2024年6月14日发(作者：以静柏)
匀
20％在40到50nm之间(均值＝43.61nm)，4％在50和60nm之间
(均值＝55.69nm)。所有颗粒中仅20％直径小于30nm(均值＝26.35
nm)。电子显微镜照片(图11B)显示HCV颗粒以相对规则的光滑表
面为特征。图11B a和b组，例示了HCV有包膜的颗粒的大小不均
性。图11B c组显示直径50nm的颗粒，d组显示那些颗粒直
在35nm的颗粒表面上出现相当同质的更高密度(图
在50nm直径的颗粒中央可清楚地观察到更低密度的更
c组)。当使用无关的第一单克隆抗体时，通过
(图11B，e组)。对蔗糖梯度峰1和2的
及通过IEM进行分析(图12A-
绝大多数(85.4％)是
径35nm。
11B，d组)，而
亮区(图11B，
IEM没有观察到颗粒
颗粒进行免疫沉淀、染色以
12B)。如在图12A中所示，峰1中的
直径约20nm的球形颗粒(41个颗粒中有35
14.6％的颗粒直径大于30nm，可能对应
材料大小更不均匀(图12B)。然
(77.5％)的平均直径约41nm(89个颗粒
可能对应于整个HCV病毒体的直径。
30nm直径的颗粒(13.5％)，可能
快沉降峰(峰2)主要由35
慢沉降峰(峰1)主
研究表明两种
个，平均值＝20.6nm)。仅
于与峰2的重叠。峰2似乎比峰1
而，在这群中最普遍的形式
中有69个，均值＝41.15nm)，其
在这种制剂中可见到一些较小的
由于与峰1的重叠所致。异质的主要的较
和50nm直径的大颗粒组成，而同质的次要的较
要由大约20nm直径的小颗粒组成。总的说来，形态学
大小类别的E1E2包被的HCV颗粒共同存在于感染患
间接免疫金标记(图13)，所有球形有包膜的颗
定，都特异性固定10nm金标记的二抗。
者的血清中。通过
粒，先前通过IEM鉴
因此，通过用MAb D32.10的免疫-电子显微镜术，测定总的有包
(富集HCV的沉淀)以及每种E1E2群各自的相对较好限定的颗
有包膜的HCV颗粒大小上不均匀，但是可容易地鉴定两
膜的群
粒大小分布。
个不同大小类别的颗粒。多数种类由直径从35nm到50nm变化的大
颗粒构成，可能视包膜的晶格结构而定，对应于完整的含有衣壳的有
包膜颗粒。另一种更同质的种类由直径约20nm的小颗粒构成，对应
于无衣壳的SVP。进一步鉴定结合MAb D32.10的所有这些颗粒并使用
用抗小鼠IgG-金颗粒的间接标记，通过电子显微镜术观察。
除了感染性的病毒体外还形成非感染性SVP是黄病毒感染的共同
(Russel等，1980)。已提出这些代表无衣壳的空病毒包膜(Mason
1991)。其也发生在感染乙型肝炎病毒(HBV)的细胞中，以及通
表达包膜蛋白生产分泌的SVP(Laub等，1983)。这些颗粒小于
这证明这些蛋白在存在或缺乏核心时内在地能够自我形成特
这些颗粒装配并经历与整个病毒体相同的成熟过程，
合物加工。用这种重组包膜SVP的免疫显示它们
(Konishi等，1992；Heinz等，1995)和在人中
极好的保护性免疫原。
完整病毒体和SVP与MAb D32.10的反应性显示，E1(297-
494)(613-621)构象表位以基本上相同的方式呈现在
的表面上。然而，在通过基因重组获得并在异种系
细胞(Baumert等，1999)或反转录病毒/293 T细胞
中生产的颗粒上缺乏在血清来源的病毒体和SVP
提示这种复合位点缺乏和/或存在于这些重组
特征
等，
过单独
病毒体。
异性微粒结构。
包括糖基化和碳水化
在动物模型中
(Leroux-Roels等，1994)是
306)-E2(480-
HCV病毒体和SVP
统：棒状病毒/昆虫
(Bartosch等，2003)
上检测到的这种表位，
HCV颗粒表面上分开的难
留在ER中，后者HCV假
值得注意的是MAb D32.10
应。其能够特异性免疫沉淀
白分别或者一起由痘苗病毒
要与二硫键连接的聚集体反
应更微弱。然而，通过印迹
的变性的重组E1或E2蛋
E2和E1E2的排列，其不同
接近的区域上。前者HCV样颗粒(HCV-LP)保
颗粒(HCVpp)中仅有一小部分到达细胞表面。
既不与HSA也不与免疫球蛋白的γ或μ链反
E1、E2以及E1E2异二聚体，当这两种蛋
重组体在HepG2细胞中表达时。其因此主
应，与E1E2非共价连接的成熟复合物的反
分析，其不识别在这种异种系统中所表达
白。这有利于在血清来源的病毒表面上E1、
于在重组HCV颗粒中发现的排列。天然结
构依赖于装配条件。如果在异种系统中缺乏调控独特结构形成的条件，
那么当两者都分离自感染患者的血清时，与SVP和病毒体表面的相似
形成对照，VLP和HCVpp中二聚体的排列不相似。在重组亚病毒颗粒
(RSP)和病毒体中，黄病毒包括蜱传脑炎病毒(TBEV)的包膜蛋白(E)
包装的一个特别值得注意的特征是，它们以头到尾的取向平躺在病毒
表面上(Ferlengi等，2001)。结构域III上的侧表面，其具有Ig样
折叠并参与受体结合，容易接近，而融合肽是一种内环(Rey等，1995)。
因此，黄病毒通过受体介导的胞吞作用和在内体中低pH诱导的融合进
入细胞(Rice，1996)。据信正在装配的颗粒通过经由ER或早期分泌途
径的中间区室的膜出芽而获得其包膜。颗粒然后通过高尔基体外侧网
络(TGN)被运输到质膜，成熟并因此获得复合糖。所有这些步骤对于
病毒装配都是关键的，并且在复制循环的许多阶段中都起着决定性的
作用。
出乎意料地，所有HCV颗粒似乎都显示相似的生物物理属性，无
来源为何。在昆虫细胞中装配的、来自HCV-J株cDNA或来自
克隆H77c的HCV-LP的蔗糖梯度沉降模式在蔗糖平衡梯度中是
1.20g/ml(Wellnitz等，2002)。大多数颗粒的直径是40
HCV-LP外表面的E1和E2胞外域上存在的所有表
与MAb D32.10的E1和E2特异性不同。因
一密度沉降，它们也具有不同的免疫反应
和/或折叠有关，并且在细胞结合和感染性
能特性。
论它们
感染性
1.14到
到60nm。然而，在
位(Wellnitz等，2002)
此，即使颗粒在蔗糖中以同
性，其可能与不适当的转运
方面将明显地导致不同的功
与血清有包膜的HCV颗粒相反，从感染HCV个体的血浆中分离的
核心颗粒似乎与在昆虫细胞中所生产的核壳样颗粒相似。HCV核壳
CsCl梯度中1.32到1.34g/ml的密度形成条带，并且在大小上非
HCV
在
常不均
匀，直径从38到62nm(Maillard等，2001)。所有这些颗粒
MAb反应，但是不与通过用重组蛋白免疫所产生的抗E1
反应(Deleersnyder等，1997；Dubuisson等，1994)。
都与抗核心
和抗E2 MAb
因此，不同类型的HCV相关颗粒(HCV-LP、血清HCV核壳、血清
HCV病毒体)在大小和/或密度上具有一些相似之处，但是显示
原特性(E1E2复合体、有包膜的病毒体或无包膜核壳的不适当
当的折叠)。因此，总之这证明具有好的免疫学工具对于分析
粒的真实抗原性质很重要，同样地对于鉴定天然HCV病毒体
不同抗
的或适
HCV颗
也很重要。
根据这些数据和其它人的那些数据(Andre等，2002；Maillard
能获得更多关于在慢性丙型肝炎患者血清中循环的不同形
颗粒的完整谱知识。蔗糖梯度中的低密度级分(1.06g/ml)
构，与脂蛋白结合形成脂-病毒-颗粒(LVP)，以及视
