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑＰＣＲ
梅毒螺旋体（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ，Ｔｐ）是弓 起人类梅毒的病原体 ，自上个世纪８Ｏ年代以来，
＊义乌市科研项目（Ｎｏ．１０—３—０８）资助
梅毒在我国再次复燃，据中国预防医学科学院统计，
通讯作者：楼宏强，Ｅｍａｉｌ：ｙｘｙｊｗｋ＠１６３．ｃｏｒｌｆ
近１０年来梅毒年平均增长率为５３ ，在被监测的８
作者单位：１．义乌国际旅行卫生保健中心，义乌 ３２２０００；
种性传播疾病中增长速度最快 。因此，梅毒在我
２．金华职业技术学院人畜共患病研究所，金华 ３２１０００７
国已成为一个严峻的公共卫生问题。
１３６ 中国人兽共患病学报
由于梅毒传染性强且危害性大，因此，对梅毒螺
旋体进行快速、准确的早期诊断具有十分重要的临
床意义［３ ］。目前梅毒螺旋体仍不能进行体外人工
培养，因而实验室检测梅毒抗体和抗原是诊断梅毒
的重要依据。人体感染梅毒螺旋体后，梅毒螺旋体
可刺激机体产生特异性抗体与非特异性抗体，目前
用于梅毒实验室检测的方法主要包括梅毒螺旋体特
异性试验和梅毒螺旋体非特异性试验Ｌ６ 。抗原检
测方法包括暗视野显微镜和直接免疫荧光抗体染色
（ＤＦＡ－ＴＰ）等。但是，以上方法仍存在诸多不足，如检
测的灵敏度、特异性不高，易出现假阳性结果等，还不
能很好的满足梅毒感染前期的有效检测诊断。
ＴｐＮ４７等主要外膜蛋白抗原是梅毒螺旋体侵
入机体诱导产生特异性抗体的主要抗原。已有研究
表明，ＴｐＮ４７外膜蛋白能与Ｉ、Ⅱ期梅毒患者血清发
生强烈反应，晚期梅毒也可检测到高效价的对应抗
体。因此该目的蛋白和相应抗体的检测是梅毒螺旋
体感染的重要鉴定手段。荧光定量ＰＣＲ法是目前
最先进的检验技术之一，能直接检测基因组ＤＮＡ
上的靶基因，此方法敏感特异、稳定。但是，基于该
目的片段的荧光定量ＰＣＲ检测方法至今未有建立。
研究开发基于该目的基因的荧光定量ＰＣＲ方法对
于梅毒螺旋体进行检测具有重要的现实意义。
１材料与方法
１．１ 材料梅毒螺旋体感染阳性患者泌尿道渗出
液、血清及大肠杆菌ＪＭ １０９样本由义乌国际旅行
卫生保健中心采集、保存；细菌ＤＮＡ提取试剂盒
（ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
Ｖｅｒ．２．０），ＰＣＲ系列试剂盒，Ｔ—Ａ克隆试剂盒，限
制性内切酶Ｎｄｅ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ，ｐＭＤ１８－Ｔ质粒，均购自
ＴａＫａＲａ公司。
１．２ ＴｐＮ４７基因序列及其蛋白结构分析将梅毒
螺旋体Ｎｉｃｈｏｌｓ株、Ｃｈｉｃａｇｏ株和ＳＳ１４株的ＴｐＮ４７
蛋白序列输入ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ数据库，进行结构域功能
预测，并采用ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０预测该蛋白
在细胞膜上的定位情况。
１．３基因组ＤＮＡ的提取及ＴｐＮ４７基因扩增 采
用细菌ＤＮＡ提取试剂盒提取梅毒螺旋体基因组
ＤＮＡ，根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＴｐＮ４７基因序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．：ＡＥ０ＯＯ５２０．１）进行图谱分析，设计用于扩增
ＴｐＮ４７基因并含合适内切酶位点的引物，ＴｐＮ４７
基因引物序列为：上游５，－ＧＣＧＣＡＴＡＴＧ（Ｎｄｅ Ｉ）
ＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡＣ一３ ，下游５ ｒ＿ＧＣＧＣＴＣＧＡＧ
（Ｘｈｏ Ｉ）ＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＣ一３ 。委托上海
Ｉｎｖｉｔｒ０ｇｅｎ公司合成。采用ＰＣＲ试剂盒扩增全长
ＴｐＮ４７基因片段，反应总体积为１００ ＦＬ，其中各引
物浓度为２５０ ｎｍｏｌ／Ｌ，ＤＮＡ模板ｉ００ ｎｇ。ＰＣＲ参
数：９４℃５ ｍｉｎ；９４℃３０ Ｓ、５０℃３０ Ｓ、７２℃１．０ ｍｉｎ，
３Ｏ个循环；７２℃１０ ｍｉｎ。用溴乙锭预染色的１．５ Ａ０
琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物，预期扩增目的片段
大小为１ ３２３ ｂｐ。
