2024年6月5日发(作者：夔寰)
82
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
AuroraA激酶抑制剂Alisertib诱导结直肠
癌细胞自噬的作用及与p53表达间的关系
任宝军
1
，剧永乐
1
，封静
1
，陈淑香
2
，刘家旋
1
，罗振涛
1
，王家智
1
，杨帆
1
，
李德智
1
，董博业
1
，耿岩
1*
［摘要］目的探讨Alisertib（ALS）对人结直肠癌Caco⁃2和HT29细胞的诱导自噬的作用及与
本研究采用人结直肠癌Caco⁃2和HT29细胞进行实验。实验组p53表达状态间的关系。方法
用0.1、1、5μmol/LALS而对照组用同浓度的DMSO处理细胞。流式细胞术检测细胞的自噬率，
WesterBlotting法检测细胞自噬过程中关键调节分子的蛋白表达。结果与对照组比较，0.1、
1μmol/LAlisertib组Caco⁃2细胞自噬率增加，分别为26.4%和26.8%（P<0.01）。1、5μmol/LALS组
HT29细胞自噬率增加，分别为36.8%和42.6%（P<0.01）。Caco⁃2细胞不表达p53蛋白，而HT29细
胞表达p53蛋白。与对照组比较，1、5μmol/LAlisertib引起Caco⁃2细胞的p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt
和p⁃p38/p38的比值分别降低为对照组的62.6%、45.2%，30.1%、38.2%和49.0%、30.4%（P<0.01），
LC3⁃Ⅱ/LC3⁃I的比值升高32.6%、46.8%（P<0.01）。与对照组比较，1、5μmol/LAlisertib引起HT29细
p⁃p38/p38和LC3⁃II/LC3⁃I的比值升高2.1倍、2.0倍和78.5%、84.8%（P<0.05）。与5μmol/LAlisertib
Caco⁃2细胞凋亡率无明显变化。结论
胞的p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt的比值分别降低为对照组的70.9%、66.3%和85.2%、27.2%（P<0.01），
组比较，10μmol/LSB202190+5μmol/LAlisertib引起HT29细胞凋亡率升高64.7%（P<0.001），而
细胞发生细胞自噬。Alisertib对p38MAPK信号通路的影响不同，激活了HT29而抑制了Caco⁃2
细胞的p38MAPK信号通路，可能与p53蛋白是否表达有关。
［关键词］Alisertib；AuroraA；p53；结直肠癌；自噬
doi：10.3969/.1009⁃976X.2021.01.014中图分类号：R735.3+5；R735.3+7文献标识码：A
Alisertib抑制了PI3K/Akt信号通路，诱导了Caco⁃2和HT29
Alisertib，anAuroraaKinaseinhibitor，inducesautophagyofcolorectalcancercellsanditsrela⁃
tionshipwithp53expression
RENBao⁃jun
1
，
JUYong⁃le
1
，
FENGJing
1
，
CHENShu⁃xiang
2
，
LIUJia⁃xuan
1
，
LUOZhen⁃tao
1
，
WANG
Jia⁃zhi
1
，
YANGFan
1
，
LIDe⁃zhi
1
，
DONGBo⁃ye
，
GENGYan
1
mentofGastrointestinalSurgery
，
ShundeHospital
，
SouthernMedicalUniversity
，
Shunde
（
The
FirstPeople
′
sHospitalofShunde
），
Guangdong528308
，
China
；2.
DepartmentofAnesthesia
，
Shunde
Hospital
，
SouthernMedicalUniversity
（
TheFirstPeople′sHospitalofShunde
），
Shunde
，
Guangdong
528308
，
China
Correspondingauthor
：
GENGYan
，
******************
［Abstract］ObjectiveToexploretheeffectofAlisertib（ALS）onhumancolorectalcancerCaco⁃2
InthisandHT29cs
study，humancolorectalcancerCaco⁃erimental
teinexpression
levelsofkeyregulatorymoleculesintheprocessofcellautophagywereexaminedbywesterblotting.
groupsweretreatedwith0.1，1，and5μmol/LALSandthecontrolgroupwastreatedwiththesamecon⁃
基金项目：广东省医学科学技术研究基金（A2018150）；佛山市医学类科技攻关项目（2017AB003533）；南方医科大学顺德医院科研
启动计划项目（SRSP2018002）；佛山市医学骨干人才项目（耿岩）
作者单位：1.南方医科大学顺德医院（佛山市顺德区第一人民医院）胃肠外科，广东顺德528308；2.南方医科大学顺德医院（佛山市
顺德区第一人民医院）麻醉手术室，广州528308
*通信作者：耿岩，E⁃mail：******************
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
83
Results
Alisertibgroupsincreasedto26.4%and26.8%（P<0.01）.TheautophagyrateofHT29cellsinthe1and
Comparedwiththecontrolgroup，theautophagyrateofCaco⁃2cellsinthe0.1and1μmol/L
5μmol/LALSgroupsincreasedto36.8%and42.6%（P<0.01）.Caco⁃2cellsdidnotexpressp53protein，
edwiththecontrolgroup，theratioofp⁃PI3K/PI3K，
p⁃Akt/Aktandp⁃p38/p38inCaco⁃2cellsaftertreatmentwith1，5μmol/Lalisertibdecreasedto62.6%，
45.2%，30.1%，38.2%and49.0%，30.4%（P<0.01），whiletheratioofLC3⁃II/LC3⁃Iincreasedby32.6%，
46.8%（P<0.01）.1，5μmol/LAlisertibcausedthep⁃PI3K/PI3Kandp⁃Akt/AktratiosofHT29cellsto
increasedby2.1times，2.0timesand78.5%，84.8%（P<0.05）.Comparedwiththe5μmol/LAlisertib
（P<0.001），whiletheapoptoticrateofCaco⁃sion
decreaseto70.9%，66.3%and85.2%，27.2%（P<0.01），whiletheratioofp38/p38andLC3⁃Ⅱ/LC3⁃I
group，10μmol/LSB202190+5μmol/LAlisertibincreasedtheapoptoticrateofHT29cellsby64.7%
Alisertib
inducesautophagyinCaco⁃2andHT29cellsbyinhibitingPI3K/tibacti⁃
cells，whichmayberelatedtotheexpresionofp53protein.