等，2001)，
式HCV相关
含有衣壳样结
个别变异而定与
表现为直径大于
等，2002)。从去污
中的浮力密度是1.32
HCV RNA和免疫球蛋白结合(Andre等，2002)。LVP
100nm的大颗粒，通过LDL受体结合肝细胞系(Andre
剂处理的血清中分离的无包膜的HCV核壳在CsCl
到1.34g/ml，大小上不均匀(Maillard等，
性(Maillard等，2004)，这可
体结合作为在蔗糖梯度中高
复合物。中间密度的级分，
E1E2包被的HCV颗粒。假
E1和E2包膜糖蛋白构
均密度相似
包膜
包膜
2001)，最近表明其显示FγR样活
解释含有HCV RNA的颗粒与“非免疫”抗
密度(1.28到1.35g/ml)的HCV核心-IgG
在1.13到1.21g/ml之间，这里鉴定为
定的整个HCV病毒体(由核壳、脂膜以及两个
成)的平均密度(1.18到1.20g/ml)，与黄病毒的平
(Bradley等，1991)。从MAb D32.10的精细特异性推出的侧面
蛋白相互作用的假设也与来自TBEV的重组SVP和整个病毒颗粒的
的组织相似(Schalich等，1996)。最后，在感染HCV患者血清中存
在仅含有E1E2包膜蛋白，显示不同沉降性质(1.13到1.15g/ml)以
及不同颗粒大小(≈20nm)，但是与整个病毒颗粒具有相似抗原特征
的SVP，这支持HCV和黄病毒之间的一些相似性。
总之，通过使用新的MAb D32.10，第一次鉴定了：
(i)HCV完整病毒体，含有HCV RNA和核心抗原，在其表面上
E1E2包膜复合物，作为“大颗粒”，直径35-50nm并在1.17-1.21
形成条带；
(ii)包膜SVP的HCV群，作为“小颗粒”，缺乏衣壳和HCV RNA，
这种有包膜的颗粒可能因此代表研究HCV包膜糖蛋白结构-功能
相关模型，并且是接种方法的极好候选物。另外，在不同组患
及在HCV相关疾病的不同阶段进一步追踪循环HCV颗粒的谱将
趣的。
实施例3
获得针对纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的单克隆抗体
将在蔗糖密度梯度中进行等密度离心、含有纯化的HCV有包膜的
毒颗粒的上面所提到的富集HCV沉淀的级分，用于制备单克隆
将这种级分用于免疫小鼠并根据上述说明分离杂交瘤。由此获
单克隆抗体，(D4.12.9)，其显示出特异性识别天然HCV E2蛋
直径20-30nm并在1.13-1.15g/ml形成条带。
表达
g/ml
关系的
者中以
会是有
白，在
完整病
抗体。
得一种
Western印迹实验中(图6)，和天然HCV病毒颗粒，如在实
中证实的(图7)。事实上，图7显示D4.12.9以与D32.10相
施例2
似的方式识别HCV有包膜的亚病毒颗粒(级分8到11)和HCV有包膜
的完整病毒颗粒(级分11到14)。
实施例4
来自感染患者的抗HCV抗体的表位表征
通过使用包括它们本身的肽，评价E1和E2衍生的与D32.10反应
列(实施例1)对感染HCV患者的血清的免疫反应性。
生产E1(第290-317位氨基酸)和E2(第471-500位和第605-629
列作为生物素化的合成肽，通过ELISA用11份健康个体
份感染HCV患者的血清(编为A1到A44)进行检验。
用100μl溶于0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，浓度为10μg/ml
素在4℃过夜包被微量滴定平板孔，并用含有10％山羊
在37℃封闭1小时。然后在加入100μl生物素化肽溶液
在37℃孵育2小时前，用含有0.05％吐温-20
PBS-吐温新冲洗后，加入100μl在含有10％
1∶50稀释的检验血清，并且在37℃孵育2
洗平板。然后加入在PBS-吐温-山羊血清
的链霉抗生物
血清的PBS
位氨基酸)序
的血清和44
的肽序
(在PBS中10μg/ml)
的PBS洗涤平板三次。用
山羊血清的PBS-吐温中
小时。再次用PBS-吐温冲
中
1∶5000稀释的二抗-偶联过氧化物酶的山羊抗人IgG(Jackson
计算每种肽的截止识别(用HCV阴性血清获得的均值+3倍标准
其允许证明44份HCV阳性血清中有6份产生抗E1(第290-317
偏差)。
位氨基
ImmunoResearch Laboratories)。平板在37℃孵育1小时，然后用
PBS-吐温再冲洗一次。使用含有邻苯二胺和过氧化氢的Biomerieux
颜色试剂盒使平板显色。孵育10分钟后，用ELISA读板器在492nm
读取平板。报告值是一式三份的平均OD。
酸)(图8A)、44份中有6份产生抗E2(第471-500位氨基
图8B)以及44份中有16份产生抗E2(第605-629位氨基酸)
酸)(
(图
8C)的阳性反应。血清A7、A14、A21、A33、A39和A40与这三
在感染HCV患者血清中存在能与由D32.10mAb识别的E1和E2的 三个区
种肽产生阳性信号，而E2(605-629)也被10份更多血清识别。
域同时反应的特异性抗体，强烈支持它们在循环的有包膜的
粒表面的毗邻以及它们在小鼠和在人中的免疫原性。
本发明包含下述内容：
1.能特异性结合天然HCV病毒包膜的构象抗体。
2.根据项目1的构象抗体，能够特异性结合天然HCV E2蛋白。
3.根据项目1或2的构象抗体，能够中和患者的HCV感染。
4.根据项目1到3中任何一项的构象抗体，能够沉淀在其共价
下的HCV E1E2复合体。
5.根据项目1到4中任何一项的构象抗体，能够特异性结合天
白。
6.根据项目1到5中任何一项的构象抗体，能够特异性结合天
白、结合天然HCV E2蛋白以及能够沉淀在其共价或非共
HCV E1E2复合体。
7.根据项目1到6中任何一项的构象抗体，能够特异性结合由
至少一种构成的表位：
HCV病毒颗
或非共价形式
然HCV E1蛋
然HCV E1蛋
价形式下的
下列序列中的
-HCV蛋白E1第297到306位氨基酸(SEQ ID NO：1)；
-HCV蛋白E2第480到494位氨基酸(SEQ ID NO：2)；
-HCV蛋白E2第613到621位氨基酸(SEQ ID NO：3)。
8.根据项目7的构象抗体，能够特异性结合由下列序列中的每
位：
-HCV蛋白E1第297到306位氨基酸(SEQ ID NO：1)；
-HCV蛋白E2第480到494位氨基酸(SEQ ID NO：2)；
-HCV蛋白E2第613到621位氨基酸(SEQ ID NO：3)。
9.根据项目1到8中任何一项的构象抗体，其中所述的抗体是
10.根据项目1到9中任何一项的单克隆抗体，由2003年3月
CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes，
11.根据项目1到9中任何一项的单克隆抗体，由2003年3月
CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes，
Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2982的
杂交瘤分泌。
19日在
Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2983的
杂交瘤分泌。
19日在
单克隆抗体。
一种构成的表
