2024年7月22日发(作者：绳安阳)
中 文 说 明 书
Lumit™ HMGB1 (Human/
Mouse) Immunoassay
适用产品目录号：
W6110和W6112
2022
原英文技术手册
版 CTM681
TM681
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse)
Immunoassay
所有技术文献的英文原版均可在
本。如果您在使用该试剂盒时有任何问题，请与
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1. 描述 ....................................................................................................................................................................................2
2. 产品组分和储存条件............................................................................................................................................................4
3. 开始实验前 ..........................................................................................................................................................................5
4. 培养细胞的直接（无转移）方案 ..........................................................................................................................................7
4. A. 细胞铺板和处理......................................................................................................................................................... 7
4. B. 制备重组人HMGB1阳性对照系列稀释液 .................................................................................................................7
4. C. 添加5X抗hHMGB1抗体混合物至检测孔.................................................................................................................9
4. D. 添加Lumit™检测试剂B至检测孔 ..........................................................................................................................10
4. E. 可选：结合CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay进行细胞存活率多重检测............................................10
5. 分析结果 ...........................................................................................................................................................................11
6. 代表数据 ...........................................................................................................................................................................12
7. 疑难解答 ...........................................................................................................................................................................15
8. 附录 ....................................................................................................................................................................................16
8. A. 细胞模型和标准操作流程 .........................................................................................................................................16
8. B. 温度 .........................................................................................................................................................................16
8. C. 光谱干扰..................................................................................................................................................................16
8. D. 可选样品转移检测方案的注意事项 ...........................................................................................................................17
8. E. 3D细胞模型 ............................................................................................................................................................17
8. F. 参考文献...................................................................................................................................................................17
8. G. 相关产品..................................................................................................................................................................18
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1
1.
描述
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
(a,b)
是一款均质生物发光检测试剂盒，适用于检测细胞所释放的高迁
移率族蛋白B1（High Mobility Group Box 1 protein，HMGB1）。使用本试剂盒时，无需样品转移或洗涤。HMGB1
是一种含量丰富且高度进化保守的蛋白，其在细胞内和细胞外均具有重要生物活性。HMGB1一般以与DNA和组蛋白
结合物的形式存在于细胞核内，其作用为调节转录并辅助排列和塑造染色质结构。当HMGB1易位至细胞质时，其可辅
助介导自噬。在免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death，ICD）过程中，ICD诱导治疗导致肿瘤或溶瘤病毒感染
细胞通过主动或被动机制释放HMGB1。被转运出垂死肿瘤细胞后，HMGB1作为损伤相关分子模式（Damage-Associated
Molecular Pattern，DAMP）分子，可促进树突状细胞向肿瘤床的募集（1,2）。
检测原理
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay适用于细胞培养样品。Lumit™试剂可直接添加至含细胞和培养基的
孔板孔中。或者，用户可转移细胞上清液。用户需自行确定检测其他类型样品的检测性能。本试剂盒可检测人和小鼠
HMGB1。
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay基于NanoLuc
®
Binary Technology（NanoBiT
®
）。NanoBiT为发光
的结构互补系统，用于生物分子相互作用研究（3,4）。此系统由两个亚基组成，大亚基Large BiT（LgBiT；18kDa）
和小亚基Small BiT（SmBiT；11个氨基酸肽）。LgBiT和SmBiT已经过优化，拥有良好的稳定性和最小化的自联。
检测时，会将样品与SmBiT或LgBiT共价标记的1对抗人HMGB1单克隆抗体一起孵育。当标记的抗体识别释放的
HMGB1并与之结合时，使得互补的LgBiT和SmBiT分子接近，从而重构NanoBiT
®
酶并在Lumit™底物存在的情况
下产生发光。产生的发光信号与样品中分析物量成正比。
2
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HMGB1
LgBiTSmBiT
HMGB1
C
Anti hHMGB1
抗hHMGB1
M
5
4
mAb-LgBiT
mAb-LgBiT
LgBiTSmBiT
Anti hHMGB1
抗hHMGB1
mAb-SmBiT
mAb-SmBiT
NanoBiT
NanoBiT
®
enzyme
®
酶
3
7
1
图
1.
检测原理。人HMGB1单克隆一抗经SmBiT和LgBiT标记。当HMGB1存在时，SmBiT和LgBiT会彼此靠近，从
而形成NanoBiT
Anti hHMGB1
mAb-LgBiT
®
酶。当添加Lumit™检测试剂
Anti hHMGB1
mAb-SmBiT
B时，可产生明亮的发光信号。
NanoBiT
®
enzyme
Sample Plate
igure 1. Assay principle. Primary monoclonal antibodies to human HMGB1 are labeled with SmBiT and LgBiT. In
the presence of HMGB1, SmBiT and LgBiT are brought into close proximity, forming the NanoBiT
®
enzyme. When
Lumit™ Detection Reagent B is added, a bright luminescent signal is generated.
Sample Plate
样品板
cells or cell supernatants.
Samples can be cultured Add antibody
mixture.
Add Lumit™ Detection
Reagent B.
luminescence.
Measure
C
M
6
4
3
7
1
Total assay time: 60–90 minutes
Samples can be cultured
样品为培养的细胞或添加抗体混合物。检测发光信号。
cells or cell supernatants.
细胞上清液。
Add antibody
添加Lumit™
mixture.
Add Lumit™ Detection
检测试剂
Reagent B.
B。
luminescence.
Measure
Total assay time: 60–90 minutes
总检测时间：60~90分钟
图
2.
检测方案。使用Lumit™ HMGB1 Immunoassay直接检测培养的细胞或细胞上清液（转移至另一检测板）。
Lumit™ Immunoassay检测方案中不涉及洗涤步骤，且60~90分钟内便可完成检测。
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2.
产品组分和储存条件
产品
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
规格
100 assays
目录号
W6110
使用96孔板时，可进行100次检测；包括：
•
•
•
•
•
50µl
50µl
20µl
160µl
3.2ml
抗hHMGB1 mAb-SmBiT，250X
抗hHMGB1 mAb-LgBiT，250X
HMGB1（人）阳性对照
Lumit™检测底物B
Lumit™检测缓冲液B
产品
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
规格
5×100 assays
目录号
W6112
使用96孔板时，可进行500次检测；包括：
•
•
•
•
•
5×50µl
5×50µl
20µl
5×160µl
5×3.2ml
抗hHMGB1 mAb-SmBiT，250X
抗hHMGB1 mAb-LgBiT，250X
HMGB1（人）阳性对照
Lumit™检测底物B
Lumit™检测缓冲液B
储存条件：所有组分均置于-30℃至-10℃条件下储存。解冻后，应将HMGB1（人）阳性对照置于+2℃至+10℃条件
下储存（最长为1个月）。若解冻后HMGB1（人）阳性对照的储存时间超1个月，则应进行分装，并置于-30℃至-10℃
条件下储存。解冻后，将Lumit™检测缓冲液B置于室温条件下储存。长期储存Lumit™检测底物B时，应避光储存。
说明：本检测试剂盒随附HMGB1（人）阳性对照用作阳性对照蛋白。从其他供应商处购买的商品化重组小鼠HMGB1
蛋白也可用作阳性对照蛋白。
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3.
