2024年2月27日发(作者：毋倩丽)
上调THBS1蛋白的表达对肺腺癌H1975细胞迁移能力的影响
刁长英;王晓慧;谢艺林;刘亚清;高献争;李晟磊
【摘 要】目的:探讨上调血小板凝血酶蛋白1(THBS1)的表达对肺腺癌H1975细胞体外迁移能力的影响.方法:H1975细胞分为3组,空白对照组不处理,空载体转染组及pcDNA-THBS1转染组分别用脂质体转染空载体pcD-NA3.1和pcDNA3.1-THBS1真核表达载体,采用划痕实验检测细胞迁移能力,用qRT-PCR、Western
blot检测细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA、蛋白的表达情况.结果:与空白对照组和空载体转染组相比,pcDNA-THBS1转染组H1975细胞迁移能力增强,细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达升高(P<0.05).结论:上调THBS1蛋白可以增强肺腺癌H1975细胞体外迁移能力.
【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(054)003
【总页数】4页(P382-385)
【关键词】血小板凝血酶1;肺腺癌;细胞迁移;基质金属蛋白酶-2;基质金属蛋白酶-9;H1975细胞
【作 者】刁长英;王晓慧;谢艺林;刘亚清;高献争;李晟磊
【作者单位】郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052;郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052;郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052;郑州大学基础医
学院病理学系 郑州450001;郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052;郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052
【正文语种】中 文
【中图分类】R734.2
血小板凝血酶蛋白(thrombospondin，THBS)家族是最初发现于血小板中的一种糖蛋白，是组织发生和重塑期间调节细胞表型和细胞外结构的同源蛋白家族。
THBS1则是第一个被鉴定的成员[1]。THBS1可由多种细胞合成分泌到细胞外基质。目前有研究[2-4]表明THBS1在皮肤黑色素瘤细胞、口腔鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移中起作用。为进一步探讨THBS1与肺腺癌H1975细胞体外迁移能力的关系，本研究采用细胞划痕实验检测上调THBS1后H1975细胞迁移能力的变化及与细胞迁移相关的指标基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9的表达情况，以期寻找肺腺癌浸润、转移机制中的分子靶点。
1 材料与方法
1.1 材料 H1975细胞购自美国ATCC公司，RPMI 1640和胎牛血清购自美国Gibco公司，蛋白裂解液购自宝生物工程(大连)有限公司，MMP-2、MMP-9和β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司，增强型ECL化学发光试剂盒购自南京诺唯赞公司，PVDF膜购自上海丽臣生物科技有限公司，pcDNA3.1购自美国Invitrogen公司，pcDNA3.1-THBS1为本实验室构建保存，荧光定量试剂盒[SYBR PremixEx Taq Ⅱ(Tli RnaseH Plus)]购自日本TaKaRa公司，cDNA合成试剂盒(ReverTra Ace QPCR RT Master mix)购自日本TOYOBO公司，引物由上海生工生物工程科技有限公司合成。
1.2 细胞培养与分组 H1975细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640
培养液中。细胞分为3组，空白对照组不处理，空载体转染组及pcDNA-THBS1转染组分别用脂质体2000转染空载体pcDNA3.1和pcDNA3.1-THBS1真核表达载体。
1.3 细胞迁移能力检测 采用划痕实验。用记号笔在6孔细胞培养板背后均匀地划出横线，间隔0.5 cm，并使横线横穿过孔，保证每孔至少穿过5条线。培养板中每孔接种约5×105个细胞，第2天用枪头划痕，枪头确保垂直，之后用PBS漂洗3次，加入无血清培养基。培养板放入37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养，分别于培养0、48 h拍照，根据划痕宽度评估细胞迁移能力。实验重复3次。
1.4 MMP-2和MMP-9 mRNA表达的检测 采用qRT-PCR检测。转染72 h收集3组细胞，PBS洗涤2～3次，按Trizol说明书提取细胞总RNA，微量紫外分光光度计测量RNA浓度，并判定纯度。按照cDNA合成试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明进行DNA扩增。引物：MMP-2上游引物5’-TCGCCCATCATCAAGTTC CC-3’，下游引物5’-TCTGGGGCAGTCCAAAGAAC-3’，产物大小163 bp；MMP-9上游引物5’-CCT GGGCAGATTCCAAACCT-3’，下游引物5’-GTA
