2024年3月15日发(作者：乘文翰)
一株类禽型H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征
李鑫;葛菲菲;刘健;李壮壮;吴杰;杨德全;鞠厚斌;周锦萍
【摘 要】2017年12月,上海市一养殖场饲养的猪出现咳嗽、呼吸困难、发热及迅
速转归等病症.将猪鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性样品在SPF鸡胚
上进一步纯化、增殖,分离到1株猪流感病毒(A/swine/Shanghai/1205/2017).采
用RT-PCR对分离毒株进行全基因组扩增测序,利用DNAstar软件,对测序基因片
段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用MEGA 6绘制遗传进化树并
分析氨基酸位点.结果显示:分离毒株为H1N1亚型,其8个基因片段均属于类禽型
H1N1进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组;分离株HA蛋白的
裂解位点序列为PSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子特征.本毒株的分离
鉴定为分析我国大陆地区的猪流感流行状况和分子特征提供了参考.
【期刊名称】《中国动物检疫》
【年(卷),期】2019(036)006
【总页数】8页(P80-87)
【关键词】猪流感病毒;H1N1;类禽型;遗传进化树;分子特征
【作 者】李鑫;葛菲菲;刘健;李壮壮;吴杰;杨德全;鞠厚斌;周锦萍
【作者单位】上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103;上海市动物疫病预防控
制中心,上海 201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103;扬州大学生物科
学与技术学院,江苏扬州 225009;扬州大学生物科学与技术学院,江苏扬州 225009;
上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海
201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65
A型流感病毒是一种重要的人兽共患病病原，是引发人类呼吸道疾病的主要病原之
一。历史上的流感大流行共发生了4次，每次都造成数十万人死亡。一些禽流感
病毒，特别是H5N1和H9N2以及近年来流行的一些H6和H7 等亚型，不仅对
人类健康具有严重威胁，同时还给养禽业带来巨大经济损失。猪流感病毒（swine
influenza virus，SIV）属正黏病毒科A型流感病毒属，为单股负链分节段RNA
病毒，其基因组由8个独立片段构成，分别编码结构蛋白（PB2、PB1、PA、HA、
NP、NA、M1、M2、NEP）和非结构蛋白（NS1、PB1-F2、PB1- N40）[1]。
SIV可引起猪群发生急性、高度接触性呼吸道传染病。由于猪呼吸道上皮细胞存在
SA-α-2,6-Gal和SA-α-2,3-Gal两种受体，因此猪既可感染人流感病毒，又可感
染禽流感病毒，是流感病毒基因重配的混合器及产生新亚型毒株的活载体[2]。目
前，猪群中主要存在经典型H1N1、类禽型H1N1，以及H1N2、H3N2亚型猪
流感病毒，其中类禽型H1N1流感病毒在我国及欧洲各国猪群中的流行呈上升趋
势，已成为主要流行毒株[3-4]。2007—2010年，国内一些研究小组分别对我国
多个省市的猪群进行了流感病毒监测，几乎同时从猪群中分离到了类禽型H1N1
流感病毒，并且发现该病毒的流行路线和区域呈现由南至北逐渐扩大趋势[5-6]。
随着类禽型H1N1流感病毒在猪群中的广泛存在，人间也发生了多起感染病例。
瑞士、荷兰等地曾报道人类感染该类型病毒的病例[7]。2016年10月，福建省发
现一例类禽型H1N1流感病毒感染成人并引起重症肺炎的病例[8]。2017年12月，
上海市一猪场5月龄肉猪出现咳嗽、呼吸困难、发热及迅速转归等病症。本研究
从病例中分离到1株H1N1亚型流感病毒，并进行了分离毒株全基因组的序列测
定与分析，揭示了分离毒株的遗传演化关系及分子特征，为流感病毒的流行病学和
防控研究提供了依据。
1 材料与方法
1.1 试剂、引物和鸡胚
A型禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒：购自深圳匹基生物工程有限公司；
SPF鸡胚：购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；灭菌生理盐水、双抗和1%
红细胞悬液：按常规制备；AMV反转录酶等试剂：购自宝生物（大连）工程公司；
引物：由上海桑尼生物科技有限公司合成。
1.2 样品采集
2017年12月12日，从上海市一发病猪场采集猪鼻拭子样品共20份，贮存于含
有青霉素和链霉素（各2 000 U·mL-1）的磷酸盐缓冲液中，-70 ℃保存、待检。
1.3 病毒初步分离与鉴定
将阳性样品按照国家标准[9]提供的方法处理后，接种于10日龄的SPF鸡胚，72
h收获尿囊液，测定其血凝活性；对第1代没有血凝性的样品继续接种SPF鸡胚，
盲传2代后仍无血凝性的弃之。利用RT-PCR鉴定方法，对分离毒株进行亚型鉴
定[10]。