开始实验前
第4节中详细介绍的直接（无转移）检测方案已优化，适用于直接在细胞培养孔中检测HMGB1（人或小鼠）。取20μl
5X抗体混合物，加至80μl培养基（含细胞或HMGB1（人）阳性对照稀释液）中，并孵育60~90分钟。孵育后，加入
25μl Lumit™检测试剂B并记录发光信号。
说明：
a. 第4节所述检测方案列出了96孔板常用体积。也可使用其他体积，但最终抗体浓度保应为1:250，且应添加5X浓
度的Lumit™检测试剂B（最终稀释比例应为1:100）。
b. 我们建议使用含5~10%胎牛血清（FBS）的标准组织培养基。较低浓度FBS可能导致背景（非分析物介导的抗体配对）
升高和重复测量变异性增大。使用不含酚红的培养基可提高检测灵敏度和减少发光信号猝灭的内滤效应。
c. 若需检测转移后细胞上清液中的HMGB1，参见第8.D节获取重要注意事项相关信息。
试剂制备和储存
临用当天，制备HMGB1（人）阳性对照系列稀释液、Lumit™抗体混合物和Lumit™检测试剂B。不可重复使用HMGB1
阳性对照系列稀释液、
the
（人）
Lumit™抗体混合物和Lumit™检测试剂B。
!
Us
wo
处理细胞和细胞培养试剂等生物危害性材料时，应穿戴个人防护设备并遵守就职机构的安全指南和处置要求。
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3.
开始实验前（续）
两种检测方案的检测板图
HMGB1阳性对照系列
稀释液（ng/ml）*
1
A
B
C
D
E
F
G
H
1000
400
160
64
25.6
10.2
4.1
0
2
1000
400
160
64
25.6
10.2
4.1
0
3456
测试样品
789101112
*说明：上述HMGB1（人）阳性对照系列稀释液浓度以及后续操作流程说明所述HMGB1（人）阳性对照系列稀释液浓
度仅为推荐浓度。
用户需提供的材料
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
细胞（人源或小鼠源）
培养基【我们建议使用含10%胎牛血清（FBS）的标准组织培养基】
可选：重组小鼠HMGB1蛋白
血细胞计数器和台盼蓝
白色、组织培养多孔板（纯白色或白色、底部透明），与光度计兼容性良好（例如，Corning
®
96孔板，目录号：3917）
多通道移液器或自动移液站
稀释管或多隔室稀释槽（例如，Dilux
®
目录号：D-1002）
试剂槽托盘（例如，Midwest Scientific目录号：RR25）
多孔板混匀用板振荡器
可读取多孔孔板的光度计（例如，GloMax
®
Discover System目录号：GM3000）
阳性对照HMGB1释放诱导剂（例如，多柔比星、伊达比星或米托蒽醌）
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4.
培养细胞的直接（无转移）方案
此方案介绍了如何直接检测含细胞和培养基的检测孔中的HMGB1。鉴于需设置阳性对照，因此使用培养基和HMGB1（人）
阳性对照蛋白制备阳性对照系列稀释液。
说明：或者，若需检测细胞上清液中HMGB1，则按每孔80μl将样品分装至96孔检测板，然后按第4.B节所述内容操作。
使用细胞上清液时，参见第8.D节获取重要注意事项相关信息。
4.A.
细胞铺板和处理
1. 将细胞铺板至纯白色（或白色但底部透明）、96孔组织培养板中。列1和列2不添加细胞。若使用的是贴壁细胞，
则应使细胞贴壁。
说明：虽然检测方法的动态范围较大且可灵活选择细胞数量，但还是应根据经验确定特定细胞模型每孔分装的最佳
细胞数量。确保释放的最高水平HMGB1不超过检测方法的线性范围。在线性范围内，可增加细胞数量从而满足低
水平HMGB1检测要求。
2. 取特定体积的测试化合物加至每一孔中，处理细胞，并使每孔总体积为：
96
孔板：每孔80µl。
例如，若96孔板每孔已铺板40μl细胞，那么则应取40μl 2X处理化合物加至培养基中。需根据经验确定细胞与测
试化合物的孵育时间，从而确保HMGB1释放量最大。在本检测方案示例中，一般过夜（18~24小时）处理细胞，
或根据使用的具体刺激物种类也可能需要更长处理时间，从而观察相较于未处理对照的HMGB1释放水平。
4.B. 制备重组人HMGB1阳性对照系列稀释液
细胞处理即将结束前，使用细胞样品培养用培养基制备HMGB1（人）阳性对照稀释液。
说明：若使用的是多细胞模型且每一细胞模型需不同培养基，则必须使用不同培养基制备相应阳性对照系列稀释液。
1. 临用前，解冻HMGB1（人）阳性对照（室温放置约15分钟）。
2. 启用前，先短暂离心阳性对照管，然后吹打使之混匀。
3. 使用预热后细胞培养基（人细胞培养常用的含10%胎牛血清（FBS）标准组织培养基）并按1:500稀释比例对
HMGB1（人）阳性对照（500µg/ml）进行稀释，从而制备起始浓度（1000ng/ml）的人HMGB1。例如，取3μl
HMGB1（人）阳性对照储备液加至1497μl培养基，从而制备1500μl 1000ng/ml人HMGB1（参见图3）。
4. 取7支试管（或于稀释槽七个隔室），每一试管或每一隔室加入600μl培养基。
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4.B.
制备重组人HMGB1阳性对照系列稀释液（续）
5. 制备2.5倍阳性对照系列稀释液。取400μl 1000ng/ml起始浓度人HMGB1稀释液（步骤3）加至600μl培养基中，
以进行第二次稀释。混匀并再重复相同步骤5次，从而制备7个浓度水平阳性对照稀释液（浓度范围为4.1~1000ng/
ml）。最后一个孔或隔室仅应加入培养基用作本底对照。
culture medium as the background control.
转移
400µl
Transfer
加入
3μl 500μg/ml
Add 3µl of 500µg/ml
HMGB1 (Human)
HMGB1（人）阳性
Positive Control
对照
400µl400µl400µl
本底对照
400µl400µlBackground
control
培养基体积
Medium Volume
1,500µl600µl600µl600µl600µl600µl600µl600µl
Human HMGB1
人HMGB1浓度
(ng/ml)
1,5.610.24.10
Concentration
图
3. HMGB1
（人）阳性对照系列稀释液。此系列稀释液浓度仅为推荐浓度。
6. 细胞处理结束后，取阳性对照稀释液和本底对照（2个复孔）加至检测板的两列（请参见第3节，开始实验前，检测板图）。
96
孔板：每孔分装80µl。
说明：剩余HMGB1（人）阳性对照（500µg/ml）可于4℃条件下储存1个月。若阳性对照的储存时间超1个月，
则应进行分装，并置于-30℃至-10℃条件下储存。避免反复冻融。
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1
7
3
4
7
M
C
4.
C. 添加
5X
抗hHMGB1抗体混合物至检测孔
说明：若使用的是多细胞模型且每一细胞模型需不同培养基，则必须使用不同培养基制备对应的5X抗hHMGB1抗体混
合物。
1. 临用前，从-20℃处取出抗hHMGB1抗体。
说明：若Lumit™检测缓冲液B尚未解冻，则此时还应将其从-20℃处取出解冻并平衡至室温。
2. 启用前，先短暂离心阳性对照管，然后吹打使之混匀。
3. 临用前，使用预热培养基并按1:50稀释比例对两种抗体进行稀释，从而制备5X抗体混合物。吹打使抗体溶液混匀。
若需检测整块96孔板（包括过量试剂，用于弥补移液过程损耗），则应根据下述内容制备5X抗体混合物：
若需检测整块96孔板或384孔板（包括过量试剂，用于弥补移液过程损耗），则应根据下述内容制备5X抗体混合物：
试剂体积
culture medium
2.4ml
Anti-hHMGB1 mAb-SmBiT50µl
Anti-hHMGB1 mAb-LgBiT50µl
4. 取5X抗hHMGB1抗体混合物加至含有培养细胞或HMGB1（人）阳性对照孔中，若从高浓度分析物至低浓度分析
物依次添加，则应尽量每次更换移液器吸头，从而避免孔之间出现交叉污染。
96
孔板：每孔分装20μl 5X抗hHMGB1抗体混合物至80μl细胞或HMGB1（人）阳性对照稀释液中。
5. 使用板振荡器混匀片刻（例如，250~350rpm混合10秒）
6. 于室温条件下孵育60~90分钟。
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4.D.