vatesthep38MAPKsignalingpathwayinHT29butinhibitsthep38MAPKsignalingpathwayinCaco⁃2
［Keywords］Alisertib；AuroraA；p53；colorectalcancer；autophagy
在世界范围内结直肠癌（CRC）是最常见的
恶性肿瘤之一，发病率居第三位，死亡率居第二
位
［1］
，尤其晚期结直肠癌的治疗效果不佳，仍缺乏
有效的靶向药物。Alisertib是第二代AuroraA激
酶（AURKA）抑制剂，研究发现对胶质母细胞瘤、
膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤具有抑制细胞
增殖和阻止细胞周期发展的作用
［2-4］
。但Alisertib
对CRC的诱导细胞自噬的作用尚不清楚。p53是
一种抑癌基因，在CRC的肿瘤形成机制中发挥重
要作用，其与Alisertib的诱导细胞自噬的作用的关
系值得研究。本研究应用Caco⁃2和HT29细胞进
行实验，探讨ALS对不同p53表达状态的CRC细
胞的诱导细胞自噬的作用。
基，于5%CO
2
、37℃及95%空气的恒温细胞培养箱
中进行细胞培养。
1.3流式细胞术检测细胞自噬率、凋亡率
3×10
5
及6×10
5
个/培养皿接种于60mm培养皿，24h
10μmol/LSB202190处理细胞，1h后再用5μmol/L
取对数生长期的Caco⁃2和HT29细胞按密度
后用0.1、1、5μmol/LAlisertib处理细胞，或先用
Alisertib处理细胞。对照组为同浓度的二甲基亚砜
盒或膜联蛋白V：藻红蛋白（PE）凋亡检测试剂盒说
明书处理细胞，流式细胞仪检测自噬率、凋亡率。
1.4
表达
WesternBlotting法检测细胞相关调节蛋白的
（DMSO）。作用24h后按照Cyto⁃ID
®
自噬检测试剂
1
1.1
材料与方法
Alisertib、SB202190（选择性p38MAPK抑制剂
主要试剂和仪器
3×10
5
及6×10
5
个/培养皿接种于60mm培养皿，24h
后用0.1、1、5μmol/LAlisertib处理细胞，作用48h
后按照WesternBlotting试剂盒说明书处理。
1.6统计学方法
取对数生长期的Caco⁃2和HT29细胞按密度
和自噬诱导剂）购自美国Selleckchem公司；Cyto⁃ID
®
自噬检测试剂盒及膜联蛋白V：藻红蛋白（PE）凋
亡检测试剂盒购自美国EnzoLifeSciences公司；
p53、p⁃PI3K（Tyr458）、PI3K、p⁃p38MAPK（Thr180/
Tyr182）、p38MAPK、p⁃Akt（Ser473）、Akt、LC3⁃I/II、
WesternBlotting底物购自美国CellSignalingTech⁃
nology公司。凝胶成像系统4000RPRO（美国Ko⁃
箱（美国ThermoFisher公司）。
1.2细胞培养
dak公司），流式细胞仪（美国BD公司），细胞培养
Caco⁃2和HT29细胞来自美国ATCC。用含
WesterBlotting条带进行灰度值测量，测算各蛋
白相对表达水平。余数据用均数±标准差（Mean±
SD）表示。多重比较应用Prism软件通过单因素方
以P<0.05为差异有统计学意义。
以β⁃actin作为内参，应用ImageLab软件对
差分析（ANOVA），然后进行Tukey的多重比较。
2
2.1
结果
10%热灭活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培养
自噬
Alisertib诱导了Caco⁃2和HT29细胞发生细胞
对照组Caco⁃2细胞自噬率为8.1%，实验组
84
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
0.1μmol/LAlisertib组和1μmol/LAlisertib组细胞自
对照组HT29细胞自噬率为7.3%，实验组1μmol/L
250
200
Caco⁃2
150
100
50
010
2
10
3
10
4
10
5
250
200
150
100
50
010
2
10
3
噬率增加，分别为26.4%和26.8%（P<0.01，图1）。
Alisertib组和5μmol/LAlisertib组细胞自噬率增加，
分别为36.8%和42.6%（P<0.01，图1）。
250
200
150
100
50
010
2
10
3
10
4
10
5
250
200
150
100
50
010
2
10
3
10
4
10
5
N
u
m
b
e
r
（
×
1
0
3
）
250
200
150
100
50
250
200
150
100
50
10
4
10
5
250
200
150
100
50
250
200
150
100
50
HT29
ALS（μmol/L）
10
1
10
2
10
3
0
10
4
10
5
10
1
10
2
FL（Cyto⁃ID
®
）
10
3
0.1
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
1
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
5
10
4
10
5
图1ALS诱导Caco⁃2和HT29细胞发生自噬
将Caco⁃2和HT29细胞暴露于0.1、1和5μmol/LALS24h，然后进行流式细胞术分
析。流式细胞斑点图显示通过Cyto⁃ID染色的发生自噬的Caco⁃2和HT29细胞
2.2
Akt和p38
Alisertib调节Caco⁃2和HT29细胞中的PI3K/
MAPK信号通路
ALS（μmol/L）
p53
p⁃PI3K（Tyr458）
PI3K
p⁃Akt（Ser473）
Akt
p⁃p38MAPK（Tyr180/Tyr182）
p38MAPK
LC3⁃I
LC3⁃II