1.4 病毒全基因序列测定与分析
SIV反转录通用引物Uni-12（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）、亚型鉴定引物及各基
因片段扩增、测序引物，均由农业农村部动物流感重点开放实验室设计，由上海桑
尼生物科技有限公司合成，具体序列参照文献[10-12]。RT-PCR采用RNA提取试
剂盒提取病毒RNA，按M-MLV反转录酶说明书反转录合成cDNA，对病毒的8
个基因片段分别进行特异性扩增。反应程序如下：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性
30 s，54 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，进行35个循环；最后72 ℃延伸7
min。PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司测序。利用DNAstar软件中的Meg
Align程序进行同源性比对，经NCBI检索同源性序列，采用MEGA 6 进行进化
分析并绘制进化树，算法采用Neighbour-joining法，Bootstrap值选择1 000
个重复，并通过NetNGlyc 1.0 Server糖基化位点预测器
（/services/NetNGlyc-1.0/），对氨基酸序
列潜在糖基化位点进行预测分析。
2 结果与分析
2.1 病毒初步分离鉴定
该猪场的鼻拭子样品均为流感病毒核酸阳性，将其中4份阳性样品接种于10日龄
SPF鸡胚，72 h收获尿囊液，测定其血凝效价均为7。经RTPCR方法鉴定，4份
阳性样品均为H1N1亚型流感病毒，选取其中1株进行全基因测序，并将其命名
为A/swine/Shanghai/1205/2017（H1N1）。
2.2 病毒核苷酸序列同源性分析
分离株8个基因片段的基因序列号为 MG 983997～984004。利用GenBank中
的BLAST工具，查找与8个基因片段开放阅读框核苷酸序列同源性最高的毒株，
结果发现该分离株的8个基因片段与分离自我国的A/swine/Jiangsu/49/2012
（H1N1）和A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）毒株核苷酸同源性最高，达
97%～99%（表1）。
2.3 病毒核苷酸遗传演化分析
为进一步阐明分离株各基因片段的遗传演化关系，将分离株8个基因片段的核苷
酸序列分别与来自GenBank的经典型猪H1N1、类人型猪H1N1、类禽型猪
H1N1和2009 H1N1分支代表毒株进行比对并绘制进化树。结果显示，本研究分
离毒株A/swine/Shanghai/1205/2017（H1N1）的8个基因片段均属于类禽型
猪H1N1进化分支，没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组（图1）。
2.4 病毒分子特征分析
2.4.1 HA抗原位点和受体结合位点分析 参考Manabu等[13]确定的H1N1流感
病毒HA蛋白Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb 5个抗原位点区域44个抗原位点进行比
较。结果显示：分离株A/swine/Shanghai/1205/2017与已知的类禽型H1N1
毒株A/Jiangsu/ALS1/2011、A/swine/Hong Kong/1780/2008抗原位点完全
一致，抗原性未发生改变，而与其他分支参考毒株相比，均有多个氨基酸差异（表
2）。已知HA蛋白的受体结合位点（RBSs）区域由3个部分组成：130 位环
（130～140）、190 位螺旋（190～199）和 220位环（220～230）[14]。与各
分支参考毒株比较发现，A/Jiangsu/ALS1/2011和A/swine/Hong
Kong/1780/2008均与分离株的上述位点一致，其他参考株各区域与分离株均有
不同程度的差异（表3）。
表1 GenBank 中与A/swine/Shanghai/1205/2017（H1N1）各基因片段开放阅
读框核苷酸序列同源性最高的毒株基因片段 同源性最高毒株 相似度/% GenBank
序列号PB2 PB1 PA HA NP NA M NS A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）
A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）
A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）
A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）
A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）99 99 99 98 98 97 99 98 KP404345.1
KP404346.1 KP404347.1 KP404348.1 KP404349.1 KM594558.1 KM594565.1
KM594564.1
图1 分离株8个基因片段的基因进化树
表2 猪H1N1流感分离毒株HA抗原位点分析结果注：*.H1N1猪流感分离株；a.