添加Lumit™检测试剂B至检测孔
当细胞与抗hHMGB1抗体混合物一起孵育时（第4.C节），制备Lumit™检测试剂B。
1. 取所需量Lumit™检测缓冲液B平衡至室温。
2. 从-20℃处取出Lumit™检测底物B，并混匀。若Lumit™检测底物B附着于管盖或管侧，则应离心片刻。
3. 使用Lumit™检测缓冲液B（室温）对Lumit™检测底物B进行稀释（稀释比例为1:20），从而制得检测用足量
Lumit™检测试剂B。若需检测96孔板（包括过量试剂），则应根据下述内容制备5X Lumit™检测试剂B：
试剂
Lumit™ Detection Buffer B
Lumit™ Detection Substrate B
体积
3040µl
160µl
说明：复溶后，Lumit™检测试剂B于20℃条件下放置约3小时后其活性便会降低10%。复溶后的试剂于4℃条件
下放置约7小时后其活性会降低10%。
4. 孵育（第4.C节步骤6）后，使用多通道移液器将5X Lumit™检测试剂B（室温）加至每一检测孔中。
96
孔板：每孔分装25µl。
5. 使用板振荡器混匀片刻（例如，300~500rpm混合10秒）
6. 孵育3~5分钟。
7. 读取发光信号。
说明：检测信号稳定，半衰期约为2小时，可与同时处理多个检测板的批量实验兼容。我们建议在每块检测板上添
加HMGB1阳性对照，以便进行归一化处理。
4.E.
可选：结合CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay进行细胞存活率多重检测
说明：需于Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay（第4.A~4.D节）检测结束后进行可选CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay检测。
1. 购买CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay（目录号：G7570）并根据CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell
Viability Assay说明书TB288所述内容进行操作。示例数据参见图7。
2. Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay检测结束后，向含细胞的孔（处理和未处理）中加入100µl CellTiter-
Glo
®
试剂。
3. 置于定轨振荡器（300~500rpm）混合30秒。
4. 10分钟后，测量发光信息。
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5.
分析结果
可采用两种主要方式处理Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay测得数据。第1种为比较相对于未诱导细胞
对照的诱导影响，第2种为通过阳性对照曲线计算HMGB1释放值。无论采用何种方式，首先均应通过阳性对照系列稀
释液确定检测性能。
说明：HMGB1（人）阳性对照仅供研究使用，未使用独立的HMGB1标准物质进行标定。不同批次阳性对照细微差异可
能导致测得分析物量存在细微差异。
阳性对照稀释液和曲线：数据处理方式为取每一浓度HMGB1（人）阳性对照和本底对照复孔的发光信号（RLU）读数
平均值。然后再用每一HMGB1（人）阳性对照浓度的平均RLU减去本底对照平均RLU。可使用具备简单线性回归分析
功能的软件（例如GraphPad
®
Prism）绘制曲线。或者，可使用Microsoft Excel
®
中幂（Power）趋势线对平均RLU（减
去本底）和HMGB1阳性对照浓度进行对数图拟合（参见第6节）。虽然不同供应商提供光度计的总体信号强度（RLU）
可能存在一定差异，但合理使用Lumit™ HMGB1 (Human/ Mouse) Immunoassay以及随附重组抗原可得到良好线性结
果（r
2
＞0.95）。
实验诱导与未诱导对照：大多数试剂盒用户会发现处理数据集的最直接简单方式是比较相对于未处理对照的HMGB1释
放量。同阳性对照系列稀释液数据处理方法一致，诱导和未诱导复孔均应减去来本底对照平均发光信号。然后绘制发光
信号—浓度曲线。可通过将该值除以未诱导对照，从而计算每一浓度诱导比。
阳性对照系列稀释液插值计算：若有必要，可采用此分析模式，但是其具有一定局限性。为获得最佳结果，应使用无酚
红培养基从而消除暴露期间因处理和未处理细胞之间细胞生长差异而导致的内滤效应。此外，可能需要收集和使用条件
培养基（可能含基础水平HMGB1）制备最适合检测未知样品的阳性对照系列稀释液。用户应期望进行其他样品矩阵模
型改进来使用此分析模式。
同阳性对照系列稀释液，诱导和未诱导复孔数据处理方法一致，均应减去来本底对照平均发光信号。一般采用二阶或三
阶多项式回归、三次样条或四参数逻辑（4PL）曲线拟合进行插值分析。
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11
6.
代表数据
6. Representative Data
10,000,000
y = 7,657.81x
0.94
r² = 1.00
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
1,000,000
100,000
10,000
1,000
HMGB1 (Human) Positive Control (ng/ml)
图
4. Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
的阳性对照系列稀释浓度。本代表数据通过HMGB1（人）阳
性对照系列稀释液测得，不可用于计算未知样品浓度。每一检测板上制备阳性对照系列稀释液用作阳性对照和归一化处理。
说明：发光信号值已减去本底信号。
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0
M
A
1101001,00010,000
10,000,000
y = 593.94x
1.12
)
U
L
1,000,000
r² = 0.99
R
(
e
c
n
e
c
100,000
s
e
n
i
m
u
L
10,000
1,000
1101001,00010,000
A
M
1
Recombinant Mouse HMGB1 (ng/ml)
1
9
7
1
Figure 5. The Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay using recombinant mouse HMGB1
图
5.
使用Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay检测重组小鼠HMGB1蛋白。本代表数据通过重组小鼠
HMGB1蛋白系列稀释液测得，不可用于计算未知样品浓度。每一检测板上制备阳性对照系列稀释液用作阳性对照和归
一化处理。说明：发光信号值已减去本底信号。
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6.
代表数据（续）
6.
A.
Representative Data (continued)
B.
200,000
400,000
L
u
m
i
n
e
s
L
c
u
e
m
n
c
(
s
R
c
L
e
U
)
c
e
(
R
L
U
)
i
e
n
e
n
A.
150,000
200,000
100,000
150,000
50,000
100,000
0
50,000
0
10
B.
EC
50
= 1,777nM
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
300,000
400,000
200,000
300,000
100,000
200,000
100,000
0
EC
50
= 405.8nM
EC
50
= 1,777nM EC
50
= 405.8nM
untreated
cell baseline
untreated
cell baseline
untreated
cell baseline
10,000
1
7
9
1
2
M
A
0
101001,000
untreated
10,000
cell baseline
101001,000
Log
10
[doxorubicin], nM
1001,00010,000
Log
10
[doxorubicin], nM
101001,00010,000
图
6.
细胞ICD模型中的HMGB1生物释放量。人U2OS细胞（图A）和小鼠EL4细胞（图B）经多柔比星处理24小时。
1010
使用Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay直接检测细胞培养样品，从而测量处理后细胞产生的HMGB1。
Figure 6. Biological release of HMGB1 in cell-based ICD models. Human U2OS cells (Panel A) and mouse
EL4 cells (Panel B) were treated with doxorubicin for 24 hours. The Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
CellTiter-Glo
®
Assay alone in parallel plate, EC
50
= 145nM
was performed directly on cell culture samples to measure detectable HMGB1 produced from treated cells.