β⁃Actin
00.1
Caco⁃2
15
53kDa
110kDa
110kDa
60kDa
60kDa
40kDa
40kDa
18kDa
16kDa
45kDa
Alisertib组Caco⁃2细胞的p⁃PI3K/PI3K的比值分别
降低为对照组的62.6%和45.2%；0.1μmol/LAlisertib
组、1μmol/LAlisertib组和5μmol/LAlisertib组
50.4%、30.1%和38.2%（P<0.01，图2）；1μmol/LAlisertib
Caco⁃2细胞p⁃Akt/Akt的比值分别降低为对照组的
组和5μmol/LAlisertib组Caco⁃2细胞的p⁃p38/p38
的比值分别降低为对照组的49.0%和30.4%（图2）。
并且0.1μmol/LALS组、1μmol/LALS组和5μmol/L
分别升高67.3%、32.6%和46.8%（P<0.01，图2）。
ALS组Caco⁃2细胞LC3⁃Ⅱ/LC3⁃I的比值较对照组
在Caco⁃2细胞中p53蛋白表达缺失（图3）。而
在HT29细胞中，1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
1.4倍和1.5倍（P<0.05，图3）。
Alisertib组p53蛋白的表达水平升高为对照组的
Alisertib组HT29细胞的p⁃PI3K/PI3K的比值分别降
低为对照组的70.9%和66.3%（P<0.001，图3）；0.1
μmol/LAlisertib组、1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
Alisertib组HT29细胞的p⁃Akt/Akt的比值分别降低
0.1μmol/LAlisertib组、1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
与对照组比较，1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
图2
与对照组比较，1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
ALS对Caco⁃2细胞中自噬通路上关键调节蛋白分子
ALS处理Caco⁃2细胞后通过WesternBlot⁃
的表达水平的影响
ting法测定PI3K、Akt、p38MAPK蛋白表达水平及磷酸化水平，以
及LC3⁃I和LC3⁃II的蛋白表达水平，上图为蛋白表达的代表性印
迹条带
为对照组的81.4%、85.2%和27.2%（P<0.01，图3）；
Alisertib组HT29细胞的p⁃p38/p38的比值较对照
组分别升高62.7%、2.1倍和2.0倍（P<0.05，图3）；
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
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1
LC3⁃Ⅱ/LC3⁃I
μmol/LALS组和5μmol/LALS组HT29细胞的
84.8%（P<0.01
的比值较对照组分别升高
，图3）。
78.5%和
ALS（μmol/L）00.1
HT29
15
p53
53kDa
p⁃PI3K（Tyr458）
110kDa
PI3K
110kDa
p⁃Akt（Ser473）
60kDa
Akt
60kDa
p⁃p38MAPK（Tyr180/Tyr182）
40kDa
p38MAPK
40kDa
LC3⁃II
LC3⁃I
18
16
kDa
kDa
β⁃Actin
45kDa
图3ALS对HT29细胞中自噬通路上关键调节蛋白分子
的表达水平的影响
ALS处理HT29细胞后通过WesternBlot⁃
ting
及LC3⁃I
法测定
和
PI3K
LC3⁃II
、Akt
的蛋白表达水平，
、p38MAPK蛋白表达水平及磷酸化水平，
上图为蛋白表达的代表性印
以
迹条带
2.3
亡和自噬之间存在交互影响
在HT29和Caco⁃2细胞中Alisertib诱导的凋
在HT29和Caco⁃2细胞中，与5μmol/LAlisertib
组比较，10μmol/LSB202190+5μmol/LAlisertib组
细胞自噬率升高，分别较5μmol/LAlisertib组细胞
自噬率升高88.8%和86.6%（P<0.001）。
10μmol/L
在HT29
SB202190+5
细胞中，与
μmol/L
5μmol/L
Alisertib
Alisertib
组
组比较，
亡率升高64.7%（P<0.001）。而在Caco⁃2细胞中，
细胞凋
10
Alisertib
μmol/L
组的细胞凋亡率无明显变化。
SB202190+5μmol/LAlisertib组较5μmol/L
3讨论
结直肠癌现有的治疗措施包括外科手术、放
疗、化疗等，但晚期结直肠癌患者总体治疗效果较
差，亟需新的精准的靶向药物治疗。Alisertib（ALS）
是选择性抑制AuroraA激酶的小分子药物，对前列
腺癌等实体瘤、白血病有很强的抗癌作用
［5，6］
。ALS
是否引起CRC细胞自噬性死亡值得进一步研究。
自噬是一种细胞内的分解代谢的过程。损坏
的、功能失调的或过剩的细胞器和蛋白被吞噬、重
利用以维持细胞正常的代谢、生存和内稳定
［7］
。
过度自噬可导致细胞死亡。在某些条件下，自噬
通过增加程序性细胞死亡来抑制肿瘤形成
［8］
。有
多个通路参与调节细胞自噬，包括正向调节通路
（PI3K/Akt和p38MAPK信号通路），发挥抑制自噬
的作用，以及负向调节通路（AMPK和p53信号通
路），发挥促进自噬的作用
［9-11］
。
1
本研究显示实验组0.1μmol/LAlisertib组和
加，
μmol/L
Alisertib
分别为
Alisertib
组和
26.4%
5μmol/L
和
组较对照组
26.8%
Alisertib
，同样地，
Caco⁃2