１．４ 目的基因克隆和测序 采用Ｔ—Ａ克隆试剂盒
将ＴｐＮ４７基因扩增产物克隆人ＰＭＤ一１８一Ｔ，再转化
至Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０９中扩增，利用质粒提取试剂盒提
取重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ—ＴｐＮ４７，经Ｘｈｏ ｌ和Ｎｄｅ Ｉ
双酶切初步鉴定后进行琼脂糖凝胶电泳分离，采用
琼脂糖凝胶纯化试剂盒（ＢｉｏＣｏｌｏｒ）回收目的片段，
委托上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测定插入片段的核苷酸序
列，然后与ＴｐＮ４７基因参考序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：
ＡＥ０００５２０．１）进行比对。
１．５实时荧光定量ＰＣＲ根据本研究中所检测的
梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ
软件，设计荧光定量ＰＣＲ扩增ＴｐＮ４７基因片段引
物。ＴｐＮ４７基因引物为：５Ｌ ＡＧＴＡＡＣＧＣＴＴ—
ＧＧＧＴＣＡＧＴＣＴＣＧ 一３ 。 ５ 一 ＣＧＴＴＣＣＧＴＣＡＧ—
ＣＡＡＴＴＴＣＡＧＴＡ一３ 。扩增产物大小为１２２ ｂｐ。
采用ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ 荧光定量ＰＣＲ试剂盒
进行不同样本检测。反应体积为５０ Ｌ，内含１Ｏ
ｍｏｌ／Ｉ 各弓ｌ物、１×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ—Ｔａｑ ＭＩＩ、１×
ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ＩＩ、模板４ＦＬ。利用ＡＢＩ７５０Ｏ
Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ仪进行扩增，反应参数：９５℃１０ Ｓ、
９５℃５ Ｓ、６０℃３４ Ｓ，４０个循环。
１．６基于ＴｐＮ４７基因荧光定量ＰＣＲ灵敏度、特异
性和重复性检测 利用核酸检测仪所制备的重组质
粒ｐＭＤ１８一Ｔ—ＴｐＮ４７浓度，再制成１０倍梯度稀释的
标准品，线性范围为１Ｏ ～１０ 。在最佳检测条件下，
以不同浓度的重组质粒为模板，进行荧光定量ＰＣＲ
检测，以了解其灵敏度。同时提取大肠杆菌、表皮葡
萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌基
因组ＤＮＡ，进行荧光定量ＰＣＲ扩增，以分析该方法
的特异性，每次实验重复３次。
１．７样本检测 对本中心收集的２Ｏ份样本，采用
本研究建立的基于梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因荧光定
量ＰＣＲ方法进行检测，同时，以重组质粒ｐＭＤ１８一
Ｔ—ＴｐＮ４７为阳性对照。
２ 结 果
２．１ 梅毒螺旋体ＴｐＮ４７蛋白保守功能结构域及跨
2
期
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2024年9月18日发(作者：迟欣然)
中国人兽共患病学报
２０１２，２８（２）
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ １３５
文章编号：１００２—２６９４（２０１２）０２—０１３５—０４
梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因分析及
实时荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立术
王 莹 ，丁肖青 ，朱 胜 ，楼宏强。
摘 要：目的 确定不同梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因序列的差异性及其跨膜结构，建立基于ＴｐＮ４７基因检测梅毒螺旋体的
荧光定量ＰＣＲ方法。方法 通过使用ＮＣＢＩ／Ｂｌａｓｔ，Ｐｆａｍ，ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０等网络资源分析梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因
编码蛋白的保守功能结构域和跨膜区域。根据参考序列设计引物，采用ＰＣＲ技术从梅毒螺旋体基因组ＤＮＡ中扩增ＴｐＮ４７