类人型H1N1 猪流感病毒；b.经典型H1N1 猪流感病毒；c.2009 H1N1 流感株；
d.类禽型H1N1 猪流感病毒；e.人源H1N1 流感病毒抗原结合位点（H3）
A/swine/Shanghai/1205/2017*A/swine/Tianjin/01/2004a
A/swine/Guangdong/109/2006b A/California/04/2009c
A/swine/HongKong/1780/2008d A/Jiangsu/ALS1/2011e Sa 127 128 158
160 162 163 165 166 167 P N G S P K S K S..N..N.....E .................................Sb
156 159 192 193 196 198 K N Q T Q N E G R A Ca1 169
173 207 240 T G S G V E..I E..I ...........Ca2 140 143 145 224 225 S G N R E..S.G
P...G P.Cb 78 79 81 82 83 122 S W Y I A.....V.....V.............
表3 分离毒株的受体结合位点分析结果注：*.H1N1猪流感分离株；a.类人型
H1N1 猪流感病毒；b.经典型H1N1 猪流感病毒；c.2009 H1N1 流感株；d.类禽
型H1N1 猪流感病毒；e.人源H1N1 流感病毒毒株受体结合位点130-loop 190-
helix 220-loop 133 135 136 137 138 190 193 198 225 226 227 228
A/swine/Shanghai/1205/2017*A/swine/Tianjin/01/2004a
A/swine/Guangdong/ 109/2006b A/California/04/2009c
A/swine/HongKong/1780/2008d A/Jiangsu/ALS1/2011e R K.K..T V V V..T
S.....V A A A..A S ....D T A S S..N E A A..E G G D..Q .....A E T E..G .....
