2024年9月13日发(作者：伯依云)
通过特殊因子培养小鼠胚胎和成体成纤维细胞的多能
性干细胞的诱导
摘要：分化的细胞可以通过转移核的内含物进入卵母细胞或结合胚胎干细胞来重编程到达
一个像胚胎的状态。又到这个重编程过程的因子却很少被人得知。本文中，我们确定了在
ES细胞培养条件下通过四个因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来将小鼠胚胎或成纤维细胞诱导
为多能性干细胞。出乎意料的，Nanog是不必要的。我们定义为iPS细胞的这些细胞，展示
了ES细胞的形态学和生长特性而且表达了ES细胞的标记基因。这些数据表明多能性干细胞
可以通过只有一小部分确定的因子直接从成纤维细胞中得到。
前言：ES细胞，从哺乳动物囊胚的内细胞团得到，有不确定的生长的能力保持了多能性
和分化为所有三胚层细胞的能力。人类ES细胞可能被用于治疗大量的疾病，比如帕金森脊
髓损伤和糖尿病。然而，关于利用人类胚胎存在一个伦理的困难，以及接下来的植入患者体
内的组织排斥性。解决这些难题的一个方法就是直接从患者自己的细胞中得到多能性干细胞。
体细胞可以通过将它们的核的内含物转移到卵母细胞中或与ES细胞结合来重编程，表明
了未受精的卵和ES细胞存在能给予体细胞全能性或多能性的因子。我们假设在维持ES细胞
恒定中其重要作用的因子在体细胞诱导多能性中也起关键的作用。
一些转录因子,包括Oct-4、Sox2、Nanog，在早期胚胎和ES细胞的多能性维持起作用。
一些在瘤中频繁的调试的基因例如Stat3，E-Ras，c-myc，Klf4和β-catenin已经被证实
能贡献于ES细胞表现型和体外培养ES细胞的快速增殖的长期维护。此外，我们已经坚定了
一些基因在ES细胞中是特定表达的。
在本文中，我们检查了这些因子能否在体细胞中诱导多能性。通过结合四个筛选因子，我
们能直接从小鼠胚胎或成纤维细胞培养中得到我们叫做iPS细胞的多能性细胞。
结果
基于我们的这些因子也在维护ES细胞特性中起到了重要作用这一假说，我们选择了24个基
因作为在体细胞中诱导多能性的候选因子。我们分别用S33Y-b-catenin，T58A-c-Myc和
Stat3-C激活b-catenin, c-Myc和Stat3。因为Grb2被报告在多能性上的负面作用，我们诱导
它的显性失活突变体Grb2△SH2作为24个候选因子之一。
为了评估这24个候选基因，我们发展了一个在多能性状态的诱导中的分析系统，能够检测
到对G418的抵抗。我们在小鼠Fbx15基因中通过同源重组插入了一个βgeo片段。尽管在小鼠
ES细胞和早期胚胎中特定表达，Fbx15对于维持多能性和小鼠的发育是不必要的。Βgeo基因
敲入的ES细胞纯合子对特别高的G418有抵抗作用，然而得自与βgeo敲入的Fbx小鼠的体细胞
对于一个正常的G418浓度是敏感的。我们期望甚至Fbx15位点的部分活化能够导致对正常浓
度的G418的抵抗作用。
我们将24个候选基因中的每一个通过逆转录病毒转导引入从βgeo敲入的Fbx15小鼠胚胎
得到的小鼠胚胎成纤维细胞中。转导的细胞之后在含有G418的ES细胞成分培养基中的STO饲
养层细胞上培养。然而，我们没有得到任何一个单因子的存在抗性的克隆，这表明没有单个
候选基因足够激活Fbx15位点。
相反的，一起转导全部的24个候选基因产生了22个G418抗性的克隆。我们继续培养筛选
的12个克隆中，5个展现了与ES细胞相似的形态，包括圆形，大核仁和较少的细胞质。我们
重复实验并发现了29个G418抗性的克隆，我们选取了6个克隆。这些克隆中的四个表现了与
ES细胞相似的形态学和增殖能力。这些细胞的增倍时间等价于ES细胞。我们命名这些由24
个因子诱导的小鼠胚胎成纤维细胞而成的多能性干细胞为iPS-MEF24。反转录PCR分析显示
iPS-MEF24克隆表达了ES细胞的标记基因，包括了Oct4，Nanog，E-Ras，Cripto, Dax1,和
Zfp296以及Fgf4器官。亚硫酸氢盐基因组测序表明Fbx15和Nanog的启动子在iPS细胞中被
脱甲基化。形成对比的，Oct4的启动子在这些细胞中仍然是甲基化的。这些数据证明着24
个候选因子的一些组合能在MEF培养中诱导ES细胞的标记基因表达。
然后，为了确定24个候选因子中的哪个是决定性的，我们检测了从转导基因的集合体中撤
回个别因子对产生G418抗性克隆的影响。我们鉴定了十个因子，将它们个别的从大量的转
到基因中撤回能导致转到后10天没有克隆形成，转导后16天只有少量的克隆形成。这十个
基因单独组合能比转导全部24个基因产生更多的ES细胞样的克隆。
我们随后检测了从这10个因子的集合体中撤回单个因子对克隆形成的影响。G418抗性克隆当
Oct4，Klf4任意一个不在时都不能形成。去除Sox2时只有少量的G418抗性克隆形成。当我
们移除c-Myc时，G418抗性克隆没有出现，但呈现出了一种平面的，不像ES细胞的形态。移
除剩下的因子没有明显的影响克隆的数目。这些结果表明Oct4，Klf4，Sox2和c-Myc在从MEF
中得到的iPS细胞的产生中有重要作用。
这四个基因的集合产生了与十个基因的集合相似数目的G418抗性克隆。我们继续12个克