组较对照组
实验组
细胞自噬率增
1μmol/L
细胞自噬率增加，分别为36.8%和42.6%。提示
HT29
ALS
诱导了Caco⁃2和HT29细胞发生自噬。进一步检
测细胞自噬通路上的关键蛋白分子的表达情况，
发现在分子水平ALS引起Caco⁃2和HT29和细胞
的
LC3⁃I
p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt比值明显降低，LC3⁃II/
的潜在分子学机制可能为对
的比值明显升高。这些结果表明引起自噬
PI3K/Akt/mTOR信号
的抑制。有趣的是，ALS对p38MAPK信号通路的
修饰作用有所不同，引起Caco⁃2的p⁃p38/p38的比
值下降，而HT29的p⁃p38/p38比值升高。这一现
象可能与
p38
中，其上游调节因子及下游靶点随着细胞类型及
α、p38
p38
β、p38γ
MAPK
和
有四个不同的亚型有关，
p38δ。研究显示在哺乳动物
包括
刺激因子的不同而不同
［12］
p53
变，
基因没有突变，
并且不能表达p53
而Caco⁃2
。此外，HT29细胞的
蛋白。这些特征可能引起
细胞的p53基因有突
两个细胞系的p38MAPK信号通路产生不同的变
化。其他研究显示，在胃癌细胞
［13］
、胰腺癌细胞
［3］
、
骨肉瘤细胞
［14］
、乳腺癌细胞
［15］
和卵巢癌细胞
［4］
Alisertib
或Erk1/2
可能通过抑制
信号通路而激活
PI3K/Akt/mTOR
AMPK信号通路促进了
、p38MAPK
中
细胞自噬。
细胞自噬和凋亡均是高度保守和严密调节的
细胞过程，通常这两个生物学过程包含相似的调
节通路，甚至共享相同的启动子和效应子。越来
越多的证据表明，自噬和凋亡的交互作用可协同
影响以使细胞选择二者中的某一途径，决定细胞
的命运，
SB202190
以达到内部平衡。我们的研究通过应用
剂）
Caco⁃2
进行干预，
（选择性p38MAPK抑制剂和自噬诱导
和HT29
结果表明自噬诱导剂
细胞中均增强了Alisertib
SB202190
诱导的细
在
86
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
胞自噬，但在HT29细胞中明显增强了Alisertib诱
导的细胞凋亡，而在Caco⁃2细胞中，细胞凋亡率无
明显变化。这些对细胞自噬和凋亡的差异效应可
能取决于细胞类型的差异。由此可以推测，某些
重要的调节分子和信号通路协同介导了这一复杂
的
p38
凋
MAPK
亡和自噬之间的交互作用，包括
综上所述，
信号通路及
PI3K/Akt、
Alisertib
p53
诱导了
是否表达。
Caco⁃2和HT29细
胞发生细胞自噬。此过程涉及了多个信号通路的
参与，包括PI3K/Akt、p38MAPK信号通路，并可能
与p53蛋白是否表达有关。Alisertib可能代表了
一类新的有潜力的治疗CRC的靶向药物。
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［9］agy：renovationofcells
［10］Danial
andtissues
NN
［
，
J
Korsmeyer
］.Cell，2011
SJ.
，
Cell
147（
death
4）：728⁃41.
：criticalcontrolpoints
［J］.Cell，2004，116（2）：205⁃219.
［11］AlersS，LofflerAS，WesselborgS，AMPK⁃mTOR
⁃
and
Ulk1/2
feedbacks
inthe
［
regulation
J］.MolCell
of
Biol
autophagy
，2012
：
，
cross
32（1）
talk
：2⁃11.
，shortcuts，
［12］TangG，YueZ，TalloczyZ，agyinducedbyAlex⁃
ander
MAPK
disease⁃mutant
andmTOR
GFAPaccumulationisregulatedbyp38/
［13］
2008
Yuan
，
CX
17（
，
11
Zhou
）：1540⁃1555.
signalingpathways［J］.HumMolGenet，
ZW，YangYX，tionofmitoticAu⁃
rora
human
kinaseAbyalisertibinducesapoptosis
N78cells
and
［J
autophagy
］.DrugDes
of
［14］
Devel
NiuNK
Ther
gastric
，Wang
，2015
cancer
ZL
，
，
9：
AGS
Pan
487⁃508.
andNCI⁃
ST，⁃apoptoticandpro⁃au⁃
（
tophagic
MLN8237
effects
）onhuman
ofthe
osteosarcoma
Aurorakinase
U⁃2
A
OS
inhibitor
andMG⁃63
alisertib
cells
through
hibition
the
ofp38
activation
MAPK/PI3K/Akt/mTOR
ofmitochondria⁃mediated
signaling
pathway
pathway
and
［J
in⁃
DrugDesDevelTher，2015，9：1555⁃1584.
］.
［15］LiJP，YangYX，LiuQL，estigationalAuroraki⁃
nase
arrest
Ainhibitoralisertib（
mTOR
，
signaling
apoptosis，
pathways
andautophagy
MLN8237）
inhuman
via
induces
breast
p38
cancer
MAPK
cellcycle
cells
and
G2/M
［
Akt/
DrugDesDevelTher，2015，9：1627⁃52.
J］.
