2024年3月18日发(作者：席阳华)
拟南芥E3泛素连接酶AtARRE与ABI5相互作用分析
李褚喆;王博雅;李颖;李旭锋;刘志斌
【摘 要】为了阐述AtARRE与ABA信号通路关键转录因子ABI5的作用,本研究采
用原生质体瞬间表达系统探究了AtARRE蛋白的亚细胞定位,证明AtARRE蛋白定
位于细胞核.随后,采用酵母双杂交和GST-Pull down技术分析了AtARRE与ABI5
在体外的相互作用,证明AtARRE与ABI5在体外存在相互作用.最后,本研究采用双
分子荧光互补实验进一步分析AtARRE与ABI5在体内的相互作用,结果表明共表
达AtARRE与ABI5在植物体内存在相互作用.这些结果共同表明AtARRE可能参
与了ABI5介导的植物对逆境的响应.
【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(056)002
【总页数】6页(P363-368)
【关键词】拟南芥;E3连接酶;脱落酸;AtARRE;脱落酸不敏感蛋白5
【作 者】李褚喆;王博雅;李颖;李旭锋;刘志斌
【作者单位】四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065;四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065;四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065;四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065;四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065
【正文语种】中 文
【中图分类】Q78
1 引 言
每年由于非生物胁迫的影响导致农作物降低50%以上的产量,这是世界范围内的作
物损失的主要原因之一[1, 2].为了应对非生物胁迫,植物进化出了响应非生物胁迫的
调控机制,而转录后调控机制是其中重要的部分[3].泛素化-蛋白酶途径通过转录后
水平的调控作用广泛地参与到了植物细胞周期、凋亡等生命活动过程[4].泛素小分
子依赖于泛素激活酶E1,泛素结合酶E2和泛素连接酶E3结合到靶蛋白上形成多聚
泛素链,被26s蛋白酶识别并降解被泛素化修饰的蛋白.当植物受到逆境胁迫的时候,
应对胁迫的蛋白质水平迅速增加,但是蛋白浓度累积到一定程度就会对植物的代谢
产生毒害作用.因此,当胁迫消失时,累积的蛋白质需被降解处理,以保持植物体内蛋白
的内稳态平衡.RING结构E3连接酶作为泛素化-蛋白酶途在响应非生物胁迫具有
重要调节作用,如干旱或盐胁迫[5-9].
ABA是中央调控因子在许多植物对环境胁迫的响应过程,例如,ABA起到了极其重
要的作用在渗透胁迫[10,11].ABA已被证明调节和参与植物发育(如蛋白质和脂类
合成)、许多农艺性状(如种子脱水、休眠、发芽)、生殖生长[12-14].此外,ABA介
导植物响应非生物胁迫如干旱胁迫、盐胁迫、冷胁迫、病原生物胁迫[12-15].ABA
信号通路中的正调控因子能够被E3连接酶泛素化,从而通过26s蛋白酶途径降
解.ABI5是ABA信号通路中一个的转录因子,其对多种胁迫响应的正调控作用主要
通过编码 bZIP 家族蛋白来达成[16].此外,多项研究已经证明ABI5参与了依赖于
ABA 的胁迫响应途径,是 ABA 信号通路中极其重要的转录因子[17,18].本实验室前
期通过酵母双杂交实验筛选出了和拟南芥ABA信号途径中转录因子ABI5相互作
用的蛋白AtARRE,进一步实验表明,与野生型拟兰芥相比,AtARRE的T-DNA插入
拟南芥突变体在根长和萌发等表型实验上表现出对外源 ABA 的敏感性,并且突变体
中响应 ABA 信号通路下游的标志基因较野生型高.因此,前期的研究结果显示
AtARRE参与了ABA信号途径,即负调控ABA介导的逆境响应.本文利用酵母双杂
交技术、基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法、GST-Pull down实
验和双分子荧光互补法(BiFC)对AtARRE与ABI5的相互作用展开了研究.证实
AtARRE与ABI5在体外和植物体内均存在相互作用.
2 材料与方法
2.1 材 料
哥伦比亚野生型拟南芥 (Col-0)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana),pBI121、
pGADT7、pGBKT7-Rec、pGEX-6P-1、pET28a、pSPYNE、pSPYCE载体,农杆
菌GV3101、大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株、酵母菌AH109菌株、Rosetta菌株,
均为实验室保存.GST Resin购于Trans gene,His Resin购于Thermo Fisher.引物
合成和测序由擎科生物和华大基因完成.