12.2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culture
de Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登
录号为
CNCM I-2983的杂交瘤。
13.2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culture
de Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登
录号为
CNCM I-2982的杂交瘤。
14.药物组合物，包含至少一种项目1到11的抗体作为活性物质
上可接受的载体。
15.至少一种项目1到11的抗体用于制备诊断、预防或治疗HCV
药物的用途。
16.能结合至少一种项目10或11的抗体的有包膜的病毒颗粒。
17.结合项目16的有包膜的病毒颗粒的抗体。
和药学
感染的
18.源自人血液、血浆或血清最初样品的HCV病毒颗粒的组合物，
其中HCV RNA拷贝的浓度比其来源的人血液、血浆或血清最
的HCV RNA拷贝浓度高约100到1000倍，特别是高于约
初样品中
107拷贝/ml。
19.根据项目18的组合物，其中HCV RNA拷贝数是从每毫克蛋白
108到约109UI。
20.根据项目18或19的组合物，其中所述组合物的体积是从约
到约10ml。
约
0.1ml
21.实质上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的分离的HCV有包
病毒颗粒。
22.根据项目21的分离的HCV有包膜的亚病毒颗粒，其中所述亚
粒易于结合项目1到11的任何抗体。
23.组合物，其包含纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒，所述纯
HCV有包膜的完整病毒颗粒含有HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV
并且易于结合项目1到11的任何抗体。
24.制备HCV病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步骤：
-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两
离心，以获得富集HCV的沉淀；
-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀以获得HCV病毒颗粒的组合物。
病毒颗粒的组合物，如根据项目24的方法获得。
26.制备HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步
-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两
离心，以获得富集HCV的沉淀；
-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；
-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀以将重悬的
HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分离成级分；
膜的亚
病毒颗
化的
包膜，
次超速
骤：
次超速
富集
-回收实质上不含HCV RNA、实质上不含HCV核心蛋白以及含有能
利要求10或11的单克隆抗体的颗粒的级分，特别是蔗糖密度
到1.15g/ml的级分，以获得HCV有包膜的亚病毒颗粒
有包膜的亚病毒颗粒的组合物，如根据项目26的方法获
28.制备纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物的方法，包
步骤：
-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两
离心，以获得富集HCV的沉淀；
-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；
-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀以将重悬的
HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分离成级分；
-回收含有每毫升从约5.105到约106UI的HCV RNA、每
毫升从约
或11
29.纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物，如根据项目28
获得。
30.制备项目10的单克隆抗体的方法，包括下列步骤：
的方法
50到约100pg的HCV核心蛋白，以及含有能结合权利要求10
富集
次超速
括下列
得。
结合权
为大约1.13
的组合物。
的单克隆抗体的颗粒的级分，特别是蔗糖密度为大约1.17到1.21
g/ml的级分，以获得纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物。
-用根据权利要求18的HCV病毒颗粒的组合物，或者如根据权利 要求
24制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，并回收产生的抗体；
-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的HCV病毒颗
合物中所包含的HCV病毒颗粒的能力，选择单克隆抗体。
31.制备项目11的单克隆抗体的方法，包括下列步骤：
-用根据权利要求23的纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合
者如根据权利要求28制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，
产生的抗体；
-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的纯化的HCV
的完整病毒颗粒的组合物中所包含的纯化的HCV有包膜的完整
粒的能力，选择单克隆抗体。
32.药物组合物，其包含项目21或22的亚病毒颗粒或者项目27
物作为活性物质，以及药学上可接受的载体。
33.项目21或22的HCV有包膜的亚病毒颗粒或者项目27的组合
途，用于诱导针对所述HCV有包膜的亚病毒颗粒或者针对如在
22中所定义的HCV有包膜的完整病毒颗粒的免疫反应。
34.项目21或22的HCV有包膜的亚病毒颗粒或者项目27的组合
途，用于制备诊断、预防或治疗HCV感染的药物。
参考文献
粒的组
物，或
并回收
有包膜
病毒颗
的组合
物的用
项目
物的用
Andre，P.，an-Pradel，es，，d，r，
，t，os-Baccala，和terization
of low-and very-low-density hepatitis C virus RNA-containing particles.J
Virus 76：6919-28
Aoyagi K，Ohue C，Iida K，Kimura T，Tanaka E，Kiyosawa K，Yagi .