（收稿日期：2020-08-16）
2024年6月5日发(作者：夔寰)
82
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
AuroraA激酶抑制剂Alisertib诱导结直肠
癌细胞自噬的作用及与p53表达间的关系
任宝军
1
，剧永乐
1
，封静
1
，陈淑香
2
，刘家旋
1
，罗振涛
1
，王家智
1
，杨帆
1
，
李德智
1
，董博业
1
，耿岩
1*
［摘要］目的探讨Alisertib（ALS）对人结直肠癌Caco⁃2和HT29细胞的诱导自噬的作用及与
本研究采用人结直肠癌Caco⁃2和HT29细胞进行实验。实验组p53表达状态间的关系。方法
用0.1、1、5μmol/LALS而对照组用同浓度的DMSO处理细胞。流式细胞术检测细胞的自噬率，
WesterBlotting法检测细胞自噬过程中关键调节分子的蛋白表达。结果与对照组比较，0.1、
1μmol/LAlisertib组Caco⁃2细胞自噬率增加，分别为26.4%和26.8%（P<0.01）。1、5μmol/LALS组
HT29细胞自噬率增加，分别为36.8%和42.6%（P<0.01）。Caco⁃2细胞不表达p53蛋白，而HT29细
胞表达p53蛋白。与对照组比较，1、5μmol/LAlisertib引起Caco⁃2细胞的p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt
和p⁃p38/p38的比值分别降低为对照组的62.6%、45.2%，30.1%、38.2%和49.0%、30.4%（P<0.01），
LC3⁃Ⅱ/LC3⁃I的比值升高32.6%、46.8%（P<0.01）。与对照组比较，1、5μmol/LAlisertib引起HT29细
p⁃p38/p38和LC3⁃II/LC3⁃I的比值升高2.1倍、2.0倍和78.5%、84.8%（P<0.05）。与5μmol/LAlisertib
Caco⁃2细胞凋亡率无明显变化。结论
胞的p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt的比值分别降低为对照组的70.9%、66.3%和85.2%、27.2%（P<0.01），
组比较，10μmol/LSB202190+5μmol/LAlisertib引起HT29细胞凋亡率升高64.7%（P<0.001），而
细胞发生细胞自噬。Alisertib对p38MAPK信号通路的影响不同，激活了HT29而抑制了Caco⁃2
细胞的p38MAPK信号通路，可能与p53蛋白是否表达有关。
［关键词］Alisertib；AuroraA；p53；结直肠癌；自噬
doi：10.3969/.1009⁃976X.2021.01.014中图分类号：R735.3+5；R735.3+7文献标识码：A
Alisertib抑制了PI3K/Akt信号通路，诱导了Caco⁃2和HT29
Alisertib，anAuroraaKinaseinhibitor，inducesautophagyofcolorectalcancercellsanditsrela⁃
tionshipwithp53expression
RENBao⁃jun
1
，
JUYong⁃le
1
，
FENGJing
1
，
CHENShu⁃xiang
2
，
LIUJia⁃xuan
1
，
LUOZhen⁃tao
1
，
WANG
Jia⁃zhi
1
，
YANGFan
1
，
LIDe⁃zhi
1
，
DONGBo⁃ye
，
GENGYan
1
mentofGastrointestinalSurgery
，
ShundeHospital
，
SouthernMedicalUniversity
，
Shunde
（
The
FirstPeople
′
sHospitalofShunde
），
Guangdong528308
，
China
；2.
DepartmentofAnesthesia
，
Shunde
Hospital
，
SouthernMedicalUniversity
（
TheFirstPeople′sHospitalofShunde
），
Shunde
，
Guangdong
528308
，
China
Correspondingauthor
：
GENGYan
，
******************
［Abstract］ObjectiveToexploretheeffectofAlisertib（ALS）onhumancolorectalcancerCaco⁃2
InthisandHT29cs
study，humancolorectalcancerCaco⁃erimental
teinexpression
levelsofkeyregulatorymoleculesintheprocessofcellautophagywereexaminedbywesterblotting.
groupsweretreatedwith0.1，1，and5μmol/LALSandthecontrolgroupwastreatedwiththesamecon⁃
基金项目：广东省医学科学技术研究基金（A2018150）；佛山市医学类科技攻关项目（2017AB003533）；南方医科大学顺德医院科研
启动计划项目（SRSP2018002）；佛山市医学骨干人才项目（耿岩）
作者单位：1.南方医科大学顺德医院（佛山市顺德区第一人民医院）胃肠外科，广东顺德528308；2.南方医科大学顺德医院（佛山市
顺德区第一人民医院）麻醉手术室，广州528308
*通信作者：耿岩，E⁃mail：******************
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
83
Results
Alisertibgroupsincreasedto26.4%and26.8%（P<0.01）.TheautophagyrateofHT29cellsinthe1and
Comparedwiththecontrolgroup，theautophagyrateofCaco⁃2cellsinthe0.1and1μmol/L
5μmol/LALSgroupsincreasedto36.8%and42.6%（P<0.01）.Caco⁃2cellsdidnotexpressp53protein，
edwiththecontrolgroup，theratioofp⁃PI3K/PI3K，
p⁃Akt/Aktandp⁃p38/p38inCaco⁃2cellsaftertreatmentwith1，5μmol/Lalisertibdecreasedto62.6%，
45.2%，30.1%，38.2%and49.0%，30.4%（P<0.01），whiletheratioofLC3⁃II/LC3⁃Iincreasedby32.6%，
46.8%（P<0.01）.1，5μmol/LAlisertibcausedthep⁃PI3K/PI3Kandp⁃Akt/AktratiosofHT29cellsto
increasedby2.1times，2.0timesand78.5%，84.8%（P<0.05）.Comparedwiththe5μmol/LAlisertib
（P<0.001），whiletheapoptoticrateofCaco⁃sion
decreaseto70.9%，66.3%and85.2%，27.2%（P<0.01），whiletheratioofp38/p38andLC3⁃Ⅱ/LC3⁃I
group，10μmol/LSB202190+5μmol/LAlisertibincreasedtheapoptoticrateofHT29cellsby64.7%
Alisertib
inducesautophagyinCaco⁃2andHT29cellsbyinhibitingPI3K/tibacti⁃
cells，whichmayberelatedtotheexpresionofp53protein.