CellTiter-Glo
®
Assay added after Lumit™ HMGB1 Immunoassay, EC
50
= 149nM
CellTiter-Glo
®
Assay alone in parallel plate, EC
50
= 145nM
Log[doxorubicin], nMLog[doxorubicin], nM
CellTiter-Glo
®
Assay added after Lumit™ HMGB1 Immunoassay, EC
50
= 149nM
L
u
m
i
n
c
i
e
n
c
e
(
R
)
(
R
L
U
)
L
e
u
s
m
n
e
s
c
e
n
L
c
U
e
1.50 × 10
7
1.25 × 10
7
1.00 × 10
7
0.75 × 10
7
0.50 × 10
7
0.25 × 10
7
0
1
®
Figure 7. A same-well multiplex with the CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay reduces effort and
Log
10
[idarubicin], nM
saves resources. Mouse EL4 cells were challenged with serial dilutions of idarubicin in parallel plates for 24 hours.
At the end of the exposure, the Lumit™ HMGB1 Human/Mouse Immunoassay reagent was added to one plate and
图
7.
使用CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay进行同孔多重检测，减少工作量并节约资源。平行板中小
®
data collected (data not shown). Next, the CellTiter-Glo
Reagent was prepared and added directly to both plates.
鼠EL4细胞经伊达比星系列稀释液处理24小时。处理结束时，取Lumit™ HMGB1 Human/Mouse Immunoassay加至
Luminescence was collected and plotted for both data sets.
一块板中并收集数据（数据未列出）。然后，制备CellTiter-Glo
®
试剂并将其直接加至两块板中。收集两块板的数据集并
绘制相应曲线。
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A
Log
10
[idarubicin], nM
101001,00010,000
7.
疑难解答
如果您遇到的问题在此没有列出，请联系普洛麦格（北京）生物技术有限公司或当地经销商。联系信息见：www.
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问题原因和参考建议
阳性对照无信号检测过程或光度计设置存在技术问题。
若观察到
原因可能导致细胞无信号：
HMGB1（人）阳性对照系列稀释液发光信号存在正相关性，则3个
• 测试化合物处理后，HMGB1释放量无法检出。我们建议使用参比ICD诱
处理后的细胞无信号。
导剂（例如米托蒽醌和多柔比星）作为对照毒素。
• 释放至细胞外环境中
®
HMGB1抗原可能随时间逐渐降解。我们建议使用
CellTiter-Glo
Assay检测细胞毒性或于早期进行检测。
• 使用了非人或非小鼠细胞系。我们尚未对其他物种进行检测，因此尚不确定
检测这些细胞系的检测性能。
第3节检测板图所列2.5
人HMGB1系列稀释液线性不佳
推荐浓度。不同培养基、光度计可能存在轻微差异，不同用户间也可能存在一
倍阳性对照系列稀释液浓度和图3方案所述浓度仅为
定差异。建议先使用推荐的阳性对照系列稀释液方案，然后根据实际情况进行
优化。
不同次检测的阳性对照系列稀释液的相对
光单位（RLU）存在一定差异
虽然培养条件、温度等因素可能会使
试样品均于相同条件下、同一板中被检测，那么便可准确定量
RLU发生变化，但是只要阳性对照与测
HMGB1释放量。
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8.
附录
8.A.
细胞模型和标准操作流程
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay是一款高灵敏度的均质检测试剂盒，适用于检测释放的HMGB1。同测
量细胞健康相关参数的试剂盒，应充分验证模型（细胞数量和暴露时间），从而确保实验期间未处理细胞维持最佳活力。
对于敏感型细胞（易发生机械或酶促弥散），传代操作应尽量轻柔。处理这些细胞系时，我们建议在传代后设置至少6
小时的适应期，或给药处理前更换培养基。未优化细胞健康参数可能导致未处理孔中HMGB1水平升高和化合物活性的
高估。
温度
8.B.
互补NanoBiT
®
萤光素酶的酶活性取决于温度。测试化合物暴露期间应维持37℃环境温度，并于抗体/检测步骤孵育期
间维持恒定室温。尽量避免可能对重复检测重现性造成不利影响的温度梯度。
光谱干扰
8.C.
测试化合物或对照化合物：部分参考ICD诱导剂（例如多柔比星和米托蒽醌）可吸收可见光且可导致发光信号猝灭（呈
剂量依赖性）。具有可见颜色的测试化合物也可能影响发光信号。通过加入猝灭化合物后立即测定的每一剂量的基准释
放值，并使用其对相应的处理组数据进行归一化处理，可使数据集更准确。
含酚红的培养基：导致ICD的测试化合物和对照化合物经常导致系列稀释液中细胞生长存在差异，进而可能导致pH值
发生轻微变化。在极端情况下，此“内滤效应”可能导致发光信号强度发生变化以及校准曲线计算结果不准确。因此，应
尽可能使用无酚红培养基。大多数常用培养基（例如RPMI 1640、DMEM、MEM、DMEM/F-12、McCoy’s 5A、Opti-
MEM等）均可从GIBCO/Thermo Fisher Scientific等供应商处购得不含酚红的版本。
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8.D.
可选样品转移检测方案的注意事项
1. 应于达至HMGB1预期最大释放量的24小时内收集和检测上清液样品。若无法实现，则可将上清液样品置于4℃条
件下储存48小时（HMGB1蛋白降解可忽略不计）。不可将处理后细胞上清液样品置于-20℃条件下储存，这是因
为该温度、反复冻融或两个因素均会对检测释放的HMGB1蛋白释放量的检测造成不利影响。
2. 若需转移贴壁细胞系的细胞培养基，则应转移细胞培养基上清液（若仅检测释放的HMGB1）且应注意避免破坏贴壁
细胞层。测试化合物处理期间，部分细胞可能死亡并从贴壁细胞层脱落。因此，可能转移死细胞且可能检测细胞膜
受损细胞中HMGB1。
3. 对于非贴壁细胞系，于大孔板中转移细胞培养基上清液样本（不含细胞）（若仅检测释放的HMGB1）操作更为简易。
例如，可于12或24孔板中处理非贴壁细胞。化合物处理结束后，从样品孔中取细胞置于试管中，然后离心细胞。
然后收集处理后培养基上清液样品并将其转移至96孔检测板中，进行HMGB1释放量检测。
4. 总体而言，与直接检测方案相比，检测转移后细胞上清液中HMGB1这一检测方案也可得到类似剂量反应曲线和
EC
50
值，但其测得的发光信号比直接检测方案测得发光信号低。此总体发光信号降低可能导致动态范围缩小。
8.E. 3D
细胞模型
若所用模型为微组织和球状体，则可直接使用第4节所述方案，无需修改。试剂可均匀分布于多孔细胞外基质（Matrigel
®
等），但可能会造成光波干扰。若使用的是圆底、黑色微孔板，则会出发光信号值降低的现象。
8.F.
参考文献
1. Wang, Y.J.
et al
. (2018) Immunogenic effects of chemotherapy-induced tumor cell death.
Genes Dis
.
5,
194-203.
2. Magna, M. and Pisetsky, D.S. (2014) The role of HMGB1 in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune
diseases.
Mol. Med
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20,
138-46.
3. Dixon, A.S.
et al.
(2016) NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein
interactions in cells.
ACS Chem. Biol
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400-8.
4. Hwang, B.
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. (2020) A homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway
regulation
. Commun. Biol.
3,
8.
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Caspase-Glo, CellTiter-Glo, NanoBiT and NanoLuc are registered trademarks of Promega Corporation. CellTiter-Fluor, CellTox, CytoTox-Glo, Ester-Glo,
Glucose-Glo, Glutamine/Glutamate-Glo, Glycerol-Glo, GSH/GSSG-Glo, Lactate-Glo, LDH-Glo, Lumit, NAD/NADH-Glo, NADP/NADPH-Glo, RealTime-Glo,
ROS-Glo and Triglyceride-Glo are trademarks of Promega Corporation.