2.2 实验方法
2.2.1 目的基因的分离和载体的构建 以实验室保存的cDNA为模板,加入
Primerstar Max DNA 聚合酶和相应的引物,PCR扩增得到目的基因片段:全长
ABI5、AtARRE和截短的ABI5.随后,构建载体:pBI121-AtARRE-GFP、pGADT7-
ABI5、pGADT7-ABI5ΔN、pGADT7-ABI5ΔC、pGBKT7-AtARRE、pET28a-
AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5、pSPYNE-AtARRE、pSPYCE-ABI5、pSPYCE-
ABI5ΔC、pSPYCE-ABI5ΔN.
2.2.2 原生质体转化 取拟南芥叶片切成细丝,放入原生质体酶解液,22 ℃ 黑暗酶解
约3 h后加入4 mL 预冷的W5,并用4层纱布过滤.离心去上清,并用4 mL 预冷的
W5洗涤两次.弃上清,加入1 mL W5,冰上放置30 min.弃上清,加入1 mL MMg.取
10～20 μL pBI121-AtARRE-GFP质粒、100 μL原生质体和110 μL 40%
PEG4000,混匀放置20 min.加入440 μL W5终止反应,然后用1 mL W5洗涤原生
质体三次,于22 ℃黑暗培养16 h,用荧光倒置显微镜观察.
2.2.3 酵母双杂交及X-Gal染色 分别共转化载体pGADT7-ABI5、pGADT7-
ABI5ΔN、pGADT7-ABI5ΔC和pGBKT7-AtARRE至AH109酵母感受态,将酵母
细胞涂布于SD/Leu-Trp-平板上,30 ℃培养3～4 d.取阳性菌落接入液体培养基
SD/Leu-Trp-, 30 ℃培养2 d,用0.9%NaCl将样品调至OD600=0.5.将样品稀释
10、100、1000倍,分别取5 μL滴定在SD/Leu-Trp-、SD/ His-Trp-Leu-平板
上,30 ℃培养3～4 d,观察菌落生长情况.用滤纸覆盖酵母平板并使滤纸与菌落充分
接触,用液氮冷冻滤纸.将滤纸和6 mL反应液放入平板,30 ℃放置8～12 h.
2.2.4 蛋白质纯化及GST-Pull down 将pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5转
入Rosetta菌株,按照蛋白纯化的步骤诱导并纯化出AtARRE、ABI5、GST蛋白.向
EP管加入40 μL GST Resin,再加入ABI5及AtARRE蛋白各5 μg,最后加入
Incubation buffer至体系总体积为500 μL,将样品置于4 ℃ 下360°旋转的摇床
上旋转2 h.用1mL Washing buffer清洗4～5次,再进行Western Blot检测.
2.2.5 双分子荧光互补 将pSPYNE-AtARRE、pSPYCE-ABI5、pSPYCE-ABI5ΔC、
pSPYCE-ABI5ΔN载体转入农杆菌,28 ℃培养过夜.离心10 min收集菌体,弃上清,
用等量侵染液清洗3次,再用侵染液重悬使OD600=1.0～1.2.静置1 h,取等量上层
液体混合,用1 mL注射器以压力注射法共同瞬时转化烟草叶片2 d, 用激光共聚焦
显微镜观察.
3 结果与分析
3.1 AtARRE的亚细胞定位
为了确定AtARRE的亚细胞定位,我们克隆了AtARRE基因的cDNA序列,并利用
pBI121载体构建了AtARRE与绿色荧光蛋白(GFP)的重组载体pBI121-AtARRE-
GFP.运用原生质体转化法将重组载体pBI121-AtARRE-GFP和pBI121-GFP空载
体导入拟南芥原生质体,使之瞬时表达并在荧光倒置显微镜下观察在拟南芥原生质
体中的荧光信号,以确定AtARRE蛋白的亚细胞定位.如图1所示,瞬时表达结果显示
有明显的绿色荧光出现在拟南芥原生质体中,说明pBI121-AtARRE-GFP 融合蛋白
载体和空载体均成功转入了拟南芥原生质体并成功表达,并且AtARRE-GFP 融合蛋
白的绿色荧光信号存在于拟南芥原生质体的细胞核,而对照GFP则表达在整个原生
质体中.该实验结果证明AtARRE蛋白定位于拟南芥细胞核,即AtARRE的表达位置
在细胞核中.