2.4.2 糖基化位点分析A/swine/Shanghai/1205/2017（H1N1）毒株 HA 基因编
码566 个氨基酸，有7个潜在糖基化位点27NNST、28NSTD、40NVTV、
212NHTY、291NCTT、498NGTY 和557NGSL，其中5个位于HA1 上，2个位
于HA2 上。27NNST、28NSTD、40NVTV、498NGT和557NGDL 5个潜在糖
基化位点在所有分支中都比较保守。分离株NA基因编码469个氨基酸，有5个
潜在糖基化位点44NQSK、58NNTW、63NQTY、146NGTI和 235NGSC。 与
其他参考毒株相比，分离株在68和88位氨基酸残基处的糖基化位点缺失。
2.4.3 致病力和抗药位点分析 分离株A/swine/Shanghai/1205/2017 HA蛋白裂
解位点氨基酸序列为 PSIQSR↓G，PB2 蛋白未发生 T271A 和 E627K突变，且
701位氨基酸为N，表明该毒株可在哺乳动物体内复制，但致病力较低。抗药位
点分析发现，分离株M2蛋白31位氨基酸突变为N，NA蛋白则未出现H275Y、
N295S氨基酸位点的变异（表4）。
3 讨论
2017年12月，本实验室从采集的猪鼻拭子样品中分离到1株类禽型H1N1流感
病毒。氨基酸分析显示，该分离株碱性裂解位点仅含有1个碱性氨基酸，属于低
致病性流感病毒。已知流感病毒氨基酸抗原位点的突变、受体结合位点的变异和潜
在糖基化位点的变化都有可能改变流感病毒的抗原特性、宿主适应性和致病力。从
关键位点分析可以看出，A/swine/Shanghai/1205/2017与类禽型
A/Jiangsu/ALS1/2011和A/swine/Hong Kong/1780/2008 抗原位点和受体结
合位点均一致，没有出现变异。而A/Jiangsu/ALS1/2011是从我国江苏省人群中
分离到的H1N1流感病毒，分离株与其亲源关系也较近，表明本试验分离株有可
能会感染人。分离株HA 蛋白上190位氨基酸为D，225位氨基酸为E。有研究
表明，这些突变在流感病毒由 SA-α-2,3-Gal 亲和性转变为 SA-α-2,6-Gal亲和性
中起关键作用，尤其E190D 突变，是禽流感病毒适应哺乳动物宿主（猪和人）的
一个最基本要求[15-16]。潜在糖基化位点数量的变化可能会影响蛋白质折叠和运
输等特性和功能[17]，分离株NA蛋白在68和88位氨基酸处潜在糖基化位点的
缺失、糖基化位点的减少，可能会降低流感病毒结合受体的能力和病毒致病力，但
具体影响还需进一步研究。M2蛋白跨膜区域是金刚烷胺类药物的作用靶点，
L26F、V27A、A30T、S31N、G34E位的氨基酸有1个或以上的变异就会导致耐
药毒株的出现[18]。M2蛋白关键位点分析发现，分离株对金刚烷胺类药物已经产
生一定的耐药性。此外，PB2蛋白271位、627位和701位氨基酸也是A型流感
病毒宿主范围以及病毒致病力的重要决定位点。A/swine/Shanghai/1205/2017
在271位和627位氨基酸分别为T和E，而701位氨基酸由D突变为N，这有助
于流感病毒在哺乳动物宿主内进行复制和传播[19]，但是关于此突变对H1N1猪
流感病毒的影响并不清楚。最近，Liu等[20]研究发现H1N1猪流感病毒PB2蛋
白发生D701N突变后，在小鼠中的病毒聚合酶活性、复制和致病力会增强，因此
应该对猪群中的D701N突变给予足够的重视。
表4 分离毒株的致病力位点及抗药位点分析结果注：*.H1N1猪流感分离株；a.类
人型H1N1 猪流感病毒；b.经典型H1N1 猪流感病毒；c.2009 H1N1 流感株；d.
类禽型H1N1 猪流感病毒；e.人源H1N1 流感病毒毒株传播和致病力位点 抗药位
点PB2 M2 NA 271 627 701 26F 27A 30T 31N 34E 275Y 295S
A/swine/Shanghai/1205/2017*A/swine/Tianjin/01/2004a
A/swine/Guangdong/ 109/2006b A/California/04/2009c
A/swine/HongKong/1780/2008d A/Jiangsu/ALS1/2011e
T .....E .....N .....L .....V .I ...A .....N .S S ..G .....H .....N .....