Corning is a registered trademark of Corning, Inc. Dilux is a registered trademark of Dilux, L.L.C. Excel and Microsoft are registered trademarks of Microsoft
Corporation. GraphPad Prism is a registered trademark of GraphPad Software, Inc. Matrigel is a registered trademark of Discovery Labware, Inc. Opti-MEM is
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中 文 说 明 书
Lumit™ HMGB1 (Human/
Mouse) Immunoassay
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2022
原英文技术手册
版 CTM681
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Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse)
Immunoassay
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本。如果您在使用该试剂盒时有任何问题，请与
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1. 描述 ....................................................................................................................................................................................2
2. 产品组分和储存条件............................................................................................................................................................4
3. 开始实验前 ..........................................................................................................................................................................5
4. 培养细胞的直接（无转移）方案 ..........................................................................................................................................7
4. A. 细胞铺板和处理......................................................................................................................................................... 7
4. B. 制备重组人HMGB1阳性对照系列稀释液 .................................................................................................................7
4. C. 添加5X抗hHMGB1抗体混合物至检测孔.................................................................................................................9
4. D. 添加Lumit™检测试剂B至检测孔 ..........................................................................................................................10
4. E. 可选：结合CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay进行细胞存活率多重检测............................................10
5. 分析结果 ...........................................................................................................................................................................11
6. 代表数据 ...........................................................................................................................................................................12
7. 疑难解答 ...........................................................................................................................................................................15
8. 附录 ....................................................................................................................................................................................16
8. A. 细胞模型和标准操作流程 .........................................................................................................................................16
8. B. 温度 .........................................................................................................................................................................16
8. C. 光谱干扰..................................................................................................................................................................16
8. D. 可选样品转移检测方案的注意事项 ...........................................................................................................................17
8. E. 3D细胞模型 ............................................................................................................................................................17
8. F. 参考文献...................................................................................................................................................................17
8. G. 相关产品..................................................................................................................................................................18
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1
1.
描述
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
(a,b)
是一款均质生物发光检测试剂盒，适用于检测细胞所释放的高迁
移率族蛋白B1（High Mobility Group Box 1 protein，HMGB1）。使用本试剂盒时，无需样品转移或洗涤。HMGB1
是一种含量丰富且高度进化保守的蛋白，其在细胞内和细胞外均具有重要生物活性。HMGB1一般以与DNA和组蛋白
结合物的形式存在于细胞核内，其作用为调节转录并辅助排列和塑造染色质结构。当HMGB1易位至细胞质时，其可辅
助介导自噬。在免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death，ICD）过程中，ICD诱导治疗导致肿瘤或溶瘤病毒感染
细胞通过主动或被动机制释放HMGB1。被转运出垂死肿瘤细胞后，HMGB1作为损伤相关分子模式（Damage-Associated
Molecular Pattern，DAMP）分子，可促进树突状细胞向肿瘤床的募集（1,2）。
检测原理
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay适用于细胞培养样品。Lumit™试剂可直接添加至含细胞和培养基的
孔板孔中。或者，用户可转移细胞上清液。用户需自行确定检测其他类型样品的检测性能。本试剂盒可检测人和小鼠
HMGB1。
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay基于NanoLuc
®
Binary Technology（NanoBiT
®
）。NanoBiT为发光
的结构互补系统，用于生物分子相互作用研究（3,4）。此系统由两个亚基组成，大亚基Large BiT（LgBiT；18kDa）
和小亚基Small BiT（SmBiT；11个氨基酸肽）。LgBiT和SmBiT已经过优化，拥有良好的稳定性和最小化的自联。
检测时，会将样品与SmBiT或LgBiT共价标记的1对抗人HMGB1单克隆抗体一起孵育。当标记的抗体识别释放的
HMGB1并与之结合时，使得互补的LgBiT和SmBiT分子接近，从而重构NanoBiT
®
酶并在Lumit™底物存在的情况
下产生发光。产生的发光信号与样品中分析物量成正比。
2
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HMGB1
LgBiTSmBiT
HMGB1
C
Anti hHMGB1
抗hHMGB1
M
5
4
mAb-LgBiT
mAb-LgBiT
LgBiTSmBiT
Anti hHMGB1
抗hHMGB1
mAb-SmBiT
mAb-SmBiT
NanoBiT
NanoBiT
®
enzyme
®
酶
3
7
1
图
1.
检测原理。人HMGB1单克隆一抗经SmBiT和LgBiT标记。当HMGB1存在时，SmBiT和LgBiT会彼此靠近，从
而形成NanoBiT
Anti hHMGB1
mAb-LgBiT
®
酶。当添加Lumit™检测试剂
Anti hHMGB1
mAb-SmBiT
B时，可产生明亮的发光信号。
NanoBiT
®
enzyme
Sample Plate
igure 1. Assay principle. Primary monoclonal antibodies to human HMGB1 are labeled with SmBiT and LgBiT. In
the presence of HMGB1, SmBiT and LgBiT are brought into close proximity, forming the NanoBiT
®
enzyme. When
Lumit™ Detection Reagent B is added, a bright luminescent signal is generated.
Sample Plate
样品板
cells or cell supernatants.
Samples can be cultured Add antibody
mixture.
Add Lumit™ Detection
Reagent B.
luminescence.
Measure
C
M
6
4
3
7
1
Total assay time: 60–90 minutes
Samples can be cultured
样品为培养的细胞或添加抗体混合物。检测发光信号。
cells or cell supernatants.
细胞上清液。
Add antibody
添加Lumit™
mixture.
Add Lumit™ Detection
检测试剂
Reagent B.
B。
luminescence.
Measure
Total assay time: 60–90 minutes
总检测时间：60~90分钟
图
2.
检测方案。使用Lumit™ HMGB1 Immunoassay直接检测培养的细胞或细胞上清液（转移至另一检测板）。
Lumit™ Immunoassay检测方案中不涉及洗涤步骤，且60~90分钟内便可完成检测。
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3
2.
产品组分和储存条件
产品
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
规格
100 assays
目录号
W6110
使用96孔板时，可进行100次检测；包括：
•
•
•
•
•
50µl
50µl
20µl
160µl
3.2ml
抗hHMGB1 mAb-SmBiT，250X
抗hHMGB1 mAb-LgBiT，250X
HMGB1（人）阳性对照
Lumit™检测底物B
Lumit™检测缓冲液B
产品
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
规格
5×100 assays
目录号
W6112
使用96孔板时，可进行500次检测；包括：
•
•
•
•
•
5×50µl
5×50µl
20µl
5×160µl
5×3.2ml
抗hHMGB1 mAb-SmBiT，250X
抗hHMGB1 mAb-LgBiT，250X
HMGB1（人）阳性对照
Lumit™检测底物B
Lumit™检测缓冲液B
储存条件：所有组分均置于-30℃至-10℃条件下储存。解冻后，应将HMGB1（人）阳性对照置于+2℃至+10℃条件
下储存（最长为1个月）。若解冻后HMGB1（人）阳性对照的储存时间超1个月，则应进行分装，并置于-30℃至-10℃
条件下储存。解冻后，将Lumit™检测缓冲液B置于室温条件下储存。长期储存Lumit™检测底物B时，应避光储存。
说明：本检测试剂盒随附HMGB1（人）阳性对照用作阳性对照蛋白。从其他供应商处购买的商品化重组小鼠HMGB1
蛋白也可用作阳性对照蛋白。
4
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3.