图1 AtARRE的亚细胞定位Fig.1 Subcellular location of AtARRE
3.2 酵母双杂交验证AtARRE与ABI5体外的相互作用
为了确定ABI5和AtARRE的相互作用,我们克隆了AtARRE和ABI5基因的全长
cDNA序列,并利用pGADT7和pGBKT7-Rec载体构建了重组载体pGBKT7-
AtARRE和pGADT7-ABI5.运用酵母双杂交技术共转化重组载体pGBKT7-
AtARRE和pGADT7-ABI5,并在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上培养该
酵母细胞,观察菌落在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上的生长情况.如图2
所示,pGADT7-ABI5+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,在SD/Trp-Leu-和SD/ Trp-
Leu-His-平板上长出白色、光滑、丘状的菌落,说明酵母转化成功,且ABI5和
AtARRE能够在酵母系统中发生相互作用.为了进一步确认ABI5和AtARRE相互作
用的位置,我们从ABI5 氨基酸序列的第 271 位将 ABI5 蛋白截短为N端和C端两
部分,并构建了重组载体pGADT7-ABI5ΔN和pGADT7-ABI5ΔC.将pGADT7-
ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,
观察菌落在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上的生长情况.如图2所
示,pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-
AtARRE转入酵母后,在SD/Trp-Leu-平板上长出白色、光滑、丘状的菌落,说明酵
母转化成功.然而,只有pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE能够在SD/ Trp-
Leu-His-平板上长出菌落,而pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE则不能,即
ABI5ΔN和AtARRE能够在酵母系统中发生相互作用.综上所述,酵母双杂交初步表
明ABI5和AtARRE可以在酵母系统中发生相互作用,且作用的位置在ABI5的C端.
图2 酵母双杂交检测AtARRE与ABI5体外的相互作用Fig.2 Detection of
interaction between AtARRE and ABI5 by yeast two hyb rid system in vitro
3.3 GST-Pull-Down验证AtARRE与ABI5体外的相互作用
为了确定AtARRE与ABI5体外的相互作用,我们利用载体pGEX-6P-1、pET28a
构建了ABI5、AtARRE的重组载体pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5,并利用
原核表达和亲和纯化得到纯度较高的His-AtARRE、GST-ABI5、GST蛋白,然后采
用体外GST-Pull Down验证AtARRE与ABI5在体外的相互作用.实验以10%
His-AtARRE +GST-ABI5作为实验组,10% His-AtARRE +GST作为负对照,5%
Input作为阳性对照.如图3所示,His-AtARRE+GST-ABI5和Input均可见一条单
一的目的条带,而对照组His-AtARRE+GST则不能,说明以GST树脂作为亲和材
料,GST-ABI5作为诱饵蛋白,能够吸附His-AtARRE蛋白.实验结果证明His-
AtARRE和GST-ABI在体外存在相互作用.
图3 GST-Pull Down检测AtARRE与ABI5体外的相互作用Fig.3 Detection of
interaction between AtARRE and ABI5 by Pull-Down in vitro
图4 BiFC检测AtARRE与ABI5体内的相互作用Fig.4 Detection of interaction
between AtARRE and ABI5 by BiFC in vivo
3.4 BiFC验证AtARRE与ABI5体内的相互作用
为了验证AtARRE与ABI5在植物体内的相互作用,我们利用双分子表达载体
pSPYNE和pSPYCE构建了ABI5、AtARRE的重组表达载体pSPYNE-AtARRE和
pSPYCE-ABI5.利用烟草侵染法将构建好的重组载体pSPYNE-AtARRE和
pSPYCE-ABI5共转化至烟草叶片中,培养2 d后用激光共聚焦显微镜观察荧光信号
的表达情况.双分子荧光互补实验(BiFC)结果显示共转化pSPYNE-
AtARRE+pSPYCE-ABI5能够在烟草叶片细胞中观察到荧光信号,说明AtARRE与
ABI5在体内存在相互作用.为了进一步验证AtARRE与ABI5在体内的相互作用的
位点,我们构建了重组载体pSPYCE-ABI5ΔC(缺失C端)和pSPYCE-ABI5ΔN(缺失
N端)并将之分别和pSPYNE-AtARRE共转化至烟草细胞.BiFC结果显示pSPYNE-
AtARRE+pSPYCE-ABI5ΔN能够观察到荧光,而pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-
ABI5ΔC则无法观察到荧光,说明AtARRE与ABI5在体内存在相互作用的位置在
ABI5的C端.值得注意的是,AtARRE+pSPYCE-ABI5ΔN荧光的强度明显比
pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-ABI5弱,说明ABI5和AtARRE发生相互作用的位置
在ABI5的C端,但是ABI5的N端也起到了辅佐作用,这与酵母双杂交的结果是一
致的.