CACGCGAGTGAAGGTGA-3’，产物大小172 bp。PCR扩增体系20 μL，其中Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，双蒸水8 μL，cDNA 1 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，84 ℃15 s，35个循环，最后7 ℃延伸7 min。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线等，并按照试剂盒说明书判读结果。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次。
1.5 MMP-2和MMP-9蛋白表达的检测 采用Western blot法。转染72 h后收集3组细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，制备SDS-PAGE凝胶，经电泳、转膜、封闭，分别加入MMP-2和MMP-9抗体(均按1∶200稀释)，室温孵育2
h，加二抗反应1 h，ECL显色后放入AI600系统检测仪曝光并照相。以β-actin为内参，以目的蛋白和内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据，采用单因素方差分析比较3组细胞MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达水平的差异，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 3组细胞迁移能力的比较 与空白对照组和空载体转染组相比，pcDNA-THBS1转染组H1975细胞的迁移能力增强(图1)。
A、B、C：分别为空白对照组、空载体转染组、pcDNA-THBS1转染组；1：0
h;2：48 h图1 3组细胞迁移能力的比较
2.2 3组细胞MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达水平的比较 与空白对照组和空载体转染组相比，pcDNA-THBS1转染组中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平升高(图2，表1、2)。
1～3：分别为空白对照组、空载体转染组、pcDNA-THBS1转染组
图2 3组细胞MMP-2和MMP-9蛋白的表达表1 3组细胞MMP-2和MMP-9
mRNA表达水平的比较组别nMMP-2MMP-9空白对照组31.062±0.0140.983±0.032空载体转染组31.161±0.2451.098±0.163pcDNA-THBS1转染组33.137±0.139∗2.986±0.356∗F662.29886.111P<0.001<0.001
*：与其他2组相比，P<0.05
表2 3组细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的比较组别nMMP-2MMP-9空白对照组30.309±0.0240.298±0.041空载体转染组30.301±0.1170.289±0.126pcDNA-THBS1转染组
30.937±0.139∗0.579±0.219∗F597.38175.049P<0.001<0.001
*：与其他2组相比，P<0.05
3 讨论
目前，化疗、手术和放疗是治疗肺癌的主要方法，约3/4的患者就诊时已处于晚期，无法手术，只能选择化疗[5]。然而，大多数常规剂型的化疗药物是全身分布的，治疗肺癌可能无效，并且会产生严重的副作用[6]。因此，靶向药物已经被认为是治疗肺癌的理想策略。
近年来，越来越多的研究[2,7-9]表明，THBS1是多种癌症预后差和复发的一个指标，如神经胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌及胰腺癌。THBS1作为一种多功能蛋白质，有可能对肿瘤进展产生复杂作用。研究[10-11]证明THBS1上调细胞表面的胞浆素纤溶酶原形成，介导肿瘤细胞的组织侵袭。另有报道[12-16]通过体内体外实验表明THBS1在肿瘤中的表达水平和肿瘤生长及转移可能有关。然而，不同的细胞类型研究结果不同。有研究表明THBS1在肿瘤细胞中的表达上调，但也有研究表明其在肿瘤细胞中表达下调[5，17]。
本研究将前期成功构建的pcDNA3.1-THBS1真核表达载体以脂质体转染至THBS1 mRNA表达水平最低的肺腺癌H1975细胞，采用细胞划痕实验检测转染前后H1975细胞迁移能力的变化，结果发现上调THBS1的表达可促进细胞迁移，与相关报道[3,18]一致。这一结果提示THBS1与肺腺癌细胞的迁移能力密切相关。
MMP是一个大家族，几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分,破坏组织学屏障，在肿瘤细胞迁移及侵袭转移过程中起关键作用[19]。本研究结果显示上调H1975细胞中THBS1的表达后，MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达亦增加，提示THBS1基因过表达可能通过上调MMP-2和MMP-9的表达促进肺腺癌细胞的迁移，这一结论与胃癌中的报道[20]一致，但确切的分子机制尚需要进一步探讨。
综上所述，上调THBS1能促进肺腺癌细胞的迁移，其机制可能与上调MMP-2和
MMP-9的表达有关，THBS1有可能成为发生转移的肺腺癌患者分子靶向治疗的靶点。
参考文献
【相关文献】
[1]STENINA-ADOGNRAVI ospondins:old players, new games[J].Curr Opin
Lipidol,2013,24(5):401
[2]BORSOTTI P,GHILARDI C,OSTANO P,et ospondin-1 is part of a Slug-independent motility and metastatic program in cutaneous melanoma, in association with
