2024年6月14日发(作者：郎晨辰)
伤寒沙门菌和碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制研究
目的:目前,抗生素的滥用使得多重耐药菌正日益增多,威胁着人类的健康。多重耐药的
伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,)和碳青霉烯类耐药肠杆菌
(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE)是可以引起人类严重感染甚至致命的
两类细菌,了解它们的耐药机制对临床感染的预防和监控具有十分重要的意义。
本文首先围绕传统细菌耐药调节子Ram R及Ram A在伤寒沙门菌中的功能展开研究,
旨在探究两者在伤寒沙门菌耐受氨苄西林中的作用。另外,由于近年来碳青霉烯类抗生素在
临床上的广泛使用,使得CRE菌株在全球蔓延,本文拟通过分析中国东部苏州地区的CRE分
子流行病学特征,为本地区CRE感染的治疗和监控提供有力的理论依据。
近年来,质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1的发现并蔓延至CRE菌株预示着泛耐药
菌的出现,引起了全球关注,本文拟分析来自我国六个不同地区的CRE菌株携带mcr-1的分
子特性及其表达特征,为mcr-1耐药机制的深入研究奠定基础。方法:一、伤寒沙门菌中ramR
及ramA对氨苄西林的耐药调控功能研究1、ramR基因缺陷株的制备:PCR扩增ramR上
下游基因片段F1、F2,再将F1和F2连接成ramR的缺损片段F3,将F3与自杀质粒p
GMB151连接以构建重组载体,并电转至野生株GIFU10007,利用自杀质粒上sac
B基因特性筛选ramR基因缺陷变异株(ΔramR)。
2、ramA基因高表达株及空质粒对照株的制备:扩增ramA基因片段并克隆至高表达
质粒p BAD33中,分别将重组质粒p BAD33-ramA和空质粒p BAD33电转至GIFU10007,
即分别为ramA高表达株GIFU10007(p BAD33ramA)和空质粒对照株GIFU10007(p
BAD33)。3、氨苄西林压力下ΔramR和GIFU10007(p BAD33ramA)中ramA的表达分
析:分别提取伤寒沙门菌GIFU10007、ΔramR、GIFU10007(p BAD33ramA)和
GIFU10007(p BAD33)在氨苄西林应激30min后的总RNA,利用q RT-PCR技术测定各菌
株中ramA的表达水平,并比较它们的表达差异。
4、氨苄西林应激下细菌生长曲线的测定:分别测定伤寒沙门菌GIFU10007、ΔramR、
GIFU10007(p BAD33ramA)和GIFU10007(p BAD33)在氨苄西林应激条件下的生长曲线,
比较其生长差异,即对氨苄西林的耐受度差异。二、苏州地区CRE临床菌株的耐药分子流行
病学分析1、菌株鉴定和药敏分析:用Phoenix-100(BD)全自动微生物分析仪对收集的CRE
菌株进行菌种鉴定和药敏分析,并通过PCR扩增16S r RNA和测序比对进行菌种验证。
2、耐药基因的筛选:采用PCR法筛选碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、
bla IMP、blaOXA-48)、超广谱β-内酰胺酶基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM)、Amp C
头孢菌素酶基因(blaCMY、blaACT、blaDHA)和孔道蛋白基因(omp K35/omp F、omp
K36/omp C)等,结果经测序鉴定。3、多位点序列分型(multilocus sequence
typing,MLST):PCR扩增大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属的看家基因,并进行双向测序,
将基因序列上传至MLST数据库网站后获得Sequence Type(ST)分型结果。
4、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析:经上述MLST分析
未获得ST分型的菌株,利用PFGE技术进行分析,调查CRE临床分离株的流行病学相关性。
5、质粒接合转移实验:将受体菌和产碳青霉烯酶的供体菌混合培养进行接合转移试验,再通
过PCR法筛选出阳性接合转移子。
6、S1-PFGE:挑取携带blaKPC的质粒接合转移子进行S1-PFGE实验,分析blaKPC整
合质粒的分子特征。7、质粒序列分析:挑取具有代表性的碳青霉烯酶基因整合的质粒接合
转移子进行质粒序列测定分析。