Bartenschlager R，Lohman V.J .(2000)81：1631-1648
Bartosch，B.，son，和ious hepatitis C virus
Baumert，T.F.，la，，n，ann，，
Bradley，D.，tland，ynski，ing，ey，和E.
Buttin B，Leguern C，Phalente L，Lin ECC，Medrano L，Cazenave .
Choo QL，Kuo G，Weiner AJ，Overby LR，Bradley DW，
Houghton e(1989)
Choo QL，Richman KH，Han JH，Berger K，Lee C，Dong C，Gallegos C，Coit D，
244：359-362
.(1978)81：27-36
tis C virus：buoyant density of the factor VIII-derived
isolate in sucrose.J Med Virol 34：206-8.
erg，，和tis C virus-like particles
synthesized in insect cells as a potential vaccine enterology
117：1397-407.
pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.J
Exp Med 197：633-42.
Microbiol.(1999)37：1802-1808
Medina-
2455
Selby R，Barr PJ，等(1991)88：2451-
Clarke .(1997)78：2397-410
Colucci，G.，and pment of a quantitative PCR assay
DamenM，Sillekens P，Cuypers HT，FrantzenI，Melsert R.J s(1999)
Deleersnyder V，Pillez A，Wychowsld C，Blight K，Xu J，Hahn YS，Rice CM，
Dubuisson，J.，，，erg，l，和C.
Dubuisson J，Rice l of Virology(1996)70：778-786
Dubuisson t Topics in Microbiology and Imunology(2000)242：135-148
Ferlenghi，I.，，，n，ch，，
on，，和lar organization of
a recombinant subviral particle from tick-borne encephalitis Cell
7：593-602.
ion and intracellular localization of hepatitis C virus
envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbis
viruses.J Virol 68：6147-60.
Dubuisson l of Virology(1997)71：697-704
82：45-54
for monitoring HCV viraemia levels in patients with chronic hepatitis C.J Viral
Hepat 4 Suppl 1：75-8.
Frank R9 Doring edron(1988)44：6031-6040
Heinz，F.X.，n，y，ch，nn，，
Hijikata，M.，u，，o，，，R.
Jolivet-Reynaud C，Dalbon P，Viola F，Yvon S，Paranhos-Baccala.G，Piga N，
Kanto，T.，i，ra，ra，，，ra，
Kohler G，Milstein (1975)256：495-497
Konishi，E.，，ti，，e，和.
immunized with a subviral particle containing the Japanese
encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection.
Virology 188：714-20.
to，和y analysis of hepatitis C virus particle
population in the circulation of infected hosts：implications for virus
Bridon L，Trabaud MA，Battail N，Sibai G，Jolivet M.J Med Virol(1998)56：
300-309
l，and brium centrifugation studies of
hepatitis C virus：evidence for circulating immune complexes.J Virol 67：
1953-8.
和inant and virion-derived soluble and particulate
immunogens for vaccination against tick-borne e 13：
1636-42.
neutralization or persistence.J Hepatol 22：440-8
Laub，O.，，，，ing，uela，和
Leroux-Roels，G.， Hecke，lsen，，，and .
Longo，M.C.，ger，和 of uracil DNA
Lowry O，Rosebrough A，Farr A，Randall .(1951)193：265-275
Maillard，P.，ne，l，，nd，，
Mason，P.W.，，er，，，和E.
Menez，R.，，，，，el，C.
se encephalitis virus-vaccinia recombinants produce
particulate forms of the structural membrane proteins and induce high levels
of protection against lethal JEV gy 180：294-305.
ud，和{gamma}Receptor-like Activity of
Hepatitis C Virus Core Protein.J Biol Chem 279：2430-2437.
Maillard，P.，ynski，wicz，rt，iewicz，P.
Gounon，son，，c，和ska.2001.
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions.
Gene 93：125-8.
ation between in vivo humoral and in vitro cellular immune
responses following immunization with hepatitis B surface antigen(HBsAg)
e 12：812-8.
sis of hepatitis B surface antigen in mammalian cells：
expression of the entire gene and the coding region.J Virol 48：271-80.
Nonenveloped nucleocapsids of hepatitis C virus in the serum of infected
patients.J Virol 75：8240-50.
Jolivet-Reynaud，和l structure of a hydrophobic
immunodominant antigenic site on hepatitis C virus core protein complexed to
monoclonal antibody 19D9D6.J Immunol 170：1917-24.
Op De Beeck A，Cocquerel L，Dubuisson .(2001)82：2589-95
Pearson WR，和Lipman Natl Acad Sci USA (1988)85：2444-2448
Petit MA，Capel F，Riottot MM，Dauguet C，Pillot .(1987)68：
Petit，M.A.，het，和lonal antibody specific
Rey，F.A.，，，，和
Rice，iridae：the viruses and their replication，p.931-959.
In BN，Howley PM，Chanock RM，Melnick JL，Monath TP，
Roizman n
PA.
2759-2767
for the hepatocyte receptor binding site on hepatitis B Immunol 26：
531-7.
envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.
Nature 375：291-8.
B，and Straus SE(编)，cott-Raven，Philadelphia，
Russell，P.，Brandt WE和Dalrymple al and antigenic structure
of flaviviruses， (编)，The y，Structure，
ic Press，New York.
Sambrook J，Fritsch E，Maniatis lar Cloning.A Laboratory Manual(1982)
Sanger F，Nicklen S，Coulson (1977)74：5463-5467
Sato K，Okamoto H，Aihara S，Hoshi Y，Tanaka T，Mishiro gy(1993)
Schalich，J.，n，y，，，和.
Scott JK，Smith e (1990)249：386-390
Thomssen，R.，，，nn，，和.1992.
Association of hepatitis C virus in human sera with
Wellnitz，S.，，，，，son，，
Yagnik AT，Lahm A，Meola A，Roccasecca R M，Ercole BB，Nicosia A，
Tramontano 0teins(2000)40：355-366
和g of hepatitis C virus-like particles derived
from infectious clone H77C to defined human cell lines.J Virol 76：1181-93.
Microbiol Immunol (Berl)181：293-300.
inant subviral particles from tick-borne encephalitis virus are
fusogenic and provide a model system for studying flavivirus envelope
glycoprotein functions.J Virol 70：4549-57
196：354-357
Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY
Yoshikura，H.， ta， jima，和ation
Young KK，Resnick RM，Myers iol.(1993)31：882-886
of hepatitis C virus.J Viral Hepat 3：3-10.