4 讨 论
植物对非生物胁迫的响应涉及许多分子途径的相互作用[19].在胁迫条件下,许多基
因发生上调使植物能够承受胁迫,因此形成植物的适应[20].在非生物胁迫的响应中
担任信号的是各种化学物质,如钙(Ca2+)、糖、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)等,不同
的信号通路既相互独立也相互影响[21].植物激素参与植物对非生物胁迫的耐受性
和适应作用,最重要的两种激素是脱落酸(ABA)和乙烯[22].作为重要的植物激
素,ABA在植物耐受性的形成中起到了重要的调节作用,信号通路通过ABA诱导生
产和积累在ABA信号转导中起重要作用的第二信使,如Ca2+、磷脂酸(PA)和活性
氧(ROS)等[23].因此,ABA信号通路和其涉及的各种蛋白是研究植物抗逆的重要课
题.
拟南芥有超过1400种E3连接酶,这表明E3连接酶是底物特异性的主要决定因素,
因此,作为泛素化-蛋白酶途径的重要组成部分的E3连接酶也是目前研究植物抗逆
机制的重点.作为植物抗逆的一个重要的途径,ABA信号途径中有多个转录因子参与
植物与ABA相关胁迫的应答过程.这些转录因子可能被泛素化途径识别靶定,并通
过26s蛋白酶体途径降解来调控植物的应答反应.泛素化系统中E3连接酶起着识
别与靶定底物的作用,因而研究E3连接酶与底物蛋白的作用对于研究植物的胁迫响
应有着重要意义.
经过本实验室前期研究发现AtARRE负调控ABA信号途径并鉴定了AtARRE的
E3连接酶活性.基于以上研究成果,本研究利用酵母双杂交技术、基于绿色荧光蛋白
瞬时表达的植物亚细胞定位方法、GST-Pull down实验和双分子荧光互补法(BiFC)
对AtARRE与ABI5的相互作用展开了研究.结果显示,AtARRE与ABA信号途径中
的转录因子ABI5存在相互作用,且AtARRE主要与ABI5的C端存在相互作用.因
此,我们的研究结果预示了AtARRE可能通过泛素化修饰ABI5来负调控ABA信号
途径,进而调节拟南芥响应非生物胁迫.为了进一步揭示AtARRE与ABI5之间的关
系,清楚AtARRE在ABA信号途径中的调控作用,最终达到了解植物抗逆分子机制
的目的,后期的研究需要利用体外泛素化和Co-IP等研究手段,从体外和体内两个角
度研究AtARRE是否能够泛素化修饰ABI5,从而探究AtARRE在ABA信号途径中
的功能.
参考文献:
【相关文献】
[1] Bray E A, Bailey-Serres J, Weretilnyk E. Responses to abiotic stresses [C]// Buchanan B
B, Gruissem W, Jones R L. Biochemistry and molecular biology of plants. Rockville:
American Society of Plant Physiologists, 2000.
[2] Wang W, Vinocur B, Altman A. Plant responses to drought, salinity and extreme
temperatures: Towards genetic engineering for stress tolerance [J]. Planta, 2003, 218: 1.
[3] Reece J, Taylor M R, Simon E J, et al. Campbell biology [M]. Amsterdam: Addison-
Wesley Longman, 2011.
[4] Deshaies R J, Joazeiro C A P. RING Domain E3 Ubiquitin Ligases [J]. Annu Rev Biochem,
2009, 78: 399.
[5] Zhang X, Garreton V, Chua N H. The AIP2 E3 ligase acts as a novel negative regulator
of ABA signaling by promoting ABI3 degradation [J]. Gene Dev, 2005, 19: 1532.
[6] Stone S L, Williams L A, Farmer L M, et al. KEEP ON GOING, a RING E3 ligase essential
for Arabidopsis growth and development, is involved in abscisic acid signaling [J]. Plant
Cell, 2006, 18: 3415.
[7] Bu Q, Li H, Zhao Q, et al. The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2a is a novel
positive regulator of abscisic acid signaling during seed germination and early seedling
development [J]. Plant Physiol, 2009, 150: 463.
[8] Liu H, Stone S L. Abscisic acid increases Arabidopsis ABI5 transcription factor levels by
promoting KEG E3 ligase self-ubiquitination and proteasomal degradation [J]. Plant Cell,
2010, 22: 2630.
[9] Li H, Jiang H, Bu Q, et al. The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2b acts additively
with RHA2a in regulating abscisic acid signaling and drought Response [J]. Plant Physiol,
2011, 156: 550.