隆的培养来转导并建立了4个4因子诱导的MEF的iPS克隆和5个10因子诱导的MEF的iPS克隆。
此外，我们能用野生型的c-Myc生产iPS细胞来代替T58A突变体。这些数据证明iPS细胞可以
通过导入四个转录因子Oct4，Klf4，Sox2和c-Myc对MEF诱导得到。
没有两个因子的集合体能够诱导出G418抗性克隆产生。两个由三个因子的组合Oct4，Sox2
和c-Myc与Klf4，Sox2和c-Myc能在每个例子中产生一个单独的，小的克隆，但是这些不能
在体外维持。在Oct4，Klf4，Sox2的组合中，我们观察到形成了36个G418抗性克隆，然而
却展示了一个扁平的，与ES细胞不同的形态。在Oct4，Klf4，c-Myc的组合中，我们观察到
形成了54个G418抗性克隆，其中我们选取了6个。尽管所有的6个克隆能维持几个超过几个
通道，这些细胞的形态与iPS-MEF4和iPS-MEF10细胞不同，带有iPS-MEF3克隆展现的粗
糙表面。这些数据指出Oct4，Klf4，c-Myc的组合能够活化Fbx15位点，但通过这三个因子
诱导唯一的改变就是与在iPS-MEF4和iPS-MEF10细胞中看到的形态不同。
我们进行RT-PCR来检测ES细胞标记基因是否在iPS细胞中表达。我们用能放大内源基因但
却不对转入的基因作用的引物。iPS-MEF10和iPS-MEF4 表达了除Ecat1外大多数标记基因。
这些标记基因的表达，包括Oct4，在iPS-MEF4-7, iPS-MEF10-6和iPS-MEF10-7克隆中比
剩下的可隆重高。Sox2只在iPS-MEF10-6中表达。iPS-MEF4克隆也表达了许多ES细胞的
标记基因。染色体免疫沉淀分析显示出Oct4和Nanog启动子增加了组蛋白H3的乙酰化和减
少了组蛋白H3的赖氨酸9的二甲基化作用。在这些启动子中的CpG辅酶在IPS细胞中局部甲
基化。iPS-MEF4
和
iPSMEF10细胞经过碱性磷酸酶和SSEA1检测后发现是阳性的而且表现
了高水平的末端转移酶端粒活性。这些结果证明iPS-MEF4
和
iPS-MEF10细胞是相似于ES
细胞，但却不是恒定的。
在iPS-MEF3克隆中，Ecat1, Esg1和 Sox2没有激活。Nanog被诱导，但比iPS-MEF4和
iPS-MEF10克隆中少。Oct4在iPS-MEF3-3, -5, 和 -6中微弱的活化但在剩下的克隆中没有
被激活。作为对照，E-Ras和Fgf4在iPS-MEF3相比于在iPS-MEF10或iPS-MEF4中更加有效
的活化。这些数据证实iPS-MEF3细胞实质上与iPS-MEF10和iPS-MEF4细胞不同。
我们用DNA微数列比较了ES细胞，iPS细胞和βgeo敲入的Fbx15的小鼠胚胎成纤维细胞的
全部基因表达的资料。此外，我们检测了四因子诱导没经过G418筛选的βgeo敲入的Fbx15
的小鼠胚胎成纤维细胞，使表达K-RasV12的小鼠胚胎成纤维细胞永生，NIH细胞与
H-RasV12转导。皮尔森相关分析显示iPS细胞是簇生的接近于ES细胞却又不同于成纤维细
胞以及它们的诱导药。微数列分析鉴定了通常在ES细胞核iPS细胞中正调节的基因，包括
Myb, Kit, Gdf3, and Zic3。其他基因在ES细胞、iPS-MEF4和iPS-MEF10克隆比iPS-MEF3
克隆中更有效的正调节，包括Dppa3, Dppa4, Dppa5, Nanog, Sox2，Esrrb和Rex1。这些基
因中低表达的可能能解释iPS-MEF3细胞中多能性的缺失。此外，我们发现一些基因在ES
细胞中比在iPS细胞中更显著，包括Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3l, Utf1, Tcl1以及LIF接受基因。
这些数据证实iPS细胞与ES细胞相似但不完全一致。
我们通过畸胎瘤的形成来检测iPS细胞的多能性。在皮下注射到裸鼠后我们获得了5个
iPS-MEF10克隆和3个iPS-MEF4克隆，1个iPS-MEF4wt克隆和6个iPS-MEF3克隆得到的瘤。
组织学的检测表明2个iPS-MEF10克隆，2个iPS-MEF4克隆和iPS-MEF4wt-4克隆分化出了
所有的三陪曾，包括神经组织，软骨和柱状上皮。iPS-MEF10-6甚至在30代后可以分化出
三陪曾。我们通过免疫荧光和RT-PCR确认分化出神经和肌肉组织。作为对照，这些畸胎瘤
不能表达滋养层标记Cdx2。iPS-MEF10-1的瘤分化出内胚层和外胚层，但是没有中胚层，
从剩下的iPS-MEF10 (7 and 10)或iPS-MEF4-10形成的瘤中没有观察到分化的标志。这些数
据证明大多数，但不是全部，iPS-MEF10和iPS-MEF4克隆呈现出多能性。
作为对照，所有得自于iPS-MEF3克隆的瘤都是由完全未分化的细胞组成。然而，尽管三个
因子（Oct3/4, c-Myc和Klf4）能优待一些ES细胞标记基因的表达，但是它们不能诱导多能
性。
iPS-MEF10, iPS-MEF4和iPS-MEF3在无包被的塑料平皿中形成拟胚体。当在组织培养皿中