开始实验前
第4节中详细介绍的直接（无转移）检测方案已优化，适用于直接在细胞培养孔中检测HMGB1（人或小鼠）。取20μl
5X抗体混合物，加至80μl培养基（含细胞或HMGB1（人）阳性对照稀释液）中，并孵育60~90分钟。孵育后，加入
25μl Lumit™检测试剂B并记录发光信号。
说明：
a. 第4节所述检测方案列出了96孔板常用体积。也可使用其他体积，但最终抗体浓度保应为1:250，且应添加5X浓
度的Lumit™检测试剂B（最终稀释比例应为1:100）。
b. 我们建议使用含5~10%胎牛血清（FBS）的标准组织培养基。较低浓度FBS可能导致背景（非分析物介导的抗体配对）
升高和重复测量变异性增大。使用不含酚红的培养基可提高检测灵敏度和减少发光信号猝灭的内滤效应。
c. 若需检测转移后细胞上清液中的HMGB1，参见第8.D节获取重要注意事项相关信息。
试剂制备和储存
临用当天，制备HMGB1（人）阳性对照系列稀释液、Lumit™抗体混合物和Lumit™检测试剂B。不可重复使用HMGB1
阳性对照系列稀释液、
the
（人）
Lumit™抗体混合物和Lumit™检测试剂B。
!
Us
wo
处理细胞和细胞培养试剂等生物危害性材料时，应穿戴个人防护设备并遵守就职机构的安全指南和处置要求。
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3.
开始实验前（续）
两种检测方案的检测板图
HMGB1阳性对照系列
稀释液（ng/ml）*
1
A
B
C
D
E
F
G
H
1000
400
160
64
25.6
10.2
4.1
0
2
1000
400
160
64
25.6
10.2
4.1
0
3456
测试样品
789101112
*说明：上述HMGB1（人）阳性对照系列稀释液浓度以及后续操作流程说明所述HMGB1（人）阳性对照系列稀释液浓
度仅为推荐浓度。
用户需提供的材料
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
细胞（人源或小鼠源）
培养基【我们建议使用含10%胎牛血清（FBS）的标准组织培养基】
可选：重组小鼠HMGB1蛋白
血细胞计数器和台盼蓝
白色、组织培养多孔板（纯白色或白色、底部透明），与光度计兼容性良好（例如，Corning
®
96孔板，目录号：3917）
多通道移液器或自动移液站
稀释管或多隔室稀释槽（例如，Dilux
®
目录号：D-1002）
试剂槽托盘（例如，Midwest Scientific目录号：RR25）
多孔板混匀用板振荡器
可读取多孔孔板的光度计（例如，GloMax
®
Discover System目录号：GM3000）
阳性对照HMGB1释放诱导剂（例如，多柔比星、伊达比星或米托蒽醌）
6
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4.
培养细胞的直接（无转移）方案
此方案介绍了如何直接检测含细胞和培养基的检测孔中的HMGB1。鉴于需设置阳性对照，因此使用培养基和HMGB1（人）
阳性对照蛋白制备阳性对照系列稀释液。
说明：或者，若需检测细胞上清液中HMGB1，则按每孔80μl将样品分装至96孔检测板，然后按第4.B节所述内容操作。
使用细胞上清液时，参见第8.D节获取重要注意事项相关信息。
4.A.
细胞铺板和处理
1. 将细胞铺板至纯白色（或白色但底部透明）、96孔组织培养板中。列1和列2不添加细胞。若使用的是贴壁细胞，
则应使细胞贴壁。
说明：虽然检测方法的动态范围较大且可灵活选择细胞数量，但还是应根据经验确定特定细胞模型每孔分装的最佳
细胞数量。确保释放的最高水平HMGB1不超过检测方法的线性范围。在线性范围内，可增加细胞数量从而满足低
水平HMGB1检测要求。
2. 取特定体积的测试化合物加至每一孔中，处理细胞，并使每孔总体积为：
96
孔板：每孔80µl。
例如，若96孔板每孔已铺板40μl细胞，那么则应取40μl 2X处理化合物加至培养基中。需根据经验确定细胞与测
试化合物的孵育时间，从而确保HMGB1释放量最大。在本检测方案示例中，一般过夜（18~24小时）处理细胞，
或根据使用的具体刺激物种类也可能需要更长处理时间，从而观察相较于未处理对照的HMGB1释放水平。
4.B. 制备重组人HMGB1阳性对照系列稀释液
细胞处理即将结束前，使用细胞样品培养用培养基制备HMGB1（人）阳性对照稀释液。
说明：若使用的是多细胞模型且每一细胞模型需不同培养基，则必须使用不同培养基制备相应阳性对照系列稀释液。
1. 临用前，解冻HMGB1（人）阳性对照（室温放置约15分钟）。
2. 启用前，先短暂离心阳性对照管，然后吹打使之混匀。
3. 使用预热后细胞培养基（人细胞培养常用的含10%胎牛血清（FBS）标准组织培养基）并按1:500稀释比例对
HMGB1（人）阳性对照（500µg/ml）进行稀释，从而制备起始浓度（1000ng/ml）的人HMGB1。例如，取3μl
HMGB1（人）阳性对照储备液加至1497μl培养基，从而制备1500μl 1000ng/ml人HMGB1（参见图3）。
4. 取7支试管（或于稀释槽七个隔室），每一试管或每一隔室加入600μl培养基。
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4.B.
制备重组人HMGB1阳性对照系列稀释液（续）
5. 制备2.5倍阳性对照系列稀释液。取400μl 1000ng/ml起始浓度人HMGB1稀释液（步骤3）加至600μl培养基中，
以进行第二次稀释。混匀并再重复相同步骤5次，从而制备7个浓度水平阳性对照稀释液（浓度范围为4.1~1000ng/
ml）。最后一个孔或隔室仅应加入培养基用作本底对照。
culture medium as the background control.
转移
400µl
Transfer
加入
3μl 500μg/ml
Add 3µl of 500µg/ml
HMGB1 (Human)
HMGB1（人）阳性
Positive Control
对照
400µl400µl400µl
本底对照
400µl400µlBackground
control
培养基体积
Medium Volume
1,500µl600µl600µl600µl600µl600µl600µl600µl
Human HMGB1
人HMGB1浓度
(ng/ml)
1,5.610.24.10
Concentration
图
3. HMGB1
（人）阳性对照系列稀释液。此系列稀释液浓度仅为推荐浓度。
6. 细胞处理结束后，取阳性对照稀释液和本底对照（2个复孔）加至检测板的两列（请参见第3节，开始实验前，检测板图）。
96
孔板：每孔分装80µl。
说明：剩余HMGB1（人）阳性对照（500µg/ml）可于4℃条件下储存1个月。若阳性对照的储存时间超1个月，
则应进行分装，并置于-30℃至-10℃条件下储存。避免反复冻融。
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1
7
3
4
7
M
C
4.
C. 添加
5X
抗hHMGB1抗体混合物至检测孔
说明：若使用的是多细胞模型且每一细胞模型需不同培养基，则必须使用不同培养基制备对应的5X抗hHMGB1抗体混
合物。
1. 临用前，从-20℃处取出抗hHMGB1抗体。
说明：若Lumit™检测缓冲液B尚未解冻，则此时还应将其从-20℃处取出解冻并平衡至室温。
2. 启用前，先短暂离心阳性对照管，然后吹打使之混匀。
3. 临用前，使用预热培养基并按1:50稀释比例对两种抗体进行稀释，从而制备5X抗体混合物。吹打使抗体溶液混匀。
若需检测整块96孔板（包括过量试剂，用于弥补移液过程损耗），则应根据下述内容制备5X抗体混合物：
若需检测整块96孔板或384孔板（包括过量试剂，用于弥补移液过程损耗），则应根据下述内容制备5X抗体混合物：
试剂体积
culture medium
2.4ml
Anti-hHMGB1 mAb-SmBiT50µl
Anti-hHMGB1 mAb-LgBiT50µl
4. 取5X抗hHMGB1抗体混合物加至含有培养细胞或HMGB1（人）阳性对照孔中，若从高浓度分析物至低浓度分析
物依次添加，则应尽量每次更换移液器吸头，从而避免孔之间出现交叉污染。
96
孔板：每孔分装20μl 5X抗hHMGB1抗体混合物至80μl细胞或HMGB1（人）阳性对照稀释液中。
5. 使用板振荡器混匀片刻（例如，250~350rpm混合10秒）
6. 于室温条件下孵育60~90分钟。
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4.D.