vatesthep38MAPKsignalingpathwayinHT29butinhibitsthep38MAPKsignalingpathwayinCaco⁃2
［Keywords］Alisertib；AuroraA；p53；colorectalcancer；autophagy
在世界范围内结直肠癌（CRC）是最常见的
恶性肿瘤之一，发病率居第三位，死亡率居第二
位
［1］
，尤其晚期结直肠癌的治疗效果不佳，仍缺乏
有效的靶向药物。Alisertib是第二代AuroraA激
酶（AURKA）抑制剂，研究发现对胶质母细胞瘤、
膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤具有抑制细胞
增殖和阻止细胞周期发展的作用
［2-4］
。但Alisertib
对CRC的诱导细胞自噬的作用尚不清楚。p53是
一种抑癌基因，在CRC的肿瘤形成机制中发挥重
要作用，其与Alisertib的诱导细胞自噬的作用的关
系值得研究。本研究应用Caco⁃2和HT29细胞进
行实验，探讨ALS对不同p53表达状态的CRC细
胞的诱导细胞自噬的作用。
基，于5%CO
2
、37℃及95%空气的恒温细胞培养箱
中进行细胞培养。
1.3流式细胞术检测细胞自噬率、凋亡率
3×10
5
及6×10
5
个/培养皿接种于60mm培养皿，24h
10μmol/LSB202190处理细胞，1h后再用5μmol/L
取对数生长期的Caco⁃2和HT29细胞按密度
后用0.1、1、5μmol/LAlisertib处理细胞，或先用
Alisertib处理细胞。对照组为同浓度的二甲基亚砜
盒或膜联蛋白V：藻红蛋白（PE）凋亡检测试剂盒说
明书处理细胞，流式细胞仪检测自噬率、凋亡率。
1.4
表达
WesternBlotting法检测细胞相关调节蛋白的
（DMSO）。作用24h后按照Cyto⁃ID
®
自噬检测试剂
1
1.1
材料与方法
Alisertib、SB202190（选择性p38MAPK抑制剂
主要试剂和仪器
3×10
5
及6×10
5
个/培养皿接种于60mm培养皿，24h
后用0.1、1、5μmol/LAlisertib处理细胞，作用48h
后按照WesternBlotting试剂盒说明书处理。
1.6统计学方法
取对数生长期的Caco⁃2和HT29细胞按密度
和自噬诱导剂）购自美国Selleckchem公司；Cyto⁃ID
®
自噬检测试剂盒及膜联蛋白V：藻红蛋白（PE）凋
亡检测试剂盒购自美国EnzoLifeSciences公司；
p53、p⁃PI3K（Tyr458）、PI3K、p⁃p38MAPK（Thr180/
Tyr182）、p38MAPK、p⁃Akt（Ser473）、Akt、LC3⁃I/II、
WesternBlotting底物购自美国CellSignalingTech⁃
nology公司。凝胶成像系统4000RPRO（美国Ko⁃
箱（美国ThermoFisher公司）。
1.2细胞培养
dak公司），流式细胞仪（美国BD公司），细胞培养
Caco⁃2和HT29细胞来自美国ATCC。用含
WesterBlotting条带进行灰度值测量，测算各蛋
白相对表达水平。余数据用均数±标准差（Mean±
SD）表示。多重比较应用Prism软件通过单因素方
以P<0.05为差异有统计学意义。
以β⁃actin作为内参，应用ImageLab软件对
差分析（ANOVA），然后进行Tukey的多重比较。
2
2.1
结果
10%热灭活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培养
自噬
Alisertib诱导了Caco⁃2和HT29细胞发生细胞
对照组Caco⁃2细胞自噬率为8.1%，实验组
84
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
0.1μmol/LAlisertib组和1μmol/LAlisertib组细胞自
对照组HT29细胞自噬率为7.3%，实验组1μmol/L
250
200
Caco⁃2
150
100
50
010
2
10
3
10
4
10
5
250
200
150
100
50
010
2
10
3
噬率增加，分别为26.4%和26.8%（P<0.01，图1）。
Alisertib组和5μmol/LAlisertib组细胞自噬率增加，
分别为36.8%和42.6%（P<0.01，图1）。
250
200
150
100
50
010
2
10
3
10
4
10
5
250
200
150
100
50
010
2
10
3
10
4
10
5
N
u
m
b
e
r
（
×
1
0
3
）
250
200
150
100
50
250
200
150
100
50
10
4
10
5
250
200
150
100
50
250
200
150
100
50
HT29
ALS（μmol/L）
10
1
10
2
10
3
0
10
4
10
5
10
1
10
2
FL（Cyto⁃ID
®
）
10
3
0.1
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
1
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
5
10
4
10
5
图1ALS诱导Caco⁃2和HT29细胞发生自噬
将Caco⁃2和HT29细胞暴露于0.1、1和5μmol/LALS24h，然后进行流式细胞术分
析。流式细胞斑点图显示通过Cyto⁃ID染色的发生自噬的Caco⁃2和HT29细胞
2.2
Akt和p38
Alisertib调节Caco⁃2和HT29细胞中的PI3K/
MAPK信号通路
ALS（μmol/L）
p53
p⁃PI3K（Tyr458）
PI3K
p⁃Akt（Ser473）
Akt
p⁃p38MAPK（Tyr180/Tyr182）
p38MAPK
LC3⁃I
LC3⁃II
β⁃Actin
00.1
Caco⁃2
15
53kDa
110kDa
110kDa
60kDa
60kDa
40kDa
40kDa
18kDa
16kDa
45kDa
Alisertib组Caco⁃2细胞的p⁃PI3K/PI3K的比值分别
降低为对照组的62.6%和45.2%；0.1μmol/LAlisertib
组、1μmol/LAlisertib组和5μmol/LAlisertib组
50.4%、30.1%和38.2%（P<0.01，图2）；1μmol/LAlisertib
Caco⁃2细胞p⁃Akt/Akt的比值分别降低为对照组的
组和5μmol/LAlisertib组Caco⁃2细胞的p⁃p38/p38
的比值分别降低为对照组的49.0%和30.4%（图2）。
并且0.1μmol/LALS组、1μmol/LALS组和5μmol/L
分别升高67.3%、32.6%和46.8%（P<0.01，图2）。
ALS组Caco⁃2细胞LC3⁃Ⅱ/LC3⁃I的比值较对照组
在Caco⁃2细胞中p53蛋白表达缺失（图3）。而
在HT29细胞中，1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
1.4倍和1.5倍（P<0.05，图3）。
Alisertib组p53蛋白的表达水平升高为对照组的
Alisertib组HT29细胞的p⁃PI3K/PI3K的比值分别降
低为对照组的70.9%和66.3%（P<0.001，图3）；0.1