生长时，iPS-MEF10和iPS-MEF4细胞形成的拟胚体黏着在平皿底部并开始分化。3天后，
免疫荧光检测到α-平滑肌肌动蛋白和α-胎儿球蛋白和β微管蛋白的阳性细胞。作为对照，
iPS-MEF3产生的拟胚体甚至在铺垫明胶后的平皿中都没有分化。这些数据表明iPS-MEF10
和iPS-MEF4在体外存在多能性以及iPS-MEF3不存在多能性。
我们接下来诱导四因子筛选进入得自于四只7周大的βgeo敲入Fbx15的C57/BL6-129杂合
雄性小鼠的TTF中。我们获得了3个G418抗性克隆，从每个我们建立的iPS细胞系中。我们
也将四个因子诱导入一只12周大的βgeo敲入Fbx15雌性小鼠中，这种小鼠通常表达来自于
CAG启动子的绿色荧光蛋白而且是C57/BL6-129-ICR杂合的。得到的13个G418抗性克隆中，
我们选取了能够建立iPS细胞系的六种克隆。此外，我们建立了另一种iPS-TTFgfp4，这种
细胞在转基因中四个因子的每一个的cDNA都存在两个loxP位点。这些细胞形态学上不能与
ES细胞区分。RT-PCR表明iPS-TTFgfp4的克隆3和7比较高程度的表达了ES细胞标记基因
的大部分而剩下的则比较低。另一中尝试，我们也用T58A突变体或c-Myc野生型来尽心转
导，建立了5个iPS-TTFgfp4克隆和3个iPS-TTFgfp4wt克隆。RT-PCR显示iPS-TTHgfp4wt
细胞液表达了ES细胞标记基因的绝大多数。
我们将2个iPS-TTF4和6个iPS-TTFgfp4克隆移植到裸鼠中，所有产生畸胎瘤的细胞都包含
了三胚层的组织。我们然后将iPS-TTFgfp4细胞的两个克隆通过显微注射导入了C57/BL6囊
胚中。用Ips-TTFgfp4-3，我们获得了13.5天的18个胚胎，其中的两个展示了有GFP-阳性的
iPS细胞存在。组织学分析确认iPS细胞贡献于所有的三胚层。我们在生殖腺中观察到GFP-
阳性细胞但是不能确定他们是生殖细胞还是体细胞。用iPS-TTFgfp4-7，我们获得了7.5天的
2个胚胎，其中的3个是GFP阳性的。用2个克隆，我们得到了27只小鼠，但是它们都不是嵌
合小鼠。此外，iPS-TTFgfp4细胞能在体外分化成三胚层。这些数据表明四个筛选因子能诱
导成体小鼠成纤维细胞产生多能性细胞。
我们进一步检测了在iPS细胞中四个因子和其他因子的表达。Real-time PCR显示iPS细胞中
Oct4和Sox2的内源性表达水平比ES细胞低。然而，内源基因和转基因中四因子的总体的量
超过了ES细胞中正常的表达量。作为对照，Western blot分析显示在iPS细胞中四个因子的
总蛋白量于ES细胞中的那些进行对比。我们可以在iPS细胞中检测到Nanog和E-Ras的蛋白
质，但是比ES细胞的低。在iPS细胞中P53蛋白的水平比MEF中的低，与ES细胞中的相当。
IPS细胞每个克隆中的p21蛋白的水平都不同而且介于MEF与ES细胞之中。继续在体外分化，
Oct4和Sox2的总体mRNA表达水平降低但是仍让比ES细胞中的高许多。相反地，它们的蛋
白质水平降低到与iPS和ES细胞中相当的程度。
Southern blot分析显示每个iPS克隆有一个独特的转基因整合机制。IPS-TTFgfp4和
iPS-TTFgfp4wt克隆的核型分析显示2个iPS-TTFgfp4的克隆和所有的iPS-TTFgfp4wt克隆
展现了一个正常的40XX的核型，然而其他的3个iPS-TTFgfp4的克隆是39XO，40XO+10和
40Xi（X）。以PCR为基础的简单序列长度多态性的分析显示iPS-MEF克隆有一个C57/BL6
和129混合的背景，然而iPS-TTFgfp的克隆却是ICR,C57/BL6和129混合的。最终，我们发
现了iPS细胞在培养基缺少饲养层细胞，甚至缺少LIF时不能够保持未分化。这些结果，与不
同的基因表达模式，排除了iPS细胞仅仅是预成ES细胞的污染的可能性。最终，iPS细胞的
亚克隆是碱性磷酸酶检验阳性而且在体外能够分化出三胚层，证实了它们无性繁殖的本质。
讨论
Oct4，Sox2和Nanog已经被展示了作为维持多能性的核心转录因子的功能。在这三个中，
我们发现Oct4和Sox2对于iPS细胞的产生是必要的。令人惊讶的是，Nanog是非必要的。此
外，我们鉴定了c-Myc和Klf4作为核心因子。这两个与肿瘤相关的因子不能被包括E-Ras,
Tcl1, β-catenin,和Stat3在内的其他癌基因代替。
c-Myc蛋白质有许多增强增值和转化的下游区靶位点，其中的许多在iPS细胞的产生中发
挥作用。著名的，c-Myc与组蛋白乙酰基转移酶（HAT）的合成有关，包括TRRAP，TIP60
和GCN5的HAT合成的一种核心亚基，以及p300。带有哺乳动物的基因组，可能存在2500
个c-Myc结合位点，比Oct4和Sox2结合位点多的多。C-Myc蛋白质可能诱导全面的组蛋白乙
酰化作用，因此允许Oct4和Sox2结合到它们的特殊靶器官。
Klf4已经被发现能直接抑制p53，p53蛋白质已经被发现能在ES细胞分化的过程中抑制
Nanog。我们发现iPS细胞显示p53的蛋白质含量低于MEF中的级别。因此，Klf4可能通过抑