添加Lumit™检测试剂B至检测孔
当细胞与抗hHMGB1抗体混合物一起孵育时（第4.C节），制备Lumit™检测试剂B。
1. 取所需量Lumit™检测缓冲液B平衡至室温。
2. 从-20℃处取出Lumit™检测底物B，并混匀。若Lumit™检测底物B附着于管盖或管侧，则应离心片刻。
3. 使用Lumit™检测缓冲液B（室温）对Lumit™检测底物B进行稀释（稀释比例为1:20），从而制得检测用足量
Lumit™检测试剂B。若需检测96孔板（包括过量试剂），则应根据下述内容制备5X Lumit™检测试剂B：
试剂
Lumit™ Detection Buffer B
Lumit™ Detection Substrate B
体积
3040µl
160µl
说明：复溶后，Lumit™检测试剂B于20℃条件下放置约3小时后其活性便会降低10%。复溶后的试剂于4℃条件
下放置约7小时后其活性会降低10%。
4. 孵育（第4.C节步骤6）后，使用多通道移液器将5X Lumit™检测试剂B（室温）加至每一检测孔中。
96
孔板：每孔分装25µl。
5. 使用板振荡器混匀片刻（例如，300~500rpm混合10秒）
6. 孵育3~5分钟。
7. 读取发光信号。
说明：检测信号稳定，半衰期约为2小时，可与同时处理多个检测板的批量实验兼容。我们建议在每块检测板上添
加HMGB1阳性对照，以便进行归一化处理。
4.E.
可选：结合CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay进行细胞存活率多重检测
说明：需于Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay（第4.A~4.D节）检测结束后进行可选CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay检测。
1. 购买CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay（目录号：G7570）并根据CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell
Viability Assay说明书TB288所述内容进行操作。示例数据参见图7。
2. Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay检测结束后，向含细胞的孔（处理和未处理）中加入100µl CellTiter-
Glo
®
试剂。
3. 置于定轨振荡器（300~500rpm）混合30秒。
4. 10分钟后，测量发光信息。
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5.
分析结果
可采用两种主要方式处理Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay测得数据。第1种为比较相对于未诱导细胞
对照的诱导影响，第2种为通过阳性对照曲线计算HMGB1释放值。无论采用何种方式，首先均应通过阳性对照系列稀
释液确定检测性能。
说明：HMGB1（人）阳性对照仅供研究使用，未使用独立的HMGB1标准物质进行标定。不同批次阳性对照细微差异可
能导致测得分析物量存在细微差异。
阳性对照稀释液和曲线：数据处理方式为取每一浓度HMGB1（人）阳性对照和本底对照复孔的发光信号（RLU）读数
平均值。然后再用每一HMGB1（人）阳性对照浓度的平均RLU减去本底对照平均RLU。可使用具备简单线性回归分析
功能的软件（例如GraphPad
®
Prism）绘制曲线。或者，可使用Microsoft Excel
®
中幂（Power）趋势线对平均RLU（减
去本底）和HMGB1阳性对照浓度进行对数图拟合（参见第6节）。虽然不同供应商提供光度计的总体信号强度（RLU）
可能存在一定差异，但合理使用Lumit™ HMGB1 (Human/ Mouse) Immunoassay以及随附重组抗原可得到良好线性结
果（r
2
＞0.95）。
实验诱导与未诱导对照：大多数试剂盒用户会发现处理数据集的最直接简单方式是比较相对于未处理对照的HMGB1释
放量。同阳性对照系列稀释液数据处理方法一致，诱导和未诱导复孔均应减去来本底对照平均发光信号。然后绘制发光
信号—浓度曲线。可通过将该值除以未诱导对照，从而计算每一浓度诱导比。
阳性对照系列稀释液插值计算：若有必要，可采用此分析模式，但是其具有一定局限性。为获得最佳结果，应使用无酚
红培养基从而消除暴露期间因处理和未处理细胞之间细胞生长差异而导致的内滤效应。此外，可能需要收集和使用条件
培养基（可能含基础水平HMGB1）制备最适合检测未知样品的阳性对照系列稀释液。用户应期望进行其他样品矩阵模
型改进来使用此分析模式。
同阳性对照系列稀释液，诱导和未诱导复孔数据处理方法一致，均应减去来本底对照平均发光信号。一般采用二阶或三
阶多项式回归、三次样条或四参数逻辑（4PL）曲线拟合进行插值分析。
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6.
代表数据
6. Representative Data
10,000,000
y = 7,657.81x
0.94
r² = 1.00
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
1,000,000
100,000
10,000
1,000
HMGB1 (Human) Positive Control (ng/ml)
图
4. Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
的阳性对照系列稀释浓度。本代表数据通过HMGB1（人）阳
性对照系列稀释液测得，不可用于计算未知样品浓度。每一检测板上制备阳性对照系列稀释液用作阳性对照和归一化处理。
说明：发光信号值已减去本底信号。
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1
7
9
1
0
M
A
1101001,00010,000
10,000,000
y = 593.94x
1.12
)
U
L
1,000,000
r² = 0.99
R
(
e
c
n
e
c
100,000
s
e
n
i
m
u
L
10,000
1,000
1101001,00010,000
A
M
1
Recombinant Mouse HMGB1 (ng/ml)
1
9
7
1
Figure 5. The Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay using recombinant mouse HMGB1
图
5.
使用Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay检测重组小鼠HMGB1蛋白。本代表数据通过重组小鼠
HMGB1蛋白系列稀释液测得，不可用于计算未知样品浓度。每一检测板上制备阳性对照系列稀释液用作阳性对照和归
一化处理。说明：发光信号值已减去本底信号。
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6.
代表数据（续）
6.
A.
Representative Data (continued)
B.
200,000
400,000
L
u
m
i
n
e
s
L
c
u
e
m
n
c
(
s
R
c
L
e
U
)
c
e
(
R
L
U
)
i
e
n
e
n
A.
150,000
200,000
100,000
150,000
50,000
100,000
0
50,000
0
10
B.
EC
50
= 1,777nM
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
L
u
m
i
n
e
s
c
e
n
c
e
(
R
L
U
)
300,000
400,000
200,000
300,000
100,000
200,000
100,000
0
EC
50
= 405.8nM
EC
50
= 1,777nM EC
50
= 405.8nM
untreated
cell baseline
untreated
cell baseline
untreated
cell baseline
10,000
1
7
9
1
2
M
A
0
101001,000
untreated
10,000
cell baseline
101001,000
Log
10
[doxorubicin], nM
1001,00010,000
Log
10
[doxorubicin], nM
101001,00010,000
图
6.
细胞ICD模型中的HMGB1生物释放量。人U2OS细胞（图A）和小鼠EL4细胞（图B）经多柔比星处理24小时。
1010
使用Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay直接检测细胞培养样品，从而测量处理后细胞产生的HMGB1。
Figure 6. Biological release of HMGB1 in cell-based ICD models. Human U2OS cells (Panel A) and mouse
EL4 cells (Panel B) were treated with doxorubicin for 24 hours. The Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay
CellTiter-Glo
®
Assay alone in parallel plate, EC
50
= 145nM
was performed directly on cell culture samples to measure detectable HMGB1 produced from treated cells.