VEGFR-1 and FGF-2[J].Pigment Cell Melanoma Res,2015,28(1):73
[3]PAL SK,NGUYEN CT,MORITA KI,et 1 is induced by TGFB1 in the cancer stroma
and promotes invasion of oral squamous cell carcinoma[J].J Oral Pathol
Med,2016,45(10):730
[4]JAYACHANDRAN A,ANAKA M,PRITHVIRAJ P,et ospondin 1 promotes an
aggressive phenotype through epithelial-to-mesenchymal transition in human
melanoma[J].Oncotarget,2014,5(14):5782
[5]KAUR S,ELKAHLOUN AG,SINGH SP,et al.A function-blocking CD47 antibody modulates
extracellular vesicle-mediated intercellular signaling between breast carcinoma cells and
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[6]LI DB,GONG ation of novel pirfenidone microspheres for lung-targeted
delivery: in vitro and in vivo study[J].Drug Des Devel Ther,2016,10:2815
[7]PEREZ-JANICES N,BLANCO-LUQUIN I,TUNON MT,et 41L3,TSP-1 and RASSF2 as
new clinically relevant prognostic biomarkers in diffuse
gliomas[J].Oncotarget,2015,6(1):368
[8]LYU T,JIA N,WANG J,et sion and epigenetic regulation of angiogenesis-related
factors during dormancy and recurrent growth of ovarian
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[9]NIE S,LO A,WU J,et rotein biomarker panel for pancreatic cancer discovered by
quantitative proteomics analysis[J].J Proteome Res,2014,13(4):1873
[10]ROKA-MOYA YM,ZHERNOSSEKOV DD,YUSOVA EI,et of the sites of
plasminogen molecule which are responsible for inhibitory effect of Lys-plasminogen on
platelet aggregation[J].Ukr Biochem J,2014,86(5):82
[11]INSALACO L,DI GAUDIO F,TERRASI M,et is of molecular mechanisms and
anti-tumoural effects of zoledronic acid in breast cancer cells[J].J Cell Mol
Med,2012,16(9):2186
[12]RIVERA LB,BERGERS angiogenesis, from foe to
friend[J].Science,2015,349(6249):694
[13]SCHADLER KL,CROSBY EJ,ZHOU AY,et surveillance by antiangiogenesis:
tumor growth arrest by T cell-derived thrombospondin-1[J].Cancer Res,2014,74(8):2171
[14]HORIGUCHI H,YAMAGATA S,RONG QZ,et ospondin-1 is highly expressed in
desmoplastic components of invasive ductal carcinoma of the breast and associated with
lymph node metastasis[J].J Med Invest,2013,60(1/2):91
[15]WANG W,ZHANG E,LIN NAs in tumor angiogenesis[J].Life Sci,2015,136:28
[16]FERREIRA LC,ARBAB AS,JARDIM-PERASSI BV,et of curcumin on pro-angiogenic factors in the xenograft model of breast cancer[J].Anticancer Agents Med
Chem,2015,15(10):1285
[17]JAYACHANDRAN A,ANAKA M,PRITHVIRAJ P, et al. Thrombospondin 1 promotes an
aggressive phenotype through epithelial-to-mesenchymal transition in human
melanoma[J]. Oncotarget,2014,5(14):5782