制p53蛋白来贡献于活化Nanog和其他ES细胞特化因子。在我们的体系中Klf4可能通过抑制
p53蛋白作为Myc诱导的细胞凋亡的抑制剂。另一方面，Klf4活化了p21，从而抑制细胞增殖。
Klf4的这种抗增殖作用可能被能够抑制p21表达的c-Myc抑制。这种c-Myc和Klf4之间的平衡
可能对于iPS细胞的产生非常重要。
一个问题存在关系着我们iPS细胞的起源。用我们的逆转录病毒体系，我们发现只有表达
四因子细胞中的一小部分成为了iPS细胞。低概率意味着共存于成纤维细胞培养的稀有的祖
细胞可能会引起iPS发生。实际上，多能性干细胞已经被从皮肤中分离出来。这些研究表明
大约0.067%的小鼠皮肤细胞是干细胞。一种对于iPS细胞诱导低效率的解释是四因子转化了
组织干细胞。然而，我们发现四因子甚至从应该存在浓缩的间质干细胞和其他多能性细胞的
骨髓间充质诱导iPS也是同等的低效率。此外，被三个因子诱导的细胞是无多能性的。DNA
微阵列分析显示iPS-MEF3和iPS-MEF3细胞存在相同的区域。这些结果没有显示多能的组
织干细胞是iPS细胞的起源。
关于得到iPS细胞的低概率存在其他几种可能性。第一，能够产生多能性细胞的四因子级
别可能是一个狭窄的范围，只有一小部分正确表达四因子级别的细胞能够获得像ES细胞一
样的特性。与这个意图一致，仅仅Oct4蛋白质50%的增加或减少会诱导ES细胞分化。当分
析RNA级别时，IPS克隆过表达了四因子，但是它们的蛋白质级别与ES细胞中一致，着暗
示了iPS克隆具有一种能够紧密调节四因子蛋白质级别的机制。我们推测四因子的高额度在
iPS细胞产生的初级阶段是必需的，但是，一旦它们获取了类似ES细胞的状态，太多的因子
对自我更新是有害的。只有一小部分的转导细胞展现了比较恰当的转基因表达。四儿，多能
性细胞的产生可能需要额外的染色体修饰，能够在培养或被四因子中的一些诱导时自发的替
代。尽管iPS-TTFgfp4克隆存在大量的正常核型，我们不能排除较少的染色体修饰的存在。
专一位点逆转录病毒的插入可能也起一定作用。Southern blot分析展示了每个iPS克隆存在
大约20个逆转录病毒的整合。这些中的一些可能已经引起沉默或内源基因的结合。进一步
的研究需要决定iPS细胞的起始。
其他没有得到解决的问题就是我们鉴定的四因子是否在被结合的ES细胞或核移植进入卵
母细胞诱导的重编程中起到了作用。因为四因子在ES细胞中高水品的表达，合理的推测它
们与存在于ES细胞的重编程机制有关。我们的结果也与ES细胞中重编程活化在细胞核而不
是细胞质中这一发现一致。然而，iPS细胞不等同于ES细胞，就像已经在全部基因表达机制
和DNA甲基化状态显示的一样。有可能我们错过了额外的重要的因子。一个候选者是ECAT1，
尽管它在iPS细胞中的强迫表达没有连贯的正调节ES细胞的标记基因。
更难了解的是四因子，特别是Klf4和c-Myc，在观察卵母细胞重编程中的作用。Klf4和c-Myc
对于植入前小鼠的发育不是必要的。此外，c-myc没有在卵母细胞中被检测到。相反地，L-myc
在卵母细胞中母源表达。除了Klf4，Klf17和Klf7在从未受精小鼠卵的已表达序列标志表中被
发现。Klf4和c-Myc可能代偿这些关联蛋白。很有可能在卵母细胞中诱导完成重编程和多能
性还需要其他的因子。
转基因中的四因子需要维持iPS细胞因为内源基因中Oct4和Sox2的表达量仍然很低。我们
有意通过用两侧存在两个loxP位点的转基因和得到的一个iPS克隆来证明这个。然而，我们
注意到这些细胞在复合染色体处存在多重loxP位点，而且经过介导的重组不仅会引起转基因
的缺失，也会使染色体重排。研究这个条件表达体系比如四环素培养体系需要这个问题的答
案。
我们展示了iPS细胞能够在体外和体内甚至在包含四因子的逆转录病毒载体的条件下分
化。我们发现在体外分化的过程中Oct4和Sox2蛋白质下降明显。逆转录病毒的表达已经表
明在ES细胞中被支持，而且会进一步通过后天修饰比如DNA甲基化而分化沉默。相同的机
制也在iPS细胞的转基因抑制中发挥作用因为它们表达了Dnmt3a，3b和3l，尽管比ES细胞
中低。此外，我们发现iPS细胞具有一种降低转基因和Nanog蛋白质的表达量。相同的机制
可能在分化过程中增强。然而，在iPS-TTFgfp4-3细胞中沉默Oct4没有完成，这可能解释为
什么我们没有在iPS细胞囊胚显微注射后得到活着的小鼠。
在这个研究中一个预料以外的发现是通过结合没有Sox2的三个因子进行高效Fgf4和
Fbx15的活化因为这两个基因已经被发现能够被Oct4和Sox2协同调节。Nanog对于iPS细胞
的诱导和维持是不必要的也是一个惊人的发现。更多关于iPS细胞的细节分析会增强我们对
于多能性干细胞中转录调节的了解。
我们的发现可能有广泛的应用，就像我们发现了其他ES细胞标记基因的转基因报告基因，
比如Nanog，能够在筛选中替代Fbx15的敲入。然而，我们仍然不知道四因子能否从人体细
胞中得到多能性细胞。C-Myc的利用可能不适合临床应用，而且这个过程需要特殊的培养环
境。尽管如此，这个发现在控制多能性上是重要的一步，可能最终能够实现直接从病人体细
胞中获得多能性细胞的建立。