CellTiter-Glo
®
Assay added after Lumit™ HMGB1 Immunoassay, EC
50
= 149nM
CellTiter-Glo
®
Assay alone in parallel plate, EC
50
= 145nM
Log[doxorubicin], nMLog[doxorubicin], nM
CellTiter-Glo
®
Assay added after Lumit™ HMGB1 Immunoassay, EC
50
= 149nM
L
u
m
i
n
c
i
e
n
c
e
(
R
)
(
R
L
U
)
L
e
u
s
m
n
e
s
c
e
n
L
c
U
e
1.50 × 10
7
1.25 × 10
7
1.00 × 10
7
0.75 × 10
7
0.50 × 10
7
0.25 × 10
7
0
1
®
Figure 7. A same-well multiplex with the CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay reduces effort and
Log
10
[idarubicin], nM
saves resources. Mouse EL4 cells were challenged with serial dilutions of idarubicin in parallel plates for 24 hours.
At the end of the exposure, the Lumit™ HMGB1 Human/Mouse Immunoassay reagent was added to one plate and
图
7.
使用CellTiter-Glo
®
Luminescent Cell Viability Assay进行同孔多重检测，减少工作量并节约资源。平行板中小
®
data collected (data not shown). Next, the CellTiter-Glo
Reagent was prepared and added directly to both plates.
鼠EL4细胞经伊达比星系列稀释液处理24小时。处理结束时，取Lumit™ HMGB1 Human/Mouse Immunoassay加至
Luminescence was collected and plotted for both data sets.
一块板中并收集数据（数据未列出）。然后，制备CellTiter-Glo
®
试剂并将其直接加至两块板中。收集两块板的数据集并
绘制相应曲线。
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M
A
Log
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[idarubicin], nM
101001,00010,000
7.
疑难解答
如果您遇到的问题在此没有列出，请联系普洛麦格（北京）生物技术有限公司或当地经销商。联系信息见：www.
电子邮箱：*************************
问题原因和参考建议
阳性对照无信号检测过程或光度计设置存在技术问题。
若观察到
原因可能导致细胞无信号：
HMGB1（人）阳性对照系列稀释液发光信号存在正相关性，则3个
• 测试化合物处理后，HMGB1释放量无法检出。我们建议使用参比ICD诱
处理后的细胞无信号。
导剂（例如米托蒽醌和多柔比星）作为对照毒素。
• 释放至细胞外环境中
®
HMGB1抗原可能随时间逐渐降解。我们建议使用
CellTiter-Glo
Assay检测细胞毒性或于早期进行检测。
• 使用了非人或非小鼠细胞系。我们尚未对其他物种进行检测，因此尚不确定
检测这些细胞系的检测性能。
第3节检测板图所列2.5
人HMGB1系列稀释液线性不佳
推荐浓度。不同培养基、光度计可能存在轻微差异，不同用户间也可能存在一
倍阳性对照系列稀释液浓度和图3方案所述浓度仅为
定差异。建议先使用推荐的阳性对照系列稀释液方案，然后根据实际情况进行
优化。
不同次检测的阳性对照系列稀释液的相对
光单位（RLU）存在一定差异
虽然培养条件、温度等因素可能会使
试样品均于相同条件下、同一板中被检测，那么便可准确定量
RLU发生变化，但是只要阳性对照与测
HMGB1释放量。
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8.
附录
8.A.
细胞模型和标准操作流程
Lumit™ HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay是一款高灵敏度的均质检测试剂盒，适用于检测释放的HMGB1。同测
量细胞健康相关参数的试剂盒，应充分验证模型（细胞数量和暴露时间），从而确保实验期间未处理细胞维持最佳活力。
对于敏感型细胞（易发生机械或酶促弥散），传代操作应尽量轻柔。处理这些细胞系时，我们建议在传代后设置至少6
小时的适应期，或给药处理前更换培养基。未优化细胞健康参数可能导致未处理孔中HMGB1水平升高和化合物活性的
高估。
温度
8.B.
互补NanoBiT
®
萤光素酶的酶活性取决于温度。测试化合物暴露期间应维持37℃环境温度，并于抗体/检测步骤孵育期
间维持恒定室温。尽量避免可能对重复检测重现性造成不利影响的温度梯度。
光谱干扰
8.C.
测试化合物或对照化合物：部分参考ICD诱导剂（例如多柔比星和米托蒽醌）可吸收可见光且可导致发光信号猝灭（呈
剂量依赖性）。具有可见颜色的测试化合物也可能影响发光信号。通过加入猝灭化合物后立即测定的每一剂量的基准释
放值，并使用其对相应的处理组数据进行归一化处理，可使数据集更准确。
含酚红的培养基：导致ICD的测试化合物和对照化合物经常导致系列稀释液中细胞生长存在差异，进而可能导致pH值
发生轻微变化。在极端情况下，此“内滤效应”可能导致发光信号强度发生变化以及校准曲线计算结果不准确。因此，应
尽可能使用无酚红培养基。大多数常用培养基（例如RPMI 1640、DMEM、MEM、DMEM/F-12、McCoy’s 5A、Opti-
MEM等）均可从GIBCO/Thermo Fisher Scientific等供应商处购得不含酚红的版本。
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8.D.
可选样品转移检测方案的注意事项
1. 应于达至HMGB1预期最大释放量的24小时内收集和检测上清液样品。若无法实现，则可将上清液样品置于4℃条
件下储存48小时（HMGB1蛋白降解可忽略不计）。不可将处理后细胞上清液样品置于-20℃条件下储存，这是因
为该温度、反复冻融或两个因素均会对检测释放的HMGB1蛋白释放量的检测造成不利影响。
2. 若需转移贴壁细胞系的细胞培养基，则应转移细胞培养基上清液（若仅检测释放的HMGB1）且应注意避免破坏贴壁
细胞层。测试化合物处理期间，部分细胞可能死亡并从贴壁细胞层脱落。因此，可能转移死细胞且可能检测细胞膜
受损细胞中HMGB1。
3. 对于非贴壁细胞系，于大孔板中转移细胞培养基上清液样本（不含细胞）（若仅检测释放的HMGB1）操作更为简易。
例如，可于12或24孔板中处理非贴壁细胞。化合物处理结束后，从样品孔中取细胞置于试管中，然后离心细胞。
然后收集处理后培养基上清液样品并将其转移至96孔检测板中，进行HMGB1释放量检测。
4. 总体而言，与直接检测方案相比，检测转移后细胞上清液中HMGB1这一检测方案也可得到类似剂量反应曲线和
EC
50
值，但其测得的发光信号比直接检测方案测得发光信号低。此总体发光信号降低可能导致动态范围缩小。
8.E. 3D
细胞模型
若所用模型为微组织和球状体，则可直接使用第4节所述方案，无需修改。试剂可均匀分布于多孔细胞外基质（Matrigel
®
等），但可能会造成光波干扰。若使用的是圆底、黑色微孔板，则会出发光信号值降低的现象。
8.F.
参考文献
1. Wang, Y.J.
et al
. (2018) Immunogenic effects of chemotherapy-induced tumor cell death.
Genes Dis
.
5,
194-203.
2. Magna, M. and Pisetsky, D.S. (2014) The role of HMGB1 in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune
diseases.
Mol. Med
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138-46.
3. Dixon, A.S.
et al.
(2016) NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein
interactions in cells.
ACS Chem. Biol
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4. Hwang, B.
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. (2020) A homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway
regulation
. Commun. Biol.
3,
8.
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