2023年12月17日发(作者：淳于星河)

免疫组化方法（冰冻切片）

A. 所需溶液和试剂

1.

二甲苯

2.

无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）

3.

苏木精（可选）

4.

固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。

a.

10%中性福尔马林

b.

丙酮

c.

甲醇

d.

3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X

PBS中。

5.

10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma

base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。

6.

漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。

7.

甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。

8.

封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。

9.

配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。

10.

检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。

11.

DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。

B. 切片

1.

对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。

2.

将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。

3.

固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）

C. 固定

注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂

1.

玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。

a.

10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。

b.

冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。

c.

甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。

d.

3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。

e.

3% 甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。

D. 染色

1.

切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。

2.

室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟

3.

用漂洗液洗两次，每次5分钟。

4.

在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。

5.

按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。

6.

去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。

7.

去掉抗体。用漂洗液洗3次，每次5分钟。

8.

根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。

9.

用漂洗液洗3次，每次5分钟。

10.

加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。

11.

一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。

12.

如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。

13.

切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。

14.

切片脱水：

a.

在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。

b.

在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。

c.

在二甲苯中孵育两次，每次10秒。

15.

加上盖玻片。

2023年12月17日发(作者：淳于星河)

免疫组化方法（冰冻切片）

A. 所需溶液和试剂

1.

二甲苯

2.

无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）

3.

苏木精（可选）

4.

固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。

a.

10%中性福尔马林

b.

丙酮

c.

甲醇

d.

3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X

PBS中。

5.

10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma

base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。

6.

漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。

7.

甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。

8.

封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。

9.

配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。

10.

检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。

11.

DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。

B. 切片

1.

对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。

2.

将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。

3.

固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）

C. 固定

注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂

1.

玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。

a.

10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。

b.

冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。

c.

甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。

d.

3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。

e.

3% 甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。

D. 染色

1.

切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。

2.

室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟

3.

用漂洗液洗两次，每次5分钟。

4.

在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。

5.

按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。

6.

去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。

7.

去掉抗体。用漂洗液洗3次，每次5分钟。

8.

根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。

9.

用漂洗液洗3次，每次5分钟。

10.

加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。

11.

一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。

12.

如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。

13.

切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。

14.

切片脱水：

a.

在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。

b.

在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。

c.

在二甲苯中孵育两次，每次10秒。

15.

加上盖玻片。