猪流感于1930年初次分离到病毒[21]，1991年我国大陆地区首次分离到经典型
H1N1猪流感病毒，2001年从我国香港地区猪群中分离到类禽型H1N1流感病毒，
之后它们共同在猪群中传播流行，2006年后类禽型H1N1猪流感病毒逐渐成为主
要流行毒株[22-24]。我国是世界上养猪数量最多的国家。由于猪群对禽流感和人
流感病毒均易感，在猪体内流感病毒可能会重排，从而产生对人类具有高致病性的
新型流感病毒，并且已经证实类禽型H1N1猪流感病毒可以传播给人并引起严重
疾病[7-8]，因此监测猪群流感发病状况，分析猪流感病毒分子遗传演化特征，确
切掌握猪流感的变化趋势有重要意义，可为人类流感的暴发和流行提供预测和预警。
参考文献：
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2024年3月15日发(作者：乘文翰)
一株类禽型H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征
李鑫;葛菲菲;刘健;李壮壮;吴杰;杨德全;鞠厚斌;周锦萍
【摘 要】2017年12月,上海市一养殖场饲养的猪出现咳嗽、呼吸困难、发热及迅
速转归等病症.将猪鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性样品在SPF鸡胚
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用RT-PCR对分离毒株进行全基因组扩增测序,利用DNAstar软件,对测序基因片
段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用MEGA 6绘制遗传进化树并
分析氨基酸位点.结果显示:分离毒株为H1N1亚型,其8个基因片段均属于类禽型
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学与技术学院,江苏扬州 225009;扬州大学生物科学与技术学院,江苏扬州 225009;
上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海
201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65
A型流感病毒是一种重要的人兽共患病病原，是引发人类呼吸道疾病的主要病原之
一。历史上的流感大流行共发生了4次，每次都造成数十万人死亡。一些禽流感
病毒，特别是H5N1和H9N2以及近年来流行的一些H6和H7 等亚型，不仅对
人类健康具有严重威胁，同时还给养禽业带来巨大经济损失。猪流感病毒（swine
influenza virus，SIV）属正黏病毒科A型流感病毒属，为单股负链分节段RNA
病毒，其基因组由8个独立片段构成，分别编码结构蛋白（PB2、PB1、PA、HA、
NP、NA、M1、M2、NEP）和非结构蛋白（NS1、PB1-F2、PB1- N40）[1]。
SIV可引起猪群发生急性、高度接触性呼吸道传染病。由于猪呼吸道上皮细胞存在
SA-α-2,6-Gal和SA-α-2,3-Gal两种受体，因此猪既可感染人流感病毒，又可感
染禽流感病毒，是流感病毒基因重配的混合器及产生新亚型毒株的活载体[2]。目
前，猪群中主要存在经典型H1N1、类禽型H1N1，以及H1N2、H3N2亚型猪
流感病毒，其中类禽型H1N1流感病毒在我国及欧洲各国猪群中的流行呈上升趋
势，已成为主要流行毒株[3-4]。2007—2010年，国内一些研究小组分别对我国
多个省市的猪群进行了流感病毒监测，几乎同时从猪群中分离到了类禽型H1N1
流感病毒，并且发现该病毒的流行路线和区域呈现由南至北逐渐扩大趋势[5-6]。
随着类禽型H1N1流感病毒在猪群中的广泛存在，人间也发生了多起感染病例。
瑞士、荷兰等地曾报道人类感染该类型病毒的病例[7]。2016年10月，福建省发
现一例类禽型H1N1流感病毒感染成人并引起重症肺炎的病例[8]。2017年12月，
上海市一猪场5月龄肉猪出现咳嗽、呼吸困难、发热及迅速转归等病症。本研究
从病例中分离到1株H1N1亚型流感病毒，并进行了分离毒株全基因组的序列测
定与分析，揭示了分离毒株的遗传演化关系及分子特征，为流感病毒的流行病学和
防控研究提供了依据。
1 材料与方法
1.1 试剂、引物和鸡胚
A型禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒：购自深圳匹基生物工程有限公司；
SPF鸡胚：购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；灭菌生理盐水、双抗和1%
红细胞悬液：按常规制备；AMV反转录酶等试剂：购自宝生物（大连）工程公司；
引物：由上海桑尼生物科技有限公司合成。
1.2 样品采集
2017年12月12日，从上海市一发病猪场采集猪鼻拭子样品共20份，贮存于含
有青霉素和链霉素（各2 000 U·mL-1）的磷酸盐缓冲液中，-70 ℃保存、待检。
1.3 病毒初步分离与鉴定
将阳性样品按照国家标准[9]提供的方法处理后，接种于10日龄的SPF鸡胚，72
h收获尿囊液，测定其血凝活性；对第1代没有血凝性的样品继续接种SPF鸡胚，
盲传2代后仍无血凝性的弃之。利用RT-PCR鉴定方法，对分离毒株进行亚型鉴
定[10]。
1.4 病毒全基因序列测定与分析