2024年6月14日发(作者：以静柏)
匀
20％在40到50nm之间(均值＝43.61nm)，4％在50和60nm之间
(均值＝55.69nm)。所有颗粒中仅20％直径小于30nm(均值＝26.35
nm)。电子显微镜照片(图11B)显示HCV颗粒以相对规则的光滑表
面为特征。图11B a和b组，例示了HCV有包膜的颗粒的大小不均
性。图11B c组显示直径50nm的颗粒，d组显示那些颗粒直
在35nm的颗粒表面上出现相当同质的更高密度(图
在50nm直径的颗粒中央可清楚地观察到更低密度的更
c组)。当使用无关的第一单克隆抗体时，通过
(图11B，e组)。对蔗糖梯度峰1和2的
及通过IEM进行分析(图12A-
绝大多数(85.4％)是
径35nm。
11B，d组)，而
亮区(图11B，
IEM没有观察到颗粒
颗粒进行免疫沉淀、染色以
12B)。如在图12A中所示，峰1中的
直径约20nm的球形颗粒(41个颗粒中有35
14.6％的颗粒直径大于30nm，可能对应
材料大小更不均匀(图12B)。然
(77.5％)的平均直径约41nm(89个颗粒
可能对应于整个HCV病毒体的直径。
30nm直径的颗粒(13.5％)，可能
快沉降峰(峰2)主要由35
慢沉降峰(峰1)主
研究表明两种
个，平均值＝20.6nm)。仅
于与峰2的重叠。峰2似乎比峰1
而，在这群中最普遍的形式
中有69个，均值＝41.15nm)，其
在这种制剂中可见到一些较小的
由于与峰1的重叠所致。异质的主要的较
和50nm直径的大颗粒组成，而同质的次要的较
要由大约20nm直径的小颗粒组成。总的说来，形态学
大小类别的E1E2包被的HCV颗粒共同存在于感染患
间接免疫金标记(图13)，所有球形有包膜的颗
定，都特异性固定10nm金标记的二抗。
者的血清中。通过
粒，先前通过IEM鉴
因此，通过用MAb D32.10的免疫-电子显微镜术，测定总的有包
(富集HCV的沉淀)以及每种E1E2群各自的相对较好限定的颗
有包膜的HCV颗粒大小上不均匀，但是可容易地鉴定两
膜的群
粒大小分布。
个不同大小类别的颗粒。多数种类由直径从35nm到50nm变化的大
颗粒构成，可能视包膜的晶格结构而定，对应于完整的含有衣壳的有
包膜颗粒。另一种更同质的种类由直径约20nm的小颗粒构成，对应
于无衣壳的SVP。进一步鉴定结合MAb D32.10的所有这些颗粒并使用
用抗小鼠IgG-金颗粒的间接标记，通过电子显微镜术观察。
除了感染性的病毒体外还形成非感染性SVP是黄病毒感染的共同
(Russel等，1980)。已提出这些代表无衣壳的空病毒包膜(Mason
1991)。其也发生在感染乙型肝炎病毒(HBV)的细胞中，以及通
表达包膜蛋白生产分泌的SVP(Laub等，1983)。这些颗粒小于
这证明这些蛋白在存在或缺乏核心时内在地能够自我形成特
这些颗粒装配并经历与整个病毒体相同的成熟过程，
合物加工。用这种重组包膜SVP的免疫显示它们
(Konishi等，1992；Heinz等，1995)和在人中
极好的保护性免疫原。
完整病毒体和SVP与MAb D32.10的反应性显示，E1(297-
494)(613-621)构象表位以基本上相同的方式呈现在
的表面上。然而，在通过基因重组获得并在异种系
细胞(Baumert等，1999)或反转录病毒/293 T细胞
中生产的颗粒上缺乏在血清来源的病毒体和SVP
提示这种复合位点缺乏和/或存在于这些重组
特征
等，
过单独
病毒体。
异性微粒结构。
包括糖基化和碳水化
在动物模型中
(Leroux-Roels等，1994)是
306)-E2(480-
HCV病毒体和SVP
统：棒状病毒/昆虫
(Bartosch等，2003)
上检测到的这种表位，
HCV颗粒表面上分开的难
留在ER中，后者HCV假
值得注意的是MAb D32.10
应。其能够特异性免疫沉淀
白分别或者一起由痘苗病毒
要与二硫键连接的聚集体反
应更微弱。然而，通过印迹
的变性的重组E1或E2蛋
E2和E1E2的排列，其不同
接近的区域上。前者HCV样颗粒(HCV-LP)保
颗粒(HCVpp)中仅有一小部分到达细胞表面。
既不与HSA也不与免疫球蛋白的γ或μ链反
E1、E2以及E1E2异二聚体，当这两种蛋
重组体在HepG2细胞中表达时。其因此主
应，与E1E2非共价连接的成熟复合物的反
分析，其不识别在这种异种系统中所表达
白。这有利于在血清来源的病毒表面上E1、
于在重组HCV颗粒中发现的排列。天然结
构依赖于装配条件。如果在异种系统中缺乏调控独特结构形成的条件，
那么当两者都分离自感染患者的血清时，与SVP和病毒体表面的相似
形成对照，VLP和HCVpp中二聚体的排列不相似。在重组亚病毒颗粒
(RSP)和病毒体中，黄病毒包括蜱传脑炎病毒(TBEV)的包膜蛋白(E)
包装的一个特别值得注意的特征是，它们以头到尾的取向平躺在病毒
表面上(Ferlengi等，2001)。结构域III上的侧表面，其具有Ig样
折叠并参与受体结合，容易接近，而融合肽是一种内环(Rey等，1995)。
因此，黄病毒通过受体介导的胞吞作用和在内体中低pH诱导的融合进
入细胞(Rice，1996)。据信正在装配的颗粒通过经由ER或早期分泌途
径的中间区室的膜出芽而获得其包膜。颗粒然后通过高尔基体外侧网
络(TGN)被运输到质膜，成熟并因此获得复合糖。所有这些步骤对于
病毒装配都是关键的，并且在复制循环的许多阶段中都起着决定性的
作用。
出乎意料地，所有HCV颗粒似乎都显示相似的生物物理属性，无
来源为何。在昆虫细胞中装配的、来自HCV-J株cDNA或来自
克隆H77c的HCV-LP的蔗糖梯度沉降模式在蔗糖平衡梯度中是
1.20g/ml(Wellnitz等，2002)。大多数颗粒的直径是40
HCV-LP外表面的E1和E2胞外域上存在的所有表
与MAb D32.10的E1和E2特异性不同。因
一密度沉降，它们也具有不同的免疫反应
和/或折叠有关，并且在细胞结合和感染性
能特性。
论它们
感染性
1.14到
到60nm。然而，在
位(Wellnitz等，2002)
此，即使颗粒在蔗糖中以同
性，其可能与不适当的转运
方面将明显地导致不同的功
与血清有包膜的HCV颗粒相反，从感染HCV个体的血浆中分离的
核心颗粒似乎与在昆虫细胞中所生产的核壳样颗粒相似。HCV核壳
CsCl梯度中1.32到1.34g/ml的密度形成条带，并且在大小上非
HCV
在
常不均
匀，直径从38到62nm(Maillard等，2001)。所有这些颗粒
MAb反应，但是不与通过用重组蛋白免疫所产生的抗E1
反应(Deleersnyder等，1997；Dubuisson等，1994)。
都与抗核心
和抗E2 MAb
因此，不同类型的HCV相关颗粒(HCV-LP、血清HCV核壳、血清
HCV病毒体)在大小和/或密度上具有一些相似之处，但是显示
原特性(E1E2复合体、有包膜的病毒体或无包膜核壳的不适当
当的折叠)。因此，总之这证明具有好的免疫学工具对于分析
粒的真实抗原性质很重要，同样地对于鉴定天然HCV病毒体
不同抗
的或适
HCV颗
也很重要。
根据这些数据和其它人的那些数据(Andre等，2002；Maillard
能获得更多关于在慢性丙型肝炎患者血清中循环的不同形
颗粒的完整谱知识。蔗糖梯度中的低密度级分(1.06g/ml)
构，与脂蛋白结合形成脂-病毒-颗粒(LVP)，以及视