2024年6月14日发(作者：郎晨辰)
伤寒沙门菌和碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制研究
目的:目前,抗生素的滥用使得多重耐药菌正日益增多,威胁着人类的健康。多重耐药的
伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,)和碳青霉烯类耐药肠杆菌
(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE)是可以引起人类严重感染甚至致命的
两类细菌,了解它们的耐药机制对临床感染的预防和监控具有十分重要的意义。
本文首先围绕传统细菌耐药调节子Ram R及Ram A在伤寒沙门菌中的功能展开研究,
旨在探究两者在伤寒沙门菌耐受氨苄西林中的作用。另外,由于近年来碳青霉烯类抗生素在
临床上的广泛使用,使得CRE菌株在全球蔓延,本文拟通过分析中国东部苏州地区的CRE分
子流行病学特征,为本地区CRE感染的治疗和监控提供有力的理论依据。
近年来,质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1的发现并蔓延至CRE菌株预示着泛耐药
菌的出现,引起了全球关注,本文拟分析来自我国六个不同地区的CRE菌株携带mcr-1的分
子特性及其表达特征,为mcr-1耐药机制的深入研究奠定基础。方法:一、伤寒沙门菌中ramR
及ramA对氨苄西林的耐药调控功能研究1、ramR基因缺陷株的制备:PCR扩增ramR上
下游基因片段F1、F2,再将F1和F2连接成ramR的缺损片段F3,将F3与自杀质粒p
GMB151连接以构建重组载体,并电转至野生株GIFU10007,利用自杀质粒上sac
B基因特性筛选ramR基因缺陷变异株(ΔramR)。
2、ramA基因高表达株及空质粒对照株的制备:扩增ramA基因片段并克隆至高表达
质粒p BAD33中,分别将重组质粒p BAD33-ramA和空质粒p BAD33电转至GIFU10007,
即分别为ramA高表达株GIFU10007(p BAD33ramA)和空质粒对照株GIFU10007(p
BAD33)。3、氨苄西林压力下ΔramR和GIFU10007(p BAD33ramA)中ramA的表达分
析:分别提取伤寒沙门菌GIFU10007、ΔramR、GIFU10007(p BAD33ramA)和
GIFU10007(p BAD33)在氨苄西林应激30min后的总RNA,利用q RT-PCR技术测定各菌
株中ramA的表达水平,并比较它们的表达差异。
4、氨苄西林应激下细菌生长曲线的测定:分别测定伤寒沙门菌GIFU10007、ΔramR、
GIFU10007(p BAD33ramA)和GIFU10007(p BAD33)在氨苄西林应激条件下的生长曲线,
比较其生长差异,即对氨苄西林的耐受度差异。二、苏州地区CRE临床菌株的耐药分子流行
病学分析1、菌株鉴定和药敏分析:用Phoenix-100(BD)全自动微生物分析仪对收集的CRE
菌株进行菌种鉴定和药敏分析,并通过PCR扩增16S r RNA和测序比对进行菌种验证。
2、耐药基因的筛选:采用PCR法筛选碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、
bla IMP、blaOXA-48)、超广谱β-内酰胺酶基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM)、Amp C
头孢菌素酶基因(blaCMY、blaACT、blaDHA)和孔道蛋白基因(omp K35/omp F、omp
K36/omp C)等,结果经测序鉴定。3、多位点序列分型(multilocus sequence
typing,MLST):PCR扩增大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属的看家基因,并进行双向测序,
将基因序列上传至MLST数据库网站后获得Sequence Type(ST)分型结果。
4、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析:经上述MLST分析
未获得ST分型的菌株,利用PFGE技术进行分析,调查CRE临床分离株的流行病学相关性。
5、质粒接合转移实验:将受体菌和产碳青霉烯酶的供体菌混合培养进行接合转移试验,再通
过PCR法筛选出阳性接合转移子。
6、S1-PFGE:挑取携带blaKPC的质粒接合转移子进行S1-PFGE实验,分析blaKPC整
合质粒的分子特征。7、质粒序列分析:挑取具有代表性的碳青霉烯酶基因整合的质粒接合
转移子进行质粒序列测定分析。