μmol/LAlisertib组、1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
Alisertib组HT29细胞的p⁃Akt/Akt的比值分别降低
0.1μmol/LAlisertib组、1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
与对照组比较，1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
图2
与对照组比较，1μmol/LAlisertib组和5μmol/L
ALS对Caco⁃2细胞中自噬通路上关键调节蛋白分子
ALS处理Caco⁃2细胞后通过WesternBlot⁃
的表达水平的影响
ting法测定PI3K、Akt、p38MAPK蛋白表达水平及磷酸化水平，以
及LC3⁃I和LC3⁃II的蛋白表达水平，上图为蛋白表达的代表性印
迹条带
为对照组的81.4%、85.2%和27.2%（P<0.01，图3）；
Alisertib组HT29细胞的p⁃p38/p38的比值较对照
组分别升高62.7%、2.1倍和2.0倍（P<0.05，图3）；
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
85
1
LC3⁃Ⅱ/LC3⁃I
μmol/LALS组和5μmol/LALS组HT29细胞的
84.8%（P<0.01
的比值较对照组分别升高
，图3）。
78.5%和
ALS（μmol/L）00.1
HT29
15
p53
53kDa
p⁃PI3K（Tyr458）
110kDa
PI3K
110kDa
p⁃Akt（Ser473）
60kDa
Akt
60kDa
p⁃p38MAPK（Tyr180/Tyr182）
40kDa
p38MAPK
40kDa
LC3⁃II
LC3⁃I
18
16
kDa
kDa
β⁃Actin
45kDa
图3ALS对HT29细胞中自噬通路上关键调节蛋白分子
的表达水平的影响
ALS处理HT29细胞后通过WesternBlot⁃
ting
及LC3⁃I
法测定
和
PI3K
LC3⁃II
、Akt
的蛋白表达水平，
、p38MAPK蛋白表达水平及磷酸化水平，
上图为蛋白表达的代表性印
以
迹条带
2.3
亡和自噬之间存在交互影响
在HT29和Caco⁃2细胞中Alisertib诱导的凋
在HT29和Caco⁃2细胞中，与5μmol/LAlisertib
组比较，10μmol/LSB202190+5μmol/LAlisertib组
细胞自噬率升高，分别较5μmol/LAlisertib组细胞
自噬率升高88.8%和86.6%（P<0.001）。
10μmol/L
在HT29
SB202190+5
细胞中，与
μmol/L
5μmol/L
Alisertib
Alisertib
组
组比较，
亡率升高64.7%（P<0.001）。而在Caco⁃2细胞中，
细胞凋
10
Alisertib
μmol/L
组的细胞凋亡率无明显变化。
SB202190+5μmol/LAlisertib组较5μmol/L
3讨论
结直肠癌现有的治疗措施包括外科手术、放
疗、化疗等，但晚期结直肠癌患者总体治疗效果较
差，亟需新的精准的靶向药物治疗。Alisertib（ALS）
是选择性抑制AuroraA激酶的小分子药物，对前列
腺癌等实体瘤、白血病有很强的抗癌作用
［5，6］
。ALS
是否引起CRC细胞自噬性死亡值得进一步研究。
自噬是一种细胞内的分解代谢的过程。损坏
的、功能失调的或过剩的细胞器和蛋白被吞噬、重
利用以维持细胞正常的代谢、生存和内稳定
［7］
。
过度自噬可导致细胞死亡。在某些条件下，自噬
通过增加程序性细胞死亡来抑制肿瘤形成
［8］
。有
多个通路参与调节细胞自噬，包括正向调节通路
（PI3K/Akt和p38MAPK信号通路），发挥抑制自噬
的作用，以及负向调节通路（AMPK和p53信号通
路），发挥促进自噬的作用
［9-11］
。
1
本研究显示实验组0.1μmol/LAlisertib组和
加，
μmol/L
Alisertib
分别为
Alisertib
组和
26.4%
5μmol/L
和
组较对照组
26.8%
Alisertib
，同样地，
Caco⁃2
组较对照组
实验组
细胞自噬率增
1μmol/L
细胞自噬率增加，分别为36.8%和42.6%。提示
HT29
ALS
诱导了Caco⁃2和HT29细胞发生自噬。进一步检
测细胞自噬通路上的关键蛋白分子的表达情况，
发现在分子水平ALS引起Caco⁃2和HT29和细胞
的
LC3⁃I
p⁃PI3K/PI3K、p⁃Akt/Akt比值明显降低，LC3⁃II/
的潜在分子学机制可能为对
的比值明显升高。这些结果表明引起自噬
PI3K/Akt/mTOR信号
的抑制。有趣的是，ALS对p38MAPK信号通路的
修饰作用有所不同，引起Caco⁃2的p⁃p38/p38的比
值下降，而HT29的p⁃p38/p38比值升高。这一现
象可能与
p38
中，其上游调节因子及下游靶点随着细胞类型及
α、p38
p38
β、p38γ
MAPK
和
有四个不同的亚型有关，
p38δ。研究显示在哺乳动物
包括
刺激因子的不同而不同
［12］
p53
变，
基因没有突变，
并且不能表达p53
而Caco⁃2
。此外，HT29细胞的
蛋白。这些特征可能引起
细胞的p53基因有突
两个细胞系的p38MAPK信号通路产生不同的变
化。其他研究显示，在胃癌细胞
［13］
、胰腺癌细胞
［3］
、
骨肉瘤细胞
［14］
、乳腺癌细胞
［15］
和卵巢癌细胞
［4］
Alisertib
或Erk1/2
可能通过抑制
信号通路而激活
PI3K/Akt/mTOR
AMPK信号通路促进了
、p38MAPK
中
细胞自噬。
细胞自噬和凋亡均是高度保守和严密调节的
细胞过程，通常这两个生物学过程包含相似的调
节通路，甚至共享相同的启动子和效应子。越来
越多的证据表明，自噬和凋亡的交互作用可协同
影响以使细胞选择二者中的某一途径，决定细胞
的命运，
SB202190
以达到内部平衡。我们的研究通过应用
剂）
Caco⁃2
进行干预，
（选择性p38MAPK抑制剂和自噬诱导
和HT29
结果表明自噬诱导剂
细胞中均增强了Alisertib
SB202190
诱导的细
在
86
岭南现代临床外科2021年2月第21卷第1期LingnanModernClinicsinSurgery，February.2021，Vol.21No.1
胞自噬，但在HT29细胞中明显增强了Alisertib诱
导的细胞凋亡，而在Caco⁃2细胞中，细胞凋亡率无
明显变化。这些对细胞自噬和凋亡的差异效应可
能取决于细胞类型的差异。由此可以推测，某些
重要的调节分子和信号通路协同介导了这一复杂
的
p38
凋
MAPK
亡和自噬之间的交互作用，包括
综上所述，
信号通路及
PI3K/Akt、
Alisertib
p53
诱导了
是否表达。
Caco⁃2和HT29细
胞发生细胞自噬。此过程涉及了多个信号通路的
参与，包括PI3K/Akt、p38MAPK信号通路，并可能
与p53蛋白是否表达有关。Alisertib可能代表了
一类新的有潜力的治疗CRC的靶向药物。
参考文献
［1］BrayF，FerlayJ，SoerjomataramI，cancerstatis⁃
tics
worldwide
2018：GLOBOCAN
cancers
estimates
in185countries
ofincidence
［J］.