SIV反转录通用引物Uni-12（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）、亚型鉴定引物及各基
因片段扩增、测序引物，均由农业农村部动物流感重点开放实验室设计，由上海桑
尼生物科技有限公司合成，具体序列参照文献[10-12]。RT-PCR采用RNA提取试
剂盒提取病毒RNA，按M-MLV反转录酶说明书反转录合成cDNA，对病毒的8
个基因片段分别进行特异性扩增。反应程序如下：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性
30 s，54 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，进行35个循环；最后72 ℃延伸7
min。PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司测序。利用DNAstar软件中的Meg
Align程序进行同源性比对，经NCBI检索同源性序列，采用MEGA 6 进行进化
分析并绘制进化树，算法采用Neighbour-joining法，Bootstrap值选择1 000
个重复，并通过NetNGlyc 1.0 Server糖基化位点预测器
（/services/NetNGlyc-1.0/），对氨基酸序
列潜在糖基化位点进行预测分析。
2 结果与分析
2.1 病毒初步分离鉴定
该猪场的鼻拭子样品均为流感病毒核酸阳性，将其中4份阳性样品接种于10日龄
SPF鸡胚，72 h收获尿囊液，测定其血凝效价均为7。经RTPCR方法鉴定，4份
阳性样品均为H1N1亚型流感病毒，选取其中1株进行全基因测序，并将其命名
为A/swine/Shanghai/1205/2017（H1N1）。
2.2 病毒核苷酸序列同源性分析
分离株8个基因片段的基因序列号为 MG 983997～984004。利用GenBank中
的BLAST工具，查找与8个基因片段开放阅读框核苷酸序列同源性最高的毒株，
结果发现该分离株的8个基因片段与分离自我国的A/swine/Jiangsu/49/2012
（H1N1）和A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）毒株核苷酸同源性最高，达
97%～99%（表1）。
2.3 病毒核苷酸遗传演化分析
为进一步阐明分离株各基因片段的遗传演化关系，将分离株8个基因片段的核苷
酸序列分别与来自GenBank的经典型猪H1N1、类人型猪H1N1、类禽型猪
H1N1和2009 H1N1分支代表毒株进行比对并绘制进化树。结果显示，本研究分
离毒株A/swine/Shanghai/1205/2017（H1N1）的8个基因片段均属于类禽型
猪H1N1进化分支，没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组（图1）。
2.4 病毒分子特征分析
2.4.1 HA抗原位点和受体结合位点分析 参考Manabu等[13]确定的H1N1流感
病毒HA蛋白Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb 5个抗原位点区域44个抗原位点进行比
较。结果显示：分离株A/swine/Shanghai/1205/2017与已知的类禽型H1N1
毒株A/Jiangsu/ALS1/2011、A/swine/Hong Kong/1780/2008抗原位点完全
一致，抗原性未发生改变，而与其他分支参考毒株相比，均有多个氨基酸差异（表
2）。已知HA蛋白的受体结合位点（RBSs）区域由3个部分组成：130 位环
（130～140）、190 位螺旋（190～199）和 220位环（220～230）[14]。与各
分支参考毒株比较发现，A/Jiangsu/ALS1/2011和A/swine/Hong
Kong/1780/2008均与分离株的上述位点一致，其他参考株各区域与分离株均有
不同程度的差异（表3）。
表1 GenBank 中与A/swine/Shanghai/1205/2017（H1N1）各基因片段开放阅
读框核苷酸序列同源性最高的毒株基因片段 同源性最高毒株 相似度/% GenBank
序列号PB2 PB1 PA HA NP NA M NS A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）
A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）
A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）A/swine/Jiangsu/49/2012（H1N1）
A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）
A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）99 99 99 98 98 97 99 98 KP404345.1
KP404346.1 KP404347.1 KP404348.1 KP404349.1 KM594558.1 KM594565.1
KM594564.1
图1 分离株8个基因片段的基因进化树
表2 猪H1N1流感分离毒株HA抗原位点分析结果注：*.H1N1猪流感分离株；a.