等，2001)，
式HCV相关
含有衣壳样结
个别变异而定与
表现为直径大于
等，2002)。从去污
中的浮力密度是1.32
HCV RNA和免疫球蛋白结合(Andre等，2002)。LVP
100nm的大颗粒，通过LDL受体结合肝细胞系(Andre
剂处理的血清中分离的无包膜的HCV核壳在CsCl
到1.34g/ml，大小上不均匀(Maillard等，
性(Maillard等，2004)，这可
体结合作为在蔗糖梯度中高
复合物。中间密度的级分，
E1E2包被的HCV颗粒。假
E1和E2包膜糖蛋白构
均密度相似
包膜
包膜
2001)，最近表明其显示FγR样活
解释含有HCV RNA的颗粒与“非免疫”抗
密度(1.28到1.35g/ml)的HCV核心-IgG
在1.13到1.21g/ml之间，这里鉴定为
定的整个HCV病毒体(由核壳、脂膜以及两个
成)的平均密度(1.18到1.20g/ml)，与黄病毒的平
(Bradley等，1991)。从MAb D32.10的精细特异性推出的侧面
蛋白相互作用的假设也与来自TBEV的重组SVP和整个病毒颗粒的
的组织相似(Schalich等，1996)。最后，在感染HCV患者血清中存
在仅含有E1E2包膜蛋白，显示不同沉降性质(1.13到1.15g/ml)以
及不同颗粒大小(≈20nm)，但是与整个病毒颗粒具有相似抗原特征
的SVP，这支持HCV和黄病毒之间的一些相似性。
总之，通过使用新的MAb D32.10，第一次鉴定了：
(i)HCV完整病毒体，含有HCV RNA和核心抗原，在其表面上
E1E2包膜复合物，作为“大颗粒”，直径35-50nm并在1.17-1.21
形成条带；
(ii)包膜SVP的HCV群，作为“小颗粒”，缺乏衣壳和HCV RNA，
这种有包膜的颗粒可能因此代表研究HCV包膜糖蛋白结构-功能
相关模型，并且是接种方法的极好候选物。另外，在不同组患
及在HCV相关疾病的不同阶段进一步追踪循环HCV颗粒的谱将
趣的。
实施例3
获得针对纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的单克隆抗体
将在蔗糖密度梯度中进行等密度离心、含有纯化的HCV有包膜的
毒颗粒的上面所提到的富集HCV沉淀的级分，用于制备单克隆
将这种级分用于免疫小鼠并根据上述说明分离杂交瘤。由此获
单克隆抗体，(D4.12.9)，其显示出特异性识别天然HCV E2蛋
直径20-30nm并在1.13-1.15g/ml形成条带。
表达
g/ml
关系的
者中以
会是有
白，在
完整病
抗体。
得一种
Western印迹实验中(图6)，和天然HCV病毒颗粒，如在实
中证实的(图7)。事实上，图7显示D4.12.9以与D32.10相
施例2
似的方式识别HCV有包膜的亚病毒颗粒(级分8到11)和HCV有包膜
的完整病毒颗粒(级分11到14)。
实施例4
来自感染患者的抗HCV抗体的表位表征
通过使用包括它们本身的肽，评价E1和E2衍生的与D32.10反应
列(实施例1)对感染HCV患者的血清的免疫反应性。
生产E1(第290-317位氨基酸)和E2(第471-500位和第605-629
列作为生物素化的合成肽，通过ELISA用11份健康个体
份感染HCV患者的血清(编为A1到A44)进行检验。
用100μl溶于0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，浓度为10μg/ml
素在4℃过夜包被微量滴定平板孔，并用含有10％山羊
在37℃封闭1小时。然后在加入100μl生物素化肽溶液
在37℃孵育2小时前，用含有0.05％吐温-20
PBS-吐温新冲洗后，加入100μl在含有10％
1∶50稀释的检验血清，并且在37℃孵育2
洗平板。然后加入在PBS-吐温-山羊血清
的链霉抗生物
血清的PBS
位氨基酸)序
的血清和44
的肽序
(在PBS中10μg/ml)
的PBS洗涤平板三次。用
山羊血清的PBS-吐温中
小时。再次用PBS-吐温冲
中
1∶5000稀释的二抗-偶联过氧化物酶的山羊抗人IgG(Jackson
计算每种肽的截止识别(用HCV阴性血清获得的均值+3倍标准
其允许证明44份HCV阳性血清中有6份产生抗E1(第290-317
偏差)。
位氨基
ImmunoResearch Laboratories)。平板在37℃孵育1小时，然后用
PBS-吐温再冲洗一次。使用含有邻苯二胺和过氧化氢的Biomerieux
颜色试剂盒使平板显色。孵育10分钟后，用ELISA读板器在492nm
读取平板。报告值是一式三份的平均OD。
酸)(图8A)、44份中有6份产生抗E2(第471-500位氨基
图8B)以及44份中有16份产生抗E2(第605-629位氨基酸)
酸)(
(图
8C)的阳性反应。血清A7、A14、A21、A33、A39和A40与这三
在感染HCV患者血清中存在能与由D32.10mAb识别的E1和E2的 三个区
种肽产生阳性信号，而E2(605-629)也被10份更多血清识别。
域同时反应的特异性抗体，强烈支持它们在循环的有包膜的
粒表面的毗邻以及它们在小鼠和在人中的免疫原性。
本发明包含下述内容：
1.能特异性结合天然HCV病毒包膜的构象抗体。
2.根据项目1的构象抗体，能够特异性结合天然HCV E2蛋白。
3.根据项目1或2的构象抗体，能够中和患者的HCV感染。
4.根据项目1到3中任何一项的构象抗体，能够沉淀在其共价
下的HCV E1E2复合体。
5.根据项目1到4中任何一项的构象抗体，能够特异性结合天
白。
6.根据项目1到5中任何一项的构象抗体，能够特异性结合天
白、结合天然HCV E2蛋白以及能够沉淀在其共价或非共
HCV E1E2复合体。
7.根据项目1到6中任何一项的构象抗体，能够特异性结合由
至少一种构成的表位：
HCV病毒颗
或非共价形式
然HCV E1蛋
然HCV E1蛋
价形式下的
下列序列中的
-HCV蛋白E1第297到306位氨基酸(SEQ ID NO：1)；
-HCV蛋白E2第480到494位氨基酸(SEQ ID NO：2)；
-HCV蛋白E2第613到621位氨基酸(SEQ ID NO：3)。
8.根据项目7的构象抗体，能够特异性结合由下列序列中的每
位：
-HCV蛋白E1第297到306位氨基酸(SEQ ID NO：1)；
-HCV蛋白E2第480到494位氨基酸(SEQ ID NO：2)；
-HCV蛋白E2第613到621位氨基酸(SEQ ID NO：3)。
9.根据项目1到8中任何一项的构象抗体，其中所述的抗体是
10.根据项目1到9中任何一项的单克隆抗体，由2003年3月
CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes，
11.根据项目1到9中任何一项的单克隆抗体，由2003年3月
CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes，
Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2982的
杂交瘤分泌。
19日在
Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2983的
杂交瘤分泌。
19日在
单克隆抗体。
一种构成的表