基因，将其连接入克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ进行测序，并用ＤＮＡＳＴＡＲ软件比较不同梅毒螺旋体菌株ＴｐＮ４７基因的核苷酸序列。
根据梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因保守区域设计引物，建立基于该目的基因的荧光定量分析ＰＣＲ检测方法并分析其灵敏度、特异
性和稳定性。同时，采用基于ＴｐＮ４７基因的荧光定量ＰＣＲ对梅毒螺旋体感染患者血液样本进行检测。结果 研究表明，梅
毒螺旋体ＴｐＮ４７基因为梅毒螺旋体外膜蛋白编码基因，其产物定位于外膜表面。不同梅毒螺旋体菌株中ＴｐＮ４７基因的核苷
酸序列保守，相似度达９９ 以上。基于ＴｐＮ４７基因的荧光定量ＰＣＲ方法可有效地检测梅毒螺旋体感染患者血清及泌尿道
分泌物样本中的梅毒螺旋体。结论ＴｐＮ４７基因为梅毒螺旋体外膜蛋白编码基因，建立的基于ＴｐＮ４７基因的荧光定量ＰＣＲ
方法具有快速、敏感、稳定等优点，适用于梅毒螺旋体临床实验室诊断。
关键词：梅毒螺旋体；ＴｐＮ４７基因；荧光定量ＰＣＲ
中图分类号：Ｒ３７７文献标识码：Ａ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ
ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ－－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ ，ＤＩＮＧ Ｘｉａｏ—ｑｉｎｇ ，ＺＨＵ Ｓｈｅｎｇ ，ＬＯＵ Ｈｏｎｇ—ｑｉａｎｇ
（１．Ｙｉｗｕ ｊ ｅｒ 口￡ ０ ⅡＺ Ｔｒａｖｅｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ＹｉＷＵ ３２２０００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｉｓ，Ｊｉｎｈｕａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｏｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｎｈｕａ ３２１００７，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ
（ＴｐＮ４７），ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｎ—ｌｉｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ＮＣＢＩ，Ｐｆａｍ ａｎｄ ＴＭ—
ＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０．Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｗｏｒｋｅｄ ｏｕｔ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴｐＮ４７．Ｔｈｅ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ ＤＮＡ ｏｆ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｂｙ ＰＣＲ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１８一Ｔ．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＤＮＡＳ—
ＴＡＲ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｑｕｉｃｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｐｅｏｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｔ．
ｐａｌｌｉｄｕｍ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＴｐＮ４７ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｏｕｔｓｉｄｅ ｏｆ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉ—
ｔｉｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｂｏｖｅ ９９ ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｒｅａｌ—
ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ａｌｌ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｅｏｐｌｅ．
Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ丁．ｐａｌｌｉｄｕｍ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｏｎ ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉ—
ｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ａｎｄ ｉｔｓ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｑｕｉｃｋｎｅｓｓ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．
ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ；ＴｐＮ４７ ｇｅｎｅ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑＰＣＲ
梅毒螺旋体（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ，Ｔｐ）是弓 起人类梅毒的病原体 ，自上个世纪８Ｏ年代以来，
＊义乌市科研项目（Ｎｏ．１０—３—０８）资助
梅毒在我国再次复燃，据中国预防医学科学院统计，
通讯作者：楼宏强，Ｅｍａｉｌ：ｙｘｙｊｗｋ＠１６３．ｃｏｒｌｆ
近１０年来梅毒年平均增长率为５３ ，在被监测的８
作者单位：１．义乌国际旅行卫生保健中心，义乌 ３２２０００；
种性传播疾病中增长速度最快 。因此，梅毒在我
２．金华职业技术学院人畜共患病研究所，金华 ３２１０００７
国已成为一个严峻的公共卫生问题。
１３６ 中国人兽共患病学报
由于梅毒传染性强且危害性大，因此，对梅毒螺
旋体进行快速、准确的早期诊断具有十分重要的临
床意义［３ ］。目前梅毒螺旋体仍不能进行体外人工
培养，因而实验室检测梅毒抗体和抗原是诊断梅毒
的重要依据。人体感染梅毒螺旋体后，梅毒螺旋体
可刺激机体产生特异性抗体与非特异性抗体，目前
用于梅毒实验室检测的方法主要包括梅毒螺旋体特
异性试验和梅毒螺旋体非特异性试验Ｌ６ 。抗原检
测方法包括暗视野显微镜和直接免疫荧光抗体染色
（ＤＦＡ－ＴＰ）等。但是，以上方法仍存在诸多不足，如检
测的灵敏度、特异性不高，易出现假阳性结果等，还不
能很好的满足梅毒感染前期的有效检测诊断。
ＴｐＮ４７等主要外膜蛋白抗原是梅毒螺旋体侵
入机体诱导产生特异性抗体的主要抗原。已有研究
表明，ＴｐＮ４７外膜蛋白能与Ｉ、Ⅱ期梅毒患者血清发
生强烈反应，晚期梅毒也可检测到高效价的对应抗
体。因此该目的蛋白和相应抗体的检测是梅毒螺旋
体感染的重要鉴定手段。荧光定量ＰＣＲ法是目前
最先进的检验技术之一，能直接检测基因组ＤＮＡ
上的靶基因，此方法敏感特异、稳定。但是，基于该
目的片段的荧光定量ＰＣＲ检测方法至今未有建立。
研究开发基于该目的基因的荧光定量ＰＣＲ方法对
于梅毒螺旋体进行检测具有重要的现实意义。
１材料与方法
１．１ 材料梅毒螺旋体感染阳性患者泌尿道渗出
液、血清及大肠杆菌ＪＭ １０９样本由义乌国际旅行
卫生保健中心采集、保存；细菌ＤＮＡ提取试剂盒
（ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
Ｖｅｒ．２．０），ＰＣＲ系列试剂盒，Ｔ—Ａ克隆试剂盒，限
制性内切酶Ｎｄｅ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ，ｐＭＤ１８－Ｔ质粒，均购自
ＴａＫａＲａ公司。
１．２ ＴｐＮ４７基因序列及其蛋白结构分析将梅毒
螺旋体Ｎｉｃｈｏｌｓ株、Ｃｈｉｃａｇｏ株和ＳＳ１４株的ＴｐＮ４７
蛋白序列输入ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ数据库，进行结构域功能
预测，并采用ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０预测该蛋白
在细胞膜上的定位情况。
１．３基因组ＤＮＡ的提取及ＴｐＮ４７基因扩增 采
用细菌ＤＮＡ提取试剂盒提取梅毒螺旋体基因组