[10] Takahashi S, Seki M, Ishida J, et al. Monitoring the expression profiles of genes
induced by hyperosmotic, high salinity, and oxidative stress and abscisic acid treatment in
Arabidopsis cell culture using a full-length cDNA microarray [J]. Plant Mol Biol, 2004, 56:
29.
[11] Tuteja N. Cold, salinity, and drought stress [C]// Plant stress biology: from genomics
to systems biology. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2009.
[12] Kaur N, Gupta A K. Signal transduction pathways under abiotic stresses in plants [J].
Curr Sci, 2005, 88: 1771.
[13] Goda H, Sasaki E, Akiyama K, et al. The AtGenExpress hormone and chemical
treatment data set: experimental design, data evaluation, model data analysis and data
access [J]. Plant J, 2008, 55: 526.
[14] Bansal K C, Lenka S K, Tuteja N. Abscisic acid in abiotic stress tolerance: an 'omics'
approach [M]. Omics and plant abiotic stress tolerance. Sharjah: Bentham Science, 2011.
[15] Hubbard K E, Nishimura N, Hitomi K, et al. Early abscisic acid signal transduction
mechanisms: newly discovered components and newly emerging questions [J]. Gene Dev,
2010, 24: 1695.
[16] Finkelstein R R, Lynch T J. The Arabidopsis abscisic acid response gene ABI5 encodes
a basic leucine zipper transcription factor [J]. Plant Cell, 2000, 12: 599.
[17] Vidyasagar A, Lutkenhaus J. Sumoylation of ABI5 by the Arabidopsis SUMO E3 ligase
SIZ1 negatively regulates abscisic acid signaling [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:
5418.
[18] Seiler C, Harshavardhan V T, Rajesh K, et al. ABA biosynthesis and degradation
contributing to ABA homeostasis during barley seed development under control and
terminal drought-stress conditions [J]. J Exp Biol, 2011, 62: 2615.
[19] Viswanathan, Chinnusamy, Zhizhong, et al. Abscisic acid-mediated epigenetic
processes in plant development and stress responses [J]. J Integr Plant Biol, 2008, 50: 1187.
[20] Leung J, Giraudat J. Abscisic acid signal transduction [J]. Annu Rev Plant Phys, 1998,
49: 199.
[21] Rock C D. Pathways to abscisic acid-regulated gene expression [J]. New Phytol, 2000,
148: 357.
[22] Rohde A, Kurup S, Holdswoth M. ABI3 emerges from the seed [J]. Trends Plant Sci,
2000, 5: 418.
[23] Shinozaki K, Yamaguchishinozaki K. Molecular responses to dehydration and low
temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways [J]. Curr
Opin Plant Biol, 2000, 3: 217.
2024年3月18日发(作者：席阳华)
拟南芥E3泛素连接酶AtARRE与ABI5相互作用分析
李褚喆;王博雅;李颖;李旭锋;刘志斌
【摘 要】为了阐述AtARRE与ABA信号通路关键转录因子ABI5的作用,本研究采
用原生质体瞬间表达系统探究了AtARRE蛋白的亚细胞定位,证明AtARRE蛋白定
位于细胞核.随后,采用酵母双杂交和GST-Pull down技术分析了AtARRE与ABI5
在体外的相互作用,证明AtARRE与ABI5在体外存在相互作用.最后,本研究采用双
分子荧光互补实验进一步分析AtARRE与ABI5在体内的相互作用,结果表明共表
达AtARRE与ABI5在植物体内存在相互作用.这些结果共同表明AtARRE可能参
与了ABI5介导的植物对逆境的响应.
【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(056)002
【总页数】6页(P363-368)
【关键词】拟南芥;E3连接酶;脱落酸;AtARRE;脱落酸不敏感蛋白5
【作 者】李褚喆;王博雅;李颖;李旭锋;刘志斌
【作者单位】四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065;四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065;四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065;四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065;四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 ,成都
610065
【正文语种】中 文
【中图分类】Q78
1 引 言
每年由于非生物胁迫的影响导致农作物降低50%以上的产量,这是世界范围内的作
物损失的主要原因之一[1, 2].为了应对非生物胁迫,植物进化出了响应非生物胁迫的
调控机制,而转录后调控机制是其中重要的部分[3].泛素化-蛋白酶途径通过转录后
水平的调控作用广泛地参与到了植物细胞周期、凋亡等生命活动过程[4].泛素小分
子依赖于泛素激活酶E1,泛素结合酶E2和泛素连接酶E3结合到靶蛋白上形成多聚
泛素链,被26s蛋白酶识别并降解被泛素化修饰的蛋白.当植物受到逆境胁迫的时候,
应对胁迫的蛋白质水平迅速增加,但是蛋白浓度累积到一定程度就会对植物的代谢
产生毒害作用.因此,当胁迫消失时,累积的蛋白质需被降解处理,以保持植物体内蛋白
的内稳态平衡.RING结构E3连接酶作为泛素化-蛋白酶途在响应非生物胁迫具有
重要调节作用,如干旱或盐胁迫[5-9].