12.2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culture
de Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登
录号为
CNCM I-2983的杂交瘤。
13.2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culture
de Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登
录号为
CNCM I-2982的杂交瘤。
14.药物组合物，包含至少一种项目1到11的抗体作为活性物质
上可接受的载体。
15.至少一种项目1到11的抗体用于制备诊断、预防或治疗HCV
药物的用途。
16.能结合至少一种项目10或11的抗体的有包膜的病毒颗粒。
17.结合项目16的有包膜的病毒颗粒的抗体。
和药学
感染的
18.源自人血液、血浆或血清最初样品的HCV病毒颗粒的组合物，
其中HCV RNA拷贝的浓度比其来源的人血液、血浆或血清最
的HCV RNA拷贝浓度高约100到1000倍，特别是高于约
初样品中
107拷贝/ml。
19.根据项目18的组合物，其中HCV RNA拷贝数是从每毫克蛋白
108到约109UI。
20.根据项目18或19的组合物，其中所述组合物的体积是从约
到约10ml。
约
0.1ml
21.实质上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的分离的HCV有包
病毒颗粒。
22.根据项目21的分离的HCV有包膜的亚病毒颗粒，其中所述亚
粒易于结合项目1到11的任何抗体。
23.组合物，其包含纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒，所述纯
HCV有包膜的完整病毒颗粒含有HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV
并且易于结合项目1到11的任何抗体。
24.制备HCV病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步骤：
-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两
离心，以获得富集HCV的沉淀；
-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀以获得HCV病毒颗粒的组合物。
病毒颗粒的组合物，如根据项目24的方法获得。
26.制备HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步
-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两
离心，以获得富集HCV的沉淀；
-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；
-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀以将重悬的
HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分离成级分；
膜的亚
病毒颗
化的
包膜，
次超速
骤：
次超速
富集
-回收实质上不含HCV RNA、实质上不含HCV核心蛋白以及含有能
利要求10或11的单克隆抗体的颗粒的级分，特别是蔗糖密度
到1.15g/ml的级分，以获得HCV有包膜的亚病毒颗粒
有包膜的亚病毒颗粒的组合物，如根据项目26的方法获
28.制备纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物的方法，包
步骤：
-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两
离心，以获得富集HCV的沉淀；
-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；
-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀以将重悬的
HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分离成级分；
-回收含有每毫升从约5.105到约106UI的HCV RNA、每
毫升从约
或11
29.纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物，如根据项目28
获得。
30.制备项目10的单克隆抗体的方法，包括下列步骤：
的方法
50到约100pg的HCV核心蛋白，以及含有能结合权利要求10
富集
次超速
括下列
得。
结合权
为大约1.13
的组合物。
的单克隆抗体的颗粒的级分，特别是蔗糖密度为大约1.17到1.21
g/ml的级分，以获得纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物。
-用根据权利要求18的HCV病毒颗粒的组合物，或者如根据权利 要求
24制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，并回收产生的抗体；
-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的HCV病毒颗
合物中所包含的HCV病毒颗粒的能力，选择单克隆抗体。
31.制备项目11的单克隆抗体的方法，包括下列步骤：
-用根据权利要求23的纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合
者如根据权利要求28制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，
产生的抗体；
-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的纯化的HCV
的完整病毒颗粒的组合物中所包含的纯化的HCV有包膜的完整
粒的能力，选择单克隆抗体。
32.药物组合物，其包含项目21或22的亚病毒颗粒或者项目27
物作为活性物质，以及药学上可接受的载体。
33.项目21或22的HCV有包膜的亚病毒颗粒或者项目27的组合
途，用于诱导针对所述HCV有包膜的亚病毒颗粒或者针对如在
22中所定义的HCV有包膜的完整病毒颗粒的免疫反应。
34.项目21或22的HCV有包膜的亚病毒颗粒或者项目27的组合
途，用于制备诊断、预防或治疗HCV感染的药物。
参考文献
粒的组
物，或
并回收
有包膜
病毒颗
的组合
物的用
项目
物的用
Andre，P.，an-Pradel，es，，d，r，
，t，os-Baccala，和terization
of low-and very-low-density hepatitis C virus RNA-containing particles.J
Virus 76：6919-28
Aoyagi K，Ohue C，Iida K，Kimura T，Tanaka E，Kiyosawa K，Yagi .