ＤＮＡ，根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＴｐＮ４７基因序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．：ＡＥ０ＯＯ５２０．１）进行图谱分析，设计用于扩增
ＴｐＮ４７基因并含合适内切酶位点的引物，ＴｐＮ４７
基因引物序列为：上游５，－ＧＣＧＣＡＴＡＴＧ（Ｎｄｅ Ｉ）
ＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡＣ一３ ，下游５ ｒ＿ＧＣＧＣＴＣＧＡＧ
（Ｘｈｏ Ｉ）ＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＣ一３ 。委托上海
Ｉｎｖｉｔｒ０ｇｅｎ公司合成。采用ＰＣＲ试剂盒扩增全长
ＴｐＮ４７基因片段，反应总体积为１００ ＦＬ，其中各引
物浓度为２５０ ｎｍｏｌ／Ｌ，ＤＮＡ模板ｉ００ ｎｇ。ＰＣＲ参
数：９４℃５ ｍｉｎ；９４℃３０ Ｓ、５０℃３０ Ｓ、７２℃１．０ ｍｉｎ，
３Ｏ个循环；７２℃１０ ｍｉｎ。用溴乙锭预染色的１．５ Ａ０
琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物，预期扩增目的片段
大小为１ ３２３ ｂｐ。
１．４ 目的基因克隆和测序 采用Ｔ—Ａ克隆试剂盒
将ＴｐＮ４７基因扩增产物克隆人ＰＭＤ一１８一Ｔ，再转化
至Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０９中扩增，利用质粒提取试剂盒提
取重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ—ＴｐＮ４７，经Ｘｈｏ ｌ和Ｎｄｅ Ｉ
双酶切初步鉴定后进行琼脂糖凝胶电泳分离，采用
琼脂糖凝胶纯化试剂盒（ＢｉｏＣｏｌｏｒ）回收目的片段，
委托上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测定插入片段的核苷酸序
列，然后与ＴｐＮ４７基因参考序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：
ＡＥ０００５２０．１）进行比对。
１．５实时荧光定量ＰＣＲ根据本研究中所检测的
梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ
软件，设计荧光定量ＰＣＲ扩增ＴｐＮ４７基因片段引
物。ＴｐＮ４７基因引物为：５Ｌ ＡＧＴＡＡＣＧＣＴＴ—
ＧＧＧＴＣＡＧＴＣＴＣＧ 一３ 。 ５ 一 ＣＧＴＴＣＣＧＴＣＡＧ—
ＣＡＡＴＴＴＣＡＧＴＡ一３ 。扩增产物大小为１２２ ｂｐ。
采用ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ 荧光定量ＰＣＲ试剂盒
进行不同样本检测。反应体积为５０ Ｌ，内含１Ｏ
ｍｏｌ／Ｉ 各弓ｌ物、１×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ—Ｔａｑ ＭＩＩ、１×
ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ＩＩ、模板４ＦＬ。利用ＡＢＩ７５０Ｏ
Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ仪进行扩增，反应参数：９５℃１０ Ｓ、
９５℃５ Ｓ、６０℃３４ Ｓ，４０个循环。
１．６基于ＴｐＮ４７基因荧光定量ＰＣＲ灵敏度、特异
性和重复性检测 利用核酸检测仪所制备的重组质
粒ｐＭＤ１８一Ｔ—ＴｐＮ４７浓度，再制成１０倍梯度稀释的
标准品，线性范围为１Ｏ ～１０ 。在最佳检测条件下，
以不同浓度的重组质粒为模板，进行荧光定量ＰＣＲ
检测，以了解其灵敏度。同时提取大肠杆菌、表皮葡
萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌基
因组ＤＮＡ，进行荧光定量ＰＣＲ扩增，以分析该方法
的特异性，每次实验重复３次。
１．７样本检测 对本中心收集的２Ｏ份样本，采用
本研究建立的基于梅毒螺旋体ＴｐＮ４７基因荧光定
量ＰＣＲ方法进行检测，同时，以重组质粒ｐＭＤ１８一
Ｔ—ＴｐＮ４７为阳性对照。
２ 结 果
２．１ 梅毒螺旋体ＴｐＮ４７蛋白保守功能结构域及跨
2
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莹
等
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