类人型H1N1 猪流感病毒；b.经典型H1N1 猪流感病毒；c.2009 H1N1 流感株；
d.类禽型H1N1 猪流感病毒；e.人源H1N1 流感病毒抗原结合位点（H3）
A/swine/Shanghai/1205/2017*A/swine/Tianjin/01/2004a
A/swine/Guangdong/109/2006b A/California/04/2009c
A/swine/HongKong/1780/2008d A/Jiangsu/ALS1/2011e Sa 127 128 158
160 162 163 165 166 167 P N G S P K S K S..N..N.....E .................................Sb
156 159 192 193 196 198 K N Q T Q N E G R A Ca1 169
173 207 240 T G S G V E..I E..I ...........Ca2 140 143 145 224 225 S G N R E..S.G
P...G P.Cb 78 79 81 82 83 122 S W Y I A.....V.....V.............
表3 分离毒株的受体结合位点分析结果注：*.H1N1猪流感分离株；a.类人型
H1N1 猪流感病毒；b.经典型H1N1 猪流感病毒；c.2009 H1N1 流感株；d.类禽
型H1N1 猪流感病毒；e.人源H1N1 流感病毒毒株受体结合位点130-loop 190-
helix 220-loop 133 135 136 137 138 190 193 198 225 226 227 228
A/swine/Shanghai/1205/2017*A/swine/Tianjin/01/2004a
A/swine/Guangdong/ 109/2006b A/California/04/2009c
A/swine/HongKong/1780/2008d A/Jiangsu/ALS1/2011e R K.K..T V V V..T
S.....V A A A..A S ....D T A S S..N E A A..E G G D..Q .....A E T E..G .....
2.4.2 糖基化位点分析A/swine/Shanghai/1205/2017（H1N1）毒株 HA 基因编
码566 个氨基酸，有7个潜在糖基化位点27NNST、28NSTD、40NVTV、
212NHTY、291NCTT、498NGTY 和557NGSL，其中5个位于HA1 上，2个位
于HA2 上。27NNST、28NSTD、40NVTV、498NGT和557NGDL 5个潜在糖
基化位点在所有分支中都比较保守。分离株NA基因编码469个氨基酸，有5个
潜在糖基化位点44NQSK、58NNTW、63NQTY、146NGTI和 235NGSC。 与
其他参考毒株相比，分离株在68和88位氨基酸残基处的糖基化位点缺失。
2.4.3 致病力和抗药位点分析 分离株A/swine/Shanghai/1205/2017 HA蛋白裂
解位点氨基酸序列为 PSIQSR↓G，PB2 蛋白未发生 T271A 和 E627K突变，且
701位氨基酸为N，表明该毒株可在哺乳动物体内复制，但致病力较低。抗药位
点分析发现，分离株M2蛋白31位氨基酸突变为N，NA蛋白则未出现H275Y、
N295S氨基酸位点的变异（表4）。
3 讨论
2017年12月，本实验室从采集的猪鼻拭子样品中分离到1株类禽型H1N1流感
病毒。氨基酸分析显示，该分离株碱性裂解位点仅含有1个碱性氨基酸，属于低
致病性流感病毒。已知流感病毒氨基酸抗原位点的突变、受体结合位点的变异和潜