Bartenschlager R，Lohman V.J .(2000)81：1631-1648
Bartosch，B.，son，和ious hepatitis C virus
Baumert，T.F.，la，，n，ann，，
Bradley，D.，tland，ynski，ing，ey，和E.
Buttin B，Leguern C，Phalente L，Lin ECC，Medrano L，Cazenave .
Choo QL，Kuo G，Weiner AJ，Overby LR，Bradley DW，
Houghton e(1989)
Choo QL，Richman KH，Han JH，Berger K，Lee C，Dong C，Gallegos C，Coit D，
244：359-362
.(1978)81：27-36
tis C virus：buoyant density of the factor VIII-derived
isolate in sucrose.J Med Virol 34：206-8.
erg，，和tis C virus-like particles
synthesized in insect cells as a potential vaccine enterology
117：1397-407.
pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.J
Exp Med 197：633-42.
Microbiol.(1999)37：1802-1808
Medina-
2455
Selby R，Barr PJ，等(1991)88：2451-
Clarke .(1997)78：2397-410
Colucci，G.，and pment of a quantitative PCR assay
DamenM，Sillekens P，Cuypers HT，FrantzenI，Melsert R.J s(1999)
Deleersnyder V，Pillez A，Wychowsld C，Blight K，Xu J，Hahn YS，Rice CM，
Dubuisson，J.，，，erg，l，和C.
Dubuisson J，Rice l of Virology(1996)70：778-786
Dubuisson t Topics in Microbiology and Imunology(2000)242：135-148
Ferlenghi，I.，，，n，ch，，
on，，和lar organization of
a recombinant subviral particle from tick-borne encephalitis Cell
7：593-602.
ion and intracellular localization of hepatitis C virus
envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbis
viruses.J Virol 68：6147-60.
Dubuisson l of Virology(1997)71：697-704
82：45-54
for monitoring HCV viraemia levels in patients with chronic hepatitis C.J Viral
Hepat 4 Suppl 1：75-8.
Frank R9 Doring edron(1988)44：6031-6040
Heinz，F.X.，n，y，ch，nn，，
Hijikata，M.，u，，o，，，R.
Jolivet-Reynaud C，Dalbon P，Viola F，Yvon S，Paranhos-Baccala.G，Piga N，
Kanto，T.，i，ra，ra，，，ra，
Kohler G，Milstein (1975)256：495-497
Konishi，E.，，ti，，e，和.
immunized with a subviral particle containing the Japanese
encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection.
Virology 188：714-20.
to，和y analysis of hepatitis C virus particle
population in the circulation of infected hosts：implications for virus
Bridon L，Trabaud MA，Battail N，Sibai G，Jolivet M.J Med Virol(1998)56：
300-309
l，and brium centrifugation studies of
hepatitis C virus：evidence for circulating immune complexes.J Virol 67：
1953-8.
和inant and virion-derived soluble and particulate
immunogens for vaccination against tick-borne e 13：
1636-42.
neutralization or persistence.J Hepatol 22：440-8
Laub，O.，，，，ing，uela，和
Leroux-Roels，G.， Hecke，lsen，，，and .
Longo，M.C.，ger，和 of uracil DNA
Lowry O，Rosebrough A，Farr A，Randall .(1951)193：265-275
Maillard，P.，ne，l，，nd，，
Mason，P.W.，，er，，，和E.
Menez，R.，，，，，el，C.
se encephalitis virus-vaccinia recombinants produce
particulate forms of the structural membrane proteins and induce high levels
of protection against lethal JEV gy 180：294-305.
ud，和{gamma}Receptor-like Activity of
Hepatitis C Virus Core Protein.J Biol Chem 279：2430-2437.
Maillard，P.，ynski，wicz，rt，iewicz，P.
Gounon，son，，c，和ska.2001.
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions.
Gene 93：125-8.
ation between in vivo humoral and in vitro cellular immune
responses following immunization with hepatitis B surface antigen(HBsAg)
e 12：812-8.
sis of hepatitis B surface antigen in mammalian cells：
expression of the entire gene and the coding region.J Virol 48：271-80.
Nonenveloped nucleocapsids of hepatitis C virus in the serum of infected
patients.J Virol 75：8240-50.
Jolivet-Reynaud，和l structure of a hydrophobic
immunodominant antigenic site on hepatitis C virus core protein complexed to
monoclonal antibody 19D9D6.J Immunol 170：1917-24.
Op De Beeck A，Cocquerel L，Dubuisson .(2001)82：2589-95
Pearson WR，和Lipman Natl Acad Sci USA (1988)85：2444-2448
Petit MA，Capel F，Riottot MM，Dauguet C，Pillot .(1987)68：
Petit，M.A.，het，和lonal antibody specific
Rey，F.A.，，，，和
Rice，iridae：the viruses and their replication，p.931-959.
In BN，Howley PM，Chanock RM，Melnick JL，Monath TP，
Roizman n
PA.
2759-2767
for the hepatocyte receptor binding site on hepatitis B Immunol 26：
531-7.
envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.
Nature 375：291-8.
B，and Straus SE(编)，cott-Raven，Philadelphia，
Russell，P.，Brandt WE和Dalrymple al and antigenic structure
of flaviviruses， (编)，The y，Structure，
ic Press，New York.
Sambrook J，Fritsch E，Maniatis lar Cloning.A Laboratory Manual(1982)
Sanger F，Nicklen S，Coulson (1977)74：5463-5467
Sato K，Okamoto H，Aihara S，Hoshi Y，Tanaka T，Mishiro gy(1993)
Schalich，J.，n，y，，，和.
Scott JK，Smith e (1990)249：386-390
Thomssen，R.，，，nn，，和.1992.
Association of hepatitis C virus in human sera with
Wellnitz，S.，，，，，son，，
Yagnik AT，Lahm A，Meola A，Roccasecca R M，Ercole BB，Nicosia A，
Tramontano 0teins(2000)40：355-366
和g of hepatitis C virus-like particles derived
from infectious clone H77C to defined human cell lines.J Virol 76：1181-93.
Microbiol Immunol (Berl)181：293-300.
inant subviral particles from tick-borne encephalitis virus are
fusogenic and provide a model system for studying flavivirus envelope
glycoprotein functions.J Virol 70：4549-57
196：354-357
Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY
Yoshikura，H.， ta， jima，和ation
Young KK，Resnick RM，Myers iol.(1993)31：882-886
of hepatitis C virus.J Viral Hepat 3：3-10.