2023年12月17日发(作者：淳于星河)
免疫组化方法（冰冻切片）
A. 所需溶液和试剂
1.
二甲苯
2.
无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）
3.
苏木精（可选）
4.
固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。
a.
10%中性福尔马林
b.
丙酮
c.
甲醇
d.
3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X
PBS中。
5.
10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma
base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。
6.
漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。
7.
甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。
8.
封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。
9.
配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。
10.
检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。
11.
DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。
B. 切片
1.
对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。
2.
将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。
3.
固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）
C. 固定
注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂
1.
玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。
a.
10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。
b.
冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。
c.
甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。
d.
3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
e.
3% 甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。
D. 染色
1.
切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。
2.
室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟
3.
用漂洗液洗两次，每次5分钟。
4.
在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。
5.
按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。
6.
去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。
7.
去掉抗体。用漂洗液洗3次，每次5分钟。
8.
根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。
9.
用漂洗液洗3次，每次5分钟。
10.
加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。
11.
一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。
12.
如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。
13.
切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。
14.
切片脱水：
a.
在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。
b.
在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。
c.
在二甲苯中孵育两次，每次10秒。
15.
加上盖玻片。
2023年12月17日发(作者：淳于星河)
免疫组化方法（冰冻切片）
A. 所需溶液和试剂
1.
二甲苯
2.
无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）
3.
苏木精（可选）
4.
固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。
a.
10%中性福尔马林
b.
丙酮
c.
甲醇
d.
3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X
PBS中。
5.
10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma
base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。
6.
漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。
7.
甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。
8.
封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。
9.
配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。
10.
检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。
11.
DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。
B. 切片
1.
对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。
2.
将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。
3.
固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）
C. 固定
注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂
1.
玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。
a.
10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。
b.
冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。
c.
甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。
d.
3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
e.
3% 甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。
D. 染色
1.
切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。
2.
室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟
3.
用漂洗液洗两次，每次5分钟。
4.
在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。
5.
按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。
6.
去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。
7.
去掉抗体。用漂洗液洗3次，每次5分钟。
8.
根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。
9.
用漂洗液洗3次，每次5分钟。
10.
加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。
11.
一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。
12.
如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。
13.
切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。
14.
切片脱水：
a.
在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。
b.
在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。
c.
在二甲苯中孵育两次，每次10秒。
15.
加上盖玻片。