and
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mortality
Clin，2018，
for
68（
36
6）：394⁃424.
J
［2］KogisoM，QiL，BraunFK，rentInhibitionof
Neurosphere
AuroraAInhibitor
andMonolayer
［J］.
MLN8237
Cells
ClinCancer
Predicted
ofPediatric
Res，2018
Survival
Glioblastomaby
，24（
Extension
9）：2159
in
2170.
PDOXModels⁃
［3］WangF，LiH，YanXG，tibinducescellcyclear⁃
rest
transition
andautophagyandsuppressesepithelial⁃to⁃mesenchymal
nalingpathways
involving
inhuman
PI3K/Akt/mTOR
pancreatic
andsirtuin1⁃mediatedsig⁃
［4］
Devel
DingYH
Ther
，
，
Zhou
2015
ZW
，9：
，
575⁃601.
cancercells［J］.DrugDes
HaCF，tib，anAuroraki⁃
nase
epithelial
Ainhibitor，inducesapoptosisand
［5］
cancer
Mosse
cells
to
YP，
［
mesenchymal
Fox
J］.Drug
E，Teachey
Des
transition
Devel
DT
Ther
inhuman
autophagy
epithelial
butinhibits
ovarian
，et
，
al.
2015
A
，
Phase
9：425⁃64.
IIStudyof
Alisertib
Leukemia
in
tium（ADVL0921
：Children's
Childrenwith
）［J］
Oncology
Recurrent/Refractory
.ClinCancer
Group
Res
Phase
，2019
Iand
Solid
，25
Pilot
Tumorsor
（11）
Consor⁃
：3229
［6］
⁃3238.
BeltranH，OromendiaC，DanilaDC，IITrialof
the
tion
Aurora
and
⁃
Biomarkers
resistant
Kinase
［
and
A
J］.
Neuroendocrine
InhibitorAlisertib
ClinCancerRes
Prostate
forPatients
，2019，
Cancer
with
25（1）：
：
43⁃51.
Efficacy
Castra⁃
［7］agyasaregulatedpathwayof
cellular
1721.
degradation［J］.Science，2000，290（5497）：1717⁃
［8］MathewR，KongaraS，BeaudoinB，agysuppress⁃
es
Genes
tumor
Dev
progression
，2007，21（
by
11）
limiting
：1367⁃1381.
chromosomalinstability［J］.
［9］agy：renovationofcells
［10］Danial
andtissues
NN
［
，
J
Korsmeyer
］.Cell，2011
SJ.
，
Cell
147（
death
4）：728⁃41.
：criticalcontrolpoints
［J］.Cell，2004，116（2）：205⁃219.
［11］AlersS，LofflerAS，WesselborgS，AMPK⁃mTOR
⁃
and
Ulk1/2
feedbacks
inthe
［
regulation
J］.MolCell
of
Biol
autophagy
，2012
：
，
cross
32（1）
talk
：2⁃11.
，shortcuts，
［12］TangG，YueZ，TalloczyZ，agyinducedbyAlex⁃
ander
MAPK
disease⁃mutant
andmTOR
GFAPaccumulationisregulatedbyp38/
［13］
2008
Yuan
，
CX
17（
，
11
Zhou
）：1540⁃1555.
signalingpathways［J］.HumMolGenet，
ZW，YangYX，tionofmitoticAu⁃
rora
human
kinaseAbyalisertibinducesapoptosis
N78cells
and
［J
autophagy
］.DrugDes
of
［14］
Devel
NiuNK
Ther
gastric
，Wang
，2015
cancer
ZL
，
，
9：
AGS
Pan
487⁃508.
andNCI⁃
ST，⁃apoptoticandpro⁃au⁃
（
tophagic
MLN8237
effects
）onhuman
ofthe
osteosarcoma
Aurorakinase
U⁃2
A
OS
inhibitor
andMG⁃63
alisertib
cells
through
hibition
the
ofp38
activation
MAPK/PI3K/Akt/mTOR
ofmitochondria⁃mediated
signaling
pathway
pathway
and
［J
in⁃
DrugDesDevelTher，2015，9：1555⁃1584.
］.
［15］LiJP，YangYX，LiuQL，estigationalAuroraki⁃
nase
arrest
Ainhibitoralisertib（
mTOR
，
signaling
apoptosis，
pathways
andautophagy
MLN8237）
inhuman
via
induces
breast
p38
cancer
MAPK
cellcycle
cells
and
G2/M
［
Akt/
DrugDesDevelTher，2015，9：1627⁃52.
J］.
（收稿日期：2020-08-16）