2024年9月13日发(作者：伯依云)
通过特殊因子培养小鼠胚胎和成体成纤维细胞的多能
性干细胞的诱导
摘要：分化的细胞可以通过转移核的内含物进入卵母细胞或结合胚胎干细胞来重编程到达
一个像胚胎的状态。又到这个重编程过程的因子却很少被人得知。本文中，我们确定了在
ES细胞培养条件下通过四个因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来将小鼠胚胎或成纤维细胞诱导
为多能性干细胞。出乎意料的，Nanog是不必要的。我们定义为iPS细胞的这些细胞，展示
了ES细胞的形态学和生长特性而且表达了ES细胞的标记基因。这些数据表明多能性干细胞
可以通过只有一小部分确定的因子直接从成纤维细胞中得到。
前言：ES细胞，从哺乳动物囊胚的内细胞团得到，有不确定的生长的能力保持了多能性
和分化为所有三胚层细胞的能力。人类ES细胞可能被用于治疗大量的疾病，比如帕金森脊
髓损伤和糖尿病。然而，关于利用人类胚胎存在一个伦理的困难，以及接下来的植入患者体
内的组织排斥性。解决这些难题的一个方法就是直接从患者自己的细胞中得到多能性干细胞。
体细胞可以通过将它们的核的内含物转移到卵母细胞中或与ES细胞结合来重编程，表明
了未受精的卵和ES细胞存在能给予体细胞全能性或多能性的因子。我们假设在维持ES细胞
恒定中其重要作用的因子在体细胞诱导多能性中也起关键的作用。
一些转录因子,包括Oct-4、Sox2、Nanog，在早期胚胎和ES细胞的多能性维持起作用。
一些在瘤中频繁的调试的基因例如Stat3，E-Ras，c-myc，Klf4和β-catenin已经被证实
能贡献于ES细胞表现型和体外培养ES细胞的快速增殖的长期维护。此外，我们已经坚定了
一些基因在ES细胞中是特定表达的。
在本文中，我们检查了这些因子能否在体细胞中诱导多能性。通过结合四个筛选因子，我
们能直接从小鼠胚胎或成纤维细胞培养中得到我们叫做iPS细胞的多能性细胞。
结果
基于我们的这些因子也在维护ES细胞特性中起到了重要作用这一假说，我们选择了24个基
因作为在体细胞中诱导多能性的候选因子。我们分别用S33Y-b-catenin，T58A-c-Myc和
Stat3-C激活b-catenin, c-Myc和Stat3。因为Grb2被报告在多能性上的负面作用，我们诱导
它的显性失活突变体Grb2△SH2作为24个候选因子之一。
为了评估这24个候选基因，我们发展了一个在多能性状态的诱导中的分析系统，能够检测
到对G418的抵抗。我们在小鼠Fbx15基因中通过同源重组插入了一个βgeo片段。尽管在小鼠
ES细胞和早期胚胎中特定表达，Fbx15对于维持多能性和小鼠的发育是不必要的。Βgeo基因
敲入的ES细胞纯合子对特别高的G418有抵抗作用，然而得自与βgeo敲入的Fbx小鼠的体细胞
对于一个正常的G418浓度是敏感的。我们期望甚至Fbx15位点的部分活化能够导致对正常浓
度的G418的抵抗作用。
我们将24个候选基因中的每一个通过逆转录病毒转导引入从βgeo敲入的Fbx15小鼠胚胎
得到的小鼠胚胎成纤维细胞中。转导的细胞之后在含有G418的ES细胞成分培养基中的STO饲
养层细胞上培养。然而，我们没有得到任何一个单因子的存在抗性的克隆，这表明没有单个
候选基因足够激活Fbx15位点。
相反的，一起转导全部的24个候选基因产生了22个G418抗性的克隆。我们继续培养筛选
的12个克隆中，5个展现了与ES细胞相似的形态，包括圆形，大核仁和较少的细胞质。我们
重复实验并发现了29个G418抗性的克隆，我们选取了6个克隆。这些克隆中的四个表现了与
ES细胞相似的形态学和增殖能力。这些细胞的增倍时间等价于ES细胞。我们命名这些由24
个因子诱导的小鼠胚胎成纤维细胞而成的多能性干细胞为iPS-MEF24。反转录PCR分析显示
iPS-MEF24克隆表达了ES细胞的标记基因，包括了Oct4，Nanog，E-Ras，Cripto, Dax1,和
Zfp296以及Fgf4器官。亚硫酸氢盐基因组测序表明Fbx15和Nanog的启动子在iPS细胞中被
脱甲基化。形成对比的，Oct4的启动子在这些细胞中仍然是甲基化的。这些数据证明着24
个候选因子的一些组合能在MEF培养中诱导ES细胞的标记基因表达。
然后，为了确定24个候选因子中的哪个是决定性的，我们检测了从转导基因的集合体中撤
回个别因子对产生G418抗性克隆的影响。我们鉴定了十个因子，将它们个别的从大量的转
到基因中撤回能导致转到后10天没有克隆形成，转导后16天只有少量的克隆形成。这十个
基因单独组合能比转导全部24个基因产生更多的ES细胞样的克隆。
我们随后检测了从这10个因子的集合体中撤回单个因子对克隆形成的影响。G418抗性克隆当
Oct4，Klf4任意一个不在时都不能形成。去除Sox2时只有少量的G418抗性克隆形成。当我
们移除c-Myc时，G418抗性克隆没有出现，但呈现出了一种平面的，不像ES细胞的形态。移
除剩下的因子没有明显的影响克隆的数目。这些结果表明Oct4，Klf4，Sox2和c-Myc在从MEF
中得到的iPS细胞的产生中有重要作用。
这四个基因的集合产生了与十个基因的集合相似数目的G418抗性克隆。我们继续12个克