ABA是中央调控因子在许多植物对环境胁迫的响应过程,例如,ABA起到了极其重
要的作用在渗透胁迫[10,11].ABA已被证明调节和参与植物发育(如蛋白质和脂类
合成)、许多农艺性状(如种子脱水、休眠、发芽)、生殖生长[12-14].此外,ABA介
导植物响应非生物胁迫如干旱胁迫、盐胁迫、冷胁迫、病原生物胁迫[12-15].ABA
信号通路中的正调控因子能够被E3连接酶泛素化,从而通过26s蛋白酶途径降
解.ABI5是ABA信号通路中一个的转录因子,其对多种胁迫响应的正调控作用主要
通过编码 bZIP 家族蛋白来达成[16].此外,多项研究已经证明ABI5参与了依赖于
ABA 的胁迫响应途径,是 ABA 信号通路中极其重要的转录因子[17,18].本实验室前
期通过酵母双杂交实验筛选出了和拟南芥ABA信号途径中转录因子ABI5相互作
用的蛋白AtARRE,进一步实验表明,与野生型拟兰芥相比,AtARRE的T-DNA插入
拟南芥突变体在根长和萌发等表型实验上表现出对外源 ABA 的敏感性,并且突变体
中响应 ABA 信号通路下游的标志基因较野生型高.因此,前期的研究结果显示
AtARRE参与了ABA信号途径,即负调控ABA介导的逆境响应.本文利用酵母双杂
交技术、基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法、GST-Pull down实
验和双分子荧光互补法(BiFC)对AtARRE与ABI5的相互作用展开了研究.证实
AtARRE与ABI5在体外和植物体内均存在相互作用.
2 材料与方法
2.1 材 料
哥伦比亚野生型拟南芥 (Col-0)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana),pBI121、
pGADT7、pGBKT7-Rec、pGEX-6P-1、pET28a、pSPYNE、pSPYCE载体,农杆
菌GV3101、大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株、酵母菌AH109菌株、Rosetta菌株,
均为实验室保存.GST Resin购于Trans gene,His Resin购于Thermo Fisher.引物
合成和测序由擎科生物和华大基因完成.
2.2 实验方法
2.2.1 目的基因的分离和载体的构建 以实验室保存的cDNA为模板,加入
Primerstar Max DNA 聚合酶和相应的引物,PCR扩增得到目的基因片段:全长
ABI5、AtARRE和截短的ABI5.随后,构建载体:pBI121-AtARRE-GFP、pGADT7-
ABI5、pGADT7-ABI5ΔN、pGADT7-ABI5ΔC、pGBKT7-AtARRE、pET28a-
AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5、pSPYNE-AtARRE、pSPYCE-ABI5、pSPYCE-
ABI5ΔC、pSPYCE-ABI5ΔN.
2.2.2 原生质体转化 取拟南芥叶片切成细丝,放入原生质体酶解液,22 ℃ 黑暗酶解
约3 h后加入4 mL 预冷的W5,并用4层纱布过滤.离心去上清,并用4 mL 预冷的
W5洗涤两次.弃上清,加入1 mL W5,冰上放置30 min.弃上清,加入1 mL MMg.取
10～20 μL pBI121-AtARRE-GFP质粒、100 μL原生质体和110 μL 40%
PEG4000,混匀放置20 min.加入440 μL W5终止反应,然后用1 mL W5洗涤原生
质体三次,于22 ℃黑暗培养16 h,用荧光倒置显微镜观察.
2.2.3 酵母双杂交及X-Gal染色 分别共转化载体pGADT7-ABI5、pGADT7-
ABI5ΔN、pGADT7-ABI5ΔC和pGBKT7-AtARRE至AH109酵母感受态,将酵母
细胞涂布于SD/Leu-Trp-平板上,30 ℃培养3～4 d.取阳性菌落接入液体培养基
SD/Leu-Trp-, 30 ℃培养2 d,用0.9%NaCl将样品调至OD600=0.5.将样品稀释
10、100、1000倍,分别取5 μL滴定在SD/Leu-Trp-、SD/ His-Trp-Leu-平板
上,30 ℃培养3～4 d,观察菌落生长情况.用滤纸覆盖酵母平板并使滤纸与菌落充分
接触,用液氮冷冻滤纸.将滤纸和6 mL反应液放入平板,30 ℃放置8～12 h.