在糖基化位点的变化都有可能改变流感病毒的抗原特性、宿主适应性和致病力。从
关键位点分析可以看出，A/swine/Shanghai/1205/2017与类禽型
A/Jiangsu/ALS1/2011和A/swine/Hong Kong/1780/2008 抗原位点和受体结
合位点均一致，没有出现变异。而A/Jiangsu/ALS1/2011是从我国江苏省人群中
分离到的H1N1流感病毒，分离株与其亲源关系也较近，表明本试验分离株有可
能会感染人。分离株HA 蛋白上190位氨基酸为D，225位氨基酸为E。有研究
表明，这些突变在流感病毒由 SA-α-2,3-Gal 亲和性转变为 SA-α-2,6-Gal亲和性
中起关键作用，尤其E190D 突变，是禽流感病毒适应哺乳动物宿主（猪和人）的
一个最基本要求[15-16]。潜在糖基化位点数量的变化可能会影响蛋白质折叠和运
输等特性和功能[17]，分离株NA蛋白在68和88位氨基酸处潜在糖基化位点的
缺失、糖基化位点的减少，可能会降低流感病毒结合受体的能力和病毒致病力，但
具体影响还需进一步研究。M2蛋白跨膜区域是金刚烷胺类药物的作用靶点，
L26F、V27A、A30T、S31N、G34E位的氨基酸有1个或以上的变异就会导致耐
药毒株的出现[18]。M2蛋白关键位点分析发现，分离株对金刚烷胺类药物已经产
生一定的耐药性。此外，PB2蛋白271位、627位和701位氨基酸也是A型流感
病毒宿主范围以及病毒致病力的重要决定位点。A/swine/Shanghai/1205/2017
在271位和627位氨基酸分别为T和E，而701位氨基酸由D突变为N，这有助
于流感病毒在哺乳动物宿主内进行复制和传播[19]，但是关于此突变对H1N1猪
流感病毒的影响并不清楚。最近，Liu等[20]研究发现H1N1猪流感病毒PB2蛋
白发生D701N突变后，在小鼠中的病毒聚合酶活性、复制和致病力会增强，因此
应该对猪群中的D701N突变给予足够的重视。
表4 分离毒株的致病力位点及抗药位点分析结果注：*.H1N1猪流感分离株；a.类
人型H1N1 猪流感病毒；b.经典型H1N1 猪流感病毒；c.2009 H1N1 流感株；d.
类禽型H1N1 猪流感病毒；e.人源H1N1 流感病毒毒株传播和致病力位点 抗药位
点PB2 M2 NA 271 627 701 26F 27A 30T 31N 34E 275Y 295S
A/swine/Shanghai/1205/2017*A/swine/Tianjin/01/2004a
A/swine/Guangdong/ 109/2006b A/California/04/2009c
A/swine/HongKong/1780/2008d A/Jiangsu/ALS1/2011e
T .....E .....N .....L .....V .I ...A .....N .S S ..G .....H .....N .....
猪流感于1930年初次分离到病毒[21]，1991年我国大陆地区首次分离到经典型
H1N1猪流感病毒，2001年从我国香港地区猪群中分离到类禽型H1N1流感病毒，
之后它们共同在猪群中传播流行，2006年后类禽型H1N1猪流感病毒逐渐成为主
要流行毒株[22-24]。我国是世界上养猪数量最多的国家。由于猪群对禽流感和人
流感病毒均易感，在猪体内流感病毒可能会重排，从而产生对人类具有高致病性的
新型流感病毒，并且已经证实类禽型H1N1猪流感病毒可以传播给人并引起严重
疾病[7-8]，因此监测猪群流感发病状况，分析猪流感病毒分子遗传演化特征，确
切掌握猪流感的变化趋势有重要意义，可为人类流感的暴发和流行提供预测和预警。
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