[18]STEIN JJ,IWUCHUKWU C,MAIER KG,et ospondin-1-induced vascular smooth
muscle cell migration and proliferation are functionally dependent on microRNA-21[J].Surgery,2014,155(2):228
[19]SUN XF,SHAO YB,LIU MG,et -concentration glucose enhances invasion in
invasive ductal breast carcinoma by promoting Glut1/MMP2/MMP9 axis
expression[J].Oncol Lett,2017,13(5):2989
[20]HUANG TT,WANG L,LIU D,et 7/FGFR2 signal promotes invasion and migration in
human gastric cancer through upregulation of thrombospondin-1[J].Int J
Oncol,2017,50(5):1501
2024年2月27日发(作者：毋倩丽)
上调THBS1蛋白的表达对肺腺癌H1975细胞迁移能力的影响
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【摘 要】目的:探讨上调血小板凝血酶蛋白1(THBS1)的表达对肺腺癌H1975细胞体外迁移能力的影响.方法:H1975细胞分为3组,空白对照组不处理,空载体转染组及pcDNA-THBS1转染组分别用脂质体转染空载体pcD-NA3.1和pcDNA3.1-THBS1真核表达载体,采用划痕实验检测细胞迁移能力,用qRT-PCR、Western
blot检测细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA、蛋白的表达情况.结果:与空白对照组和空载体转染组相比,pcDNA-THBS1转染组H1975细胞迁移能力增强,细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达升高(P<0.05).结论:上调THBS1蛋白可以增强肺腺癌H1975细胞体外迁移能力.
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【关键词】血小板凝血酶1;肺腺癌;细胞迁移;基质金属蛋白酶-2;基质金属蛋白酶-9;H1975细胞
【作 者】刁长英;王晓慧;谢艺林;刘亚清;高献争;李晟磊
【作者单位】郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052;郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052;郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052;郑州大学基础医
学院病理学系 郑州450001;郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052;郑州大学第一附属医院病理科 郑州450052
【正文语种】中 文
【中图分类】R734.2
血小板凝血酶蛋白(thrombospondin，THBS)家族是最初发现于血小板中的一种糖蛋白，是组织发生和重塑期间调节细胞表型和细胞外结构的同源蛋白家族。
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1 材料与方法
1.1 材料 H1975细胞购自美国ATCC公司，RPMI 1640和胎牛血清购自美国Gibco公司，蛋白裂解液购自宝生物工程(大连)有限公司，MMP-2、MMP-9和β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司，增强型ECL化学发光试剂盒购自南京诺唯赞公司，PVDF膜购自上海丽臣生物科技有限公司，pcDNA3.1购自美国Invitrogen公司，pcDNA3.1-THBS1为本实验室构建保存，荧光定量试剂盒[SYBR PremixEx Taq Ⅱ(Tli RnaseH Plus)]购自日本TaKaRa公司，cDNA合成试剂盒(ReverTra Ace QPCR RT Master mix)购自日本TOYOBO公司，引物由上海生工生物工程科技有限公司合成。
1.2 细胞培养与分组 H1975细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640
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1.3 细胞迁移能力检测 采用划痕实验。用记号笔在6孔细胞培养板背后均匀地划出横线，间隔0.5 cm，并使横线横穿过孔，保证每孔至少穿过5条线。培养板中每孔接种约5×105个细胞，第2天用枪头划痕，枪头确保垂直，之后用PBS漂洗3次，加入无血清培养基。培养板放入37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养，分别于培养0、48 h拍照，根据划痕宽度评估细胞迁移能力。实验重复3次。
1.4 MMP-2和MMP-9 mRNA表达的检测 采用qRT-PCR检测。转染72 h收集3组细胞，PBS洗涤2～3次，按Trizol说明书提取细胞总RNA，微量紫外分光光度计测量RNA浓度，并判定纯度。按照cDNA合成试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明进行DNA扩增。引物：MMP-2上游引物5’-TCGCCCATCATCAAGTTC CC-3’，下游引物5’-TCTGGGGCAGTCCAAAGAAC-3’，产物大小163 bp；MMP-9上游引物5’-CCT GGGCAGATTCCAAACCT-3’，下游引物5’-GTA