2.2.4 蛋白质纯化及GST-Pull down 将pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5转
入Rosetta菌株,按照蛋白纯化的步骤诱导并纯化出AtARRE、ABI5、GST蛋白.向
EP管加入40 μL GST Resin,再加入ABI5及AtARRE蛋白各5 μg,最后加入
Incubation buffer至体系总体积为500 μL,将样品置于4 ℃ 下360°旋转的摇床
上旋转2 h.用1mL Washing buffer清洗4～5次,再进行Western Blot检测.
2.2.5 双分子荧光互补 将pSPYNE-AtARRE、pSPYCE-ABI5、pSPYCE-ABI5ΔC、
pSPYCE-ABI5ΔN载体转入农杆菌,28 ℃培养过夜.离心10 min收集菌体,弃上清,
用等量侵染液清洗3次,再用侵染液重悬使OD600=1.0～1.2.静置1 h,取等量上层
液体混合,用1 mL注射器以压力注射法共同瞬时转化烟草叶片2 d, 用激光共聚焦
显微镜观察.
3 结果与分析
3.1 AtARRE的亚细胞定位
为了确定AtARRE的亚细胞定位,我们克隆了AtARRE基因的cDNA序列,并利用
pBI121载体构建了AtARRE与绿色荧光蛋白(GFP)的重组载体pBI121-AtARRE-
GFP.运用原生质体转化法将重组载体pBI121-AtARRE-GFP和pBI121-GFP空载
体导入拟南芥原生质体,使之瞬时表达并在荧光倒置显微镜下观察在拟南芥原生质
体中的荧光信号,以确定AtARRE蛋白的亚细胞定位.如图1所示,瞬时表达结果显示
有明显的绿色荧光出现在拟南芥原生质体中,说明pBI121-AtARRE-GFP 融合蛋白
载体和空载体均成功转入了拟南芥原生质体并成功表达,并且AtARRE-GFP 融合蛋
白的绿色荧光信号存在于拟南芥原生质体的细胞核,而对照GFP则表达在整个原生
质体中.该实验结果证明AtARRE蛋白定位于拟南芥细胞核,即AtARRE的表达位置
在细胞核中.
图1 AtARRE的亚细胞定位Fig.1 Subcellular location of AtARRE
3.2 酵母双杂交验证AtARRE与ABI5体外的相互作用
为了确定ABI5和AtARRE的相互作用,我们克隆了AtARRE和ABI5基因的全长
cDNA序列,并利用pGADT7和pGBKT7-Rec载体构建了重组载体pGBKT7-
AtARRE和pGADT7-ABI5.运用酵母双杂交技术共转化重组载体pGBKT7-
AtARRE和pGADT7-ABI5,并在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上培养该
酵母细胞,观察菌落在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上的生长情况.如图2
所示,pGADT7-ABI5+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,在SD/Trp-Leu-和SD/ Trp-
Leu-His-平板上长出白色、光滑、丘状的菌落,说明酵母转化成功,且ABI5和
AtARRE能够在酵母系统中发生相互作用.为了进一步确认ABI5和AtARRE相互作
用的位置,我们从ABI5 氨基酸序列的第 271 位将 ABI5 蛋白截短为N端和C端两
部分,并构建了重组载体pGADT7-ABI5ΔN和pGADT7-ABI5ΔC.将pGADT7-
ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE转入酵母后,
观察菌落在SD/Trp-Leu-与SD/ Trp-Leu-His-平板上的生长情况.如图2所
示,pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE和pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-
AtARRE转入酵母后,在SD/Trp-Leu-平板上长出白色、光滑、丘状的菌落,说明酵
母转化成功.然而,只有pGADT7-ABI5ΔN+pGBKT7-AtARRE能够在SD/ Trp-
Leu-His-平板上长出菌落,而pGADT7-ABI5ΔC+pGBKT7-AtARRE则不能,即
ABI5ΔN和AtARRE能够在酵母系统中发生相互作用.综上所述,酵母双杂交初步表
明ABI5和AtARRE可以在酵母系统中发生相互作用,且作用的位置在ABI5的C端.