隆的培养来转导并建立了4个4因子诱导的MEF的iPS克隆和5个10因子诱导的MEF的iPS克隆。
此外，我们能用野生型的c-Myc生产iPS细胞来代替T58A突变体。这些数据证明iPS细胞可以
通过导入四个转录因子Oct4，Klf4，Sox2和c-Myc对MEF诱导得到。
没有两个因子的集合体能够诱导出G418抗性克隆产生。两个由三个因子的组合Oct4，Sox2
和c-Myc与Klf4，Sox2和c-Myc能在每个例子中产生一个单独的，小的克隆，但是这些不能
在体外维持。在Oct4，Klf4，Sox2的组合中，我们观察到形成了36个G418抗性克隆，然而
却展示了一个扁平的，与ES细胞不同的形态。在Oct4，Klf4，c-Myc的组合中，我们观察到
形成了54个G418抗性克隆，其中我们选取了6个。尽管所有的6个克隆能维持几个超过几个
通道，这些细胞的形态与iPS-MEF4和iPS-MEF10细胞不同，带有iPS-MEF3克隆展现的粗
糙表面。这些数据指出Oct4，Klf4，c-Myc的组合能够活化Fbx15位点，但通过这三个因子
诱导唯一的改变就是与在iPS-MEF4和iPS-MEF10细胞中看到的形态不同。
我们进行RT-PCR来检测ES细胞标记基因是否在iPS细胞中表达。我们用能放大内源基因但
却不对转入的基因作用的引物。iPS-MEF10和iPS-MEF4 表达了除Ecat1外大多数标记基因。
这些标记基因的表达，包括Oct4，在iPS-MEF4-7, iPS-MEF10-6和iPS-MEF10-7克隆中比
剩下的可隆重高。Sox2只在iPS-MEF10-6中表达。iPS-MEF4克隆也表达了许多ES细胞的
标记基因。染色体免疫沉淀分析显示出Oct4和Nanog启动子增加了组蛋白H3的乙酰化和减
少了组蛋白H3的赖氨酸9的二甲基化作用。在这些启动子中的CpG辅酶在IPS细胞中局部甲
基化。iPS-MEF4
和
iPSMEF10细胞经过碱性磷酸酶和SSEA1检测后发现是阳性的而且表现
了高水平的末端转移酶端粒活性。这些结果证明iPS-MEF4
和
iPS-MEF10细胞是相似于ES
细胞，但却不是恒定的。
在iPS-MEF3克隆中，Ecat1, Esg1和 Sox2没有激活。Nanog被诱导，但比iPS-MEF4和
iPS-MEF10克隆中少。Oct4在iPS-MEF3-3, -5, 和 -6中微弱的活化但在剩下的克隆中没有
被激活。作为对照，E-Ras和Fgf4在iPS-MEF3相比于在iPS-MEF10或iPS-MEF4中更加有效
的活化。这些数据证实iPS-MEF3细胞实质上与iPS-MEF10和iPS-MEF4细胞不同。
我们用DNA微数列比较了ES细胞，iPS细胞和βgeo敲入的Fbx15的小鼠胚胎成纤维细胞的
全部基因表达的资料。此外，我们检测了四因子诱导没经过G418筛选的βgeo敲入的Fbx15
的小鼠胚胎成纤维细胞，使表达K-RasV12的小鼠胚胎成纤维细胞永生，NIH细胞与
H-RasV12转导。皮尔森相关分析显示iPS细胞是簇生的接近于ES细胞却又不同于成纤维细
胞以及它们的诱导药。微数列分析鉴定了通常在ES细胞核iPS细胞中正调节的基因，包括
Myb, Kit, Gdf3, and Zic3。其他基因在ES细胞、iPS-MEF4和iPS-MEF10克隆比iPS-MEF3
克隆中更有效的正调节，包括Dppa3, Dppa4, Dppa5, Nanog, Sox2，Esrrb和Rex1。这些基
因中低表达的可能能解释iPS-MEF3细胞中多能性的缺失。此外，我们发现一些基因在ES
细胞中比在iPS细胞中更显著，包括Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3l, Utf1, Tcl1以及LIF接受基因。
这些数据证实iPS细胞与ES细胞相似但不完全一致。
我们通过畸胎瘤的形成来检测iPS细胞的多能性。在皮下注射到裸鼠后我们获得了5个
iPS-MEF10克隆和3个iPS-MEF4克隆，1个iPS-MEF4wt克隆和6个iPS-MEF3克隆得到的瘤。
组织学的检测表明2个iPS-MEF10克隆，2个iPS-MEF4克隆和iPS-MEF4wt-4克隆分化出了
所有的三陪曾，包括神经组织，软骨和柱状上皮。iPS-MEF10-6甚至在30代后可以分化出
三陪曾。我们通过免疫荧光和RT-PCR确认分化出神经和肌肉组织。作为对照，这些畸胎瘤
不能表达滋养层标记Cdx2。iPS-MEF10-1的瘤分化出内胚层和外胚层，但是没有中胚层，
从剩下的iPS-MEF10 (7 and 10)或iPS-MEF4-10形成的瘤中没有观察到分化的标志。这些数
据证明大多数，但不是全部，iPS-MEF10和iPS-MEF4克隆呈现出多能性。
作为对照，所有得自于iPS-MEF3克隆的瘤都是由完全未分化的细胞组成。然而，尽管三个
因子（Oct3/4, c-Myc和Klf4）能优待一些ES细胞标记基因的表达，但是它们不能诱导多能
性。
iPS-MEF10, iPS-MEF4和iPS-MEF3在无包被的塑料平皿中形成拟胚体。当在组织培养皿中