CACGCGAGTGAAGGTGA-3’，产物大小172 bp。PCR扩增体系20 μL，其中Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，双蒸水8 μL，cDNA 1 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，84 ℃15 s，35个循环，最后7 ℃延伸7 min。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线等，并按照试剂盒说明书判读结果。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次。
1.5 MMP-2和MMP-9蛋白表达的检测 采用Western blot法。转染72 h后收集3组细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，制备SDS-PAGE凝胶，经电泳、转膜、封闭，分别加入MMP-2和MMP-9抗体(均按1∶200稀释)，室温孵育2
h，加二抗反应1 h，ECL显色后放入AI600系统检测仪曝光并照相。以β-actin为内参，以目的蛋白和内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据，采用单因素方差分析比较3组细胞MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达水平的差异，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 3组细胞迁移能力的比较 与空白对照组和空载体转染组相比，pcDNA-THBS1转染组H1975细胞的迁移能力增强(图1)。
A、B、C：分别为空白对照组、空载体转染组、pcDNA-THBS1转染组；1：0
h;2：48 h图1 3组细胞迁移能力的比较
2.2 3组细胞MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达水平的比较 与空白对照组和空载体转染组相比，pcDNA-THBS1转染组中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平升高(图2，表1、2)。
1～3：分别为空白对照组、空载体转染组、pcDNA-THBS1转染组
图2 3组细胞MMP-2和MMP-9蛋白的表达表1 3组细胞MMP-2和MMP-9
mRNA表达水平的比较组别nMMP-2MMP-9空白对照组31.062±0.0140.983±0.032空载体转染组31.161±0.2451.098±0.163pcDNA-THBS1转染组33.137±0.139∗2.986±0.356∗F662.29886.111P<0.001<0.001
*：与其他2组相比，P<0.05
表2 3组细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的比较组别nMMP-2MMP-9空白对照组30.309±0.0240.298±0.041空载体转染组30.301±0.1170.289±0.126pcDNA-THBS1转染组
30.937±0.139∗0.579±0.219∗F597.38175.049P<0.001<0.001
*：与其他2组相比，P<0.05
3 讨论
目前，化疗、手术和放疗是治疗肺癌的主要方法，约3/4的患者就诊时已处于晚期，无法手术，只能选择化疗[5]。然而，大多数常规剂型的化疗药物是全身分布的，治疗肺癌可能无效，并且会产生严重的副作用[6]。因此，靶向药物已经被认为是治疗肺癌的理想策略。
近年来，越来越多的研究[2,7-9]表明，THBS1是多种癌症预后差和复发的一个指标，如神经胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌及胰腺癌。THBS1作为一种多功能蛋白质，有可能对肿瘤进展产生复杂作用。研究[10-11]证明THBS1上调细胞表面的胞浆素纤溶酶原形成，介导肿瘤细胞的组织侵袭。另有报道[12-16]通过体内体外实验表明THBS1在肿瘤中的表达水平和肿瘤生长及转移可能有关。然而，不同的细胞类型研究结果不同。有研究表明THBS1在肿瘤细胞中的表达上调，但也有研究表明其在肿瘤细胞中表达下调[5，17]。
本研究将前期成功构建的pcDNA3.1-THBS1真核表达载体以脂质体转染至THBS1 mRNA表达水平最低的肺腺癌H1975细胞，采用细胞划痕实验检测转染前后H1975细胞迁移能力的变化，结果发现上调THBS1的表达可促进细胞迁移，与相关报道[3,18]一致。这一结果提示THBS1与肺腺癌细胞的迁移能力密切相关。
MMP是一个大家族，几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分,破坏组织学屏障，在肿瘤细胞迁移及侵袭转移过程中起关键作用[19]。本研究结果显示上调H1975细胞中THBS1的表达后，MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达亦增加，提示THBS1基因过表达可能通过上调MMP-2和MMP-9的表达促进肺腺癌细胞的迁移，这一结论与胃癌中的报道[20]一致，但确切的分子机制尚需要进一步探讨。
综上所述，上调THBS1能促进肺腺癌细胞的迁移，其机制可能与上调MMP-2和
MMP-9的表达有关，THBS1有可能成为发生转移的肺腺癌患者分子靶向治疗的靶点。
参考文献
【相关文献】
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