生长时，iPS-MEF10和iPS-MEF4细胞形成的拟胚体黏着在平皿底部并开始分化。3天后，
免疫荧光检测到α-平滑肌肌动蛋白和α-胎儿球蛋白和β微管蛋白的阳性细胞。作为对照，
iPS-MEF3产生的拟胚体甚至在铺垫明胶后的平皿中都没有分化。这些数据表明iPS-MEF10
和iPS-MEF4在体外存在多能性以及iPS-MEF3不存在多能性。
我们接下来诱导四因子筛选进入得自于四只7周大的βgeo敲入Fbx15的C57/BL6-129杂合
雄性小鼠的TTF中。我们获得了3个G418抗性克隆，从每个我们建立的iPS细胞系中。我们
也将四个因子诱导入一只12周大的βgeo敲入Fbx15雌性小鼠中，这种小鼠通常表达来自于
CAG启动子的绿色荧光蛋白而且是C57/BL6-129-ICR杂合的。得到的13个G418抗性克隆中，
我们选取了能够建立iPS细胞系的六种克隆。此外，我们建立了另一种iPS-TTFgfp4，这种
细胞在转基因中四个因子的每一个的cDNA都存在两个loxP位点。这些细胞形态学上不能与
ES细胞区分。RT-PCR表明iPS-TTFgfp4的克隆3和7比较高程度的表达了ES细胞标记基因
的大部分而剩下的则比较低。另一中尝试，我们也用T58A突变体或c-Myc野生型来尽心转
导，建立了5个iPS-TTFgfp4克隆和3个iPS-TTFgfp4wt克隆。RT-PCR显示iPS-TTHgfp4wt
细胞液表达了ES细胞标记基因的绝大多数。
我们将2个iPS-TTF4和6个iPS-TTFgfp4克隆移植到裸鼠中，所有产生畸胎瘤的细胞都包含
了三胚层的组织。我们然后将iPS-TTFgfp4细胞的两个克隆通过显微注射导入了C57/BL6囊
胚中。用Ips-TTFgfp4-3，我们获得了13.5天的18个胚胎，其中的两个展示了有GFP-阳性的
iPS细胞存在。组织学分析确认iPS细胞贡献于所有的三胚层。我们在生殖腺中观察到GFP-
阳性细胞但是不能确定他们是生殖细胞还是体细胞。用iPS-TTFgfp4-7，我们获得了7.5天的
2个胚胎，其中的3个是GFP阳性的。用2个克隆，我们得到了27只小鼠，但是它们都不是嵌
合小鼠。此外，iPS-TTFgfp4细胞能在体外分化成三胚层。这些数据表明四个筛选因子能诱
导成体小鼠成纤维细胞产生多能性细胞。
我们进一步检测了在iPS细胞中四个因子和其他因子的表达。Real-time PCR显示iPS细胞中
Oct4和Sox2的内源性表达水平比ES细胞低。然而，内源基因和转基因中四因子的总体的量
超过了ES细胞中正常的表达量。作为对照，Western blot分析显示在iPS细胞中四个因子的
总蛋白量于ES细胞中的那些进行对比。我们可以在iPS细胞中检测到Nanog和E-Ras的蛋白
质，但是比ES细胞的低。在iPS细胞中P53蛋白的水平比MEF中的低，与ES细胞中的相当。
IPS细胞每个克隆中的p21蛋白的水平都不同而且介于MEF与ES细胞之中。继续在体外分化，
Oct4和Sox2的总体mRNA表达水平降低但是仍让比ES细胞中的高许多。相反地，它们的蛋
白质水平降低到与iPS和ES细胞中相当的程度。
Southern blot分析显示每个iPS克隆有一个独特的转基因整合机制。IPS-TTFgfp4和
iPS-TTFgfp4wt克隆的核型分析显示2个iPS-TTFgfp4的克隆和所有的iPS-TTFgfp4wt克隆
展现了一个正常的40XX的核型，然而其他的3个iPS-TTFgfp4的克隆是39XO，40XO+10和
40Xi（X）。以PCR为基础的简单序列长度多态性的分析显示iPS-MEF克隆有一个C57/BL6
和129混合的背景，然而iPS-TTFgfp的克隆却是ICR,C57/BL6和129混合的。最终，我们发
现了iPS细胞在培养基缺少饲养层细胞，甚至缺少LIF时不能够保持未分化。这些结果，与不
同的基因表达模式，排除了iPS细胞仅仅是预成ES细胞的污染的可能性。最终，iPS细胞的
亚克隆是碱性磷酸酶检验阳性而且在体外能够分化出三胚层，证实了它们无性繁殖的本质。
讨论
Oct4，Sox2和Nanog已经被展示了作为维持多能性的核心转录因子的功能。在这三个中，
我们发现Oct4和Sox2对于iPS细胞的产生是必要的。令人惊讶的是，Nanog是非必要的。此
外，我们鉴定了c-Myc和Klf4作为核心因子。这两个与肿瘤相关的因子不能被包括E-Ras,
Tcl1, β-catenin,和Stat3在内的其他癌基因代替。
c-Myc蛋白质有许多增强增值和转化的下游区靶位点，其中的许多在iPS细胞的产生中发
挥作用。著名的，c-Myc与组蛋白乙酰基转移酶（HAT）的合成有关，包括TRRAP，TIP60
和GCN5的HAT合成的一种核心亚基，以及p300。带有哺乳动物的基因组，可能存在2500
个c-Myc结合位点，比Oct4和Sox2结合位点多的多。C-Myc蛋白质可能诱导全面的组蛋白乙
酰化作用，因此允许Oct4和Sox2结合到它们的特殊靶器官。
Klf4已经被发现能直接抑制p53，p53蛋白质已经被发现能在ES细胞分化的过程中抑制
Nanog。我们发现iPS细胞显示p53的蛋白质含量低于MEF中的级别。因此，Klf4可能通过抑
制p53蛋白来贡献于活化Nanog和其他ES细胞特化因子。在我们的体系中Klf4可能通过抑制
p53蛋白作为Myc诱导的细胞凋亡的抑制剂。另一方面，Klf4活化了p21，从而抑制细胞增殖。
Klf4的这种抗增殖作用可能被能够抑制p21表达的c-Myc抑制。这种c-Myc和Klf4之间的平衡
可能对于iPS细胞的产生非常重要。
一个问题存在关系着我们iPS细胞的起源。用我们的逆转录病毒体系，我们发现只有表达
四因子细胞中的一小部分成为了iPS细胞。低概率意味着共存于成纤维细胞培养的稀有的祖
细胞可能会引起iPS发生。实际上，多能性干细胞已经被从皮肤中分离出来。这些研究表明
大约0.067%的小鼠皮肤细胞是干细胞。一种对于iPS细胞诱导低效率的解释是四因子转化了
组织干细胞。然而，我们发现四因子甚至从应该存在浓缩的间质干细胞和其他多能性细胞的
骨髓间充质诱导iPS也是同等的低效率。此外，被三个因子诱导的细胞是无多能性的。DNA
微阵列分析显示iPS-MEF3和iPS-MEF3细胞存在相同的区域。这些结果没有显示多能的组
织干细胞是iPS细胞的起源。
关于得到iPS细胞的低概率存在其他几种可能性。第一，能够产生多能性细胞的四因子级
别可能是一个狭窄的范围，只有一小部分正确表达四因子级别的细胞能够获得像ES细胞一
样的特性。与这个意图一致，仅仅Oct4蛋白质50%的增加或减少会诱导ES细胞分化。当分
析RNA级别时，IPS克隆过表达了四因子，但是它们的蛋白质级别与ES细胞中一致，着暗
示了iPS克隆具有一种能够紧密调节四因子蛋白质级别的机制。我们推测四因子的高额度在
iPS细胞产生的初级阶段是必需的，但是，一旦它们获取了类似ES细胞的状态，太多的因子
对自我更新是有害的。只有一小部分的转导细胞展现了比较恰当的转基因表达。四儿，多能
性细胞的产生可能需要额外的染色体修饰，能够在培养或被四因子中的一些诱导时自发的替
代。尽管iPS-TTFgfp4克隆存在大量的正常核型，我们不能排除较少的染色体修饰的存在。
专一位点逆转录病毒的插入可能也起一定作用。Southern blot分析展示了每个iPS克隆存在
大约20个逆转录病毒的整合。这些中的一些可能已经引起沉默或内源基因的结合。进一步
的研究需要决定iPS细胞的起始。
其他没有得到解决的问题就是我们鉴定的四因子是否在被结合的ES细胞或核移植进入卵
母细胞诱导的重编程中起到了作用。因为四因子在ES细胞中高水品的表达，合理的推测它
们与存在于ES细胞的重编程机制有关。我们的结果也与ES细胞中重编程活化在细胞核而不
是细胞质中这一发现一致。然而，iPS细胞不等同于ES细胞，就像已经在全部基因表达机制
和DNA甲基化状态显示的一样。有可能我们错过了额外的重要的因子。一个候选者是ECAT1，
尽管它在iPS细胞中的强迫表达没有连贯的正调节ES细胞的标记基因。
更难了解的是四因子，特别是Klf4和c-Myc，在观察卵母细胞重编程中的作用。Klf4和c-Myc
对于植入前小鼠的发育不是必要的。此外，c-myc没有在卵母细胞中被检测到。相反地，L-myc
在卵母细胞中母源表达。除了Klf4，Klf17和Klf7在从未受精小鼠卵的已表达序列标志表中被
发现。Klf4和c-Myc可能代偿这些关联蛋白。很有可能在卵母细胞中诱导完成重编程和多能
性还需要其他的因子。
转基因中的四因子需要维持iPS细胞因为内源基因中Oct4和Sox2的表达量仍然很低。我们
有意通过用两侧存在两个loxP位点的转基因和得到的一个iPS克隆来证明这个。然而，我们
注意到这些细胞在复合染色体处存在多重loxP位点，而且经过介导的重组不仅会引起转基因
的缺失，也会使染色体重排。研究这个条件表达体系比如四环素培养体系需要这个问题的答
案。
我们展示了iPS细胞能够在体外和体内甚至在包含四因子的逆转录病毒载体的条件下分
化。我们发现在体外分化的过程中Oct4和Sox2蛋白质下降明显。逆转录病毒的表达已经表
明在ES细胞中被支持，而且会进一步通过后天修饰比如DNA甲基化而分化沉默。相同的机
制也在iPS细胞的转基因抑制中发挥作用因为它们表达了Dnmt3a，3b和3l，尽管比ES细胞
中低。此外，我们发现iPS细胞具有一种降低转基因和Nanog蛋白质的表达量。相同的机制
可能在分化过程中增强。然而，在iPS-TTFgfp4-3细胞中沉默Oct4没有完成，这可能解释为
什么我们没有在iPS细胞囊胚显微注射后得到活着的小鼠。
在这个研究中一个预料以外的发现是通过结合没有Sox2的三个因子进行高效Fgf4和
Fbx15的活化因为这两个基因已经被发现能够被Oct4和Sox2协同调节。Nanog对于iPS细胞
的诱导和维持是不必要的也是一个惊人的发现。更多关于iPS细胞的细节分析会增强我们对
于多能性干细胞中转录调节的了解。
我们的发现可能有广泛的应用，就像我们发现了其他ES细胞标记基因的转基因报告基因，
比如Nanog，能够在筛选中替代Fbx15的敲入。然而，我们仍然不知道四因子能否从人体细
胞中得到多能性细胞。C-Myc的利用可能不适合临床应用，而且这个过程需要特殊的培养环
境。尽管如此，这个发现在控制多能性上是重要的一步，可能最终能够实现直接从病人体细
胞中获得多能性细胞的建立。