图2 酵母双杂交检测AtARRE与ABI5体外的相互作用Fig.2 Detection of
interaction between AtARRE and ABI5 by yeast two hyb rid system in vitro
3.3 GST-Pull-Down验证AtARRE与ABI5体外的相互作用
为了确定AtARRE与ABI5体外的相互作用,我们利用载体pGEX-6P-1、pET28a
构建了ABI5、AtARRE的重组载体pET28a-AtARRE和pGEX-6P-1-ABI5,并利用
原核表达和亲和纯化得到纯度较高的His-AtARRE、GST-ABI5、GST蛋白,然后采
用体外GST-Pull Down验证AtARRE与ABI5在体外的相互作用.实验以10%
His-AtARRE +GST-ABI5作为实验组,10% His-AtARRE +GST作为负对照,5%
Input作为阳性对照.如图3所示,His-AtARRE+GST-ABI5和Input均可见一条单
一的目的条带,而对照组His-AtARRE+GST则不能,说明以GST树脂作为亲和材
料,GST-ABI5作为诱饵蛋白,能够吸附His-AtARRE蛋白.实验结果证明His-
AtARRE和GST-ABI在体外存在相互作用.
图3 GST-Pull Down检测AtARRE与ABI5体外的相互作用Fig.3 Detection of
interaction between AtARRE and ABI5 by Pull-Down in vitro
图4 BiFC检测AtARRE与ABI5体内的相互作用Fig.4 Detection of interaction
between AtARRE and ABI5 by BiFC in vivo
3.4 BiFC验证AtARRE与ABI5体内的相互作用
为了验证AtARRE与ABI5在植物体内的相互作用,我们利用双分子表达载体
pSPYNE和pSPYCE构建了ABI5、AtARRE的重组表达载体pSPYNE-AtARRE和
pSPYCE-ABI5.利用烟草侵染法将构建好的重组载体pSPYNE-AtARRE和
pSPYCE-ABI5共转化至烟草叶片中,培养2 d后用激光共聚焦显微镜观察荧光信号
的表达情况.双分子荧光互补实验(BiFC)结果显示共转化pSPYNE-
AtARRE+pSPYCE-ABI5能够在烟草叶片细胞中观察到荧光信号,说明AtARRE与
ABI5在体内存在相互作用.为了进一步验证AtARRE与ABI5在体内的相互作用的
位点,我们构建了重组载体pSPYCE-ABI5ΔC(缺失C端)和pSPYCE-ABI5ΔN(缺失
N端)并将之分别和pSPYNE-AtARRE共转化至烟草细胞.BiFC结果显示pSPYNE-
AtARRE+pSPYCE-ABI5ΔN能够观察到荧光,而pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-
ABI5ΔC则无法观察到荧光,说明AtARRE与ABI5在体内存在相互作用的位置在
ABI5的C端.值得注意的是,AtARRE+pSPYCE-ABI5ΔN荧光的强度明显比
pSPYNE-AtARRE+pSPYCE-ABI5弱,说明ABI5和AtARRE发生相互作用的位置
在ABI5的C端,但是ABI5的N端也起到了辅佐作用,这与酵母双杂交的结果是一
致的.
4 讨 论
植物对非生物胁迫的响应涉及许多分子途径的相互作用[19].在胁迫条件下,许多基
因发生上调使植物能够承受胁迫,因此形成植物的适应[20].在非生物胁迫的响应中
担任信号的是各种化学物质,如钙(Ca2+)、糖、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)等,不同
的信号通路既相互独立也相互影响[21].植物激素参与植物对非生物胁迫的耐受性
和适应作用,最重要的两种激素是脱落酸(ABA)和乙烯[22].作为重要的植物激
素,ABA在植物耐受性的形成中起到了重要的调节作用,信号通路通过ABA诱导生
产和积累在ABA信号转导中起重要作用的第二信使,如Ca2+、磷脂酸(PA)和活性
氧(ROS)等[23].因此,ABA信号通路和其涉及的各种蛋白是研究植物抗逆的重要课
题.
拟南芥有超过1400种E3连接酶,这表明E3连接酶是底物特异性的主要决定因素,
因此,作为泛素化-蛋白酶途径的重要组成部分的E3连接酶也是目前研究植物抗逆
机制的重点.作为植物抗逆的一个重要的途径,ABA信号途径中有多个转录因子参与
植物与ABA相关胁迫的应答过程.这些转录因子可能被泛素化途径识别靶定,并通
过26s蛋白酶体途径降解来调控植物的应答反应.泛素化系统中E3连接酶起着识
别与靶定底物的作用,因而研究E3连接酶与底物蛋白的作用对于研究植物的胁迫响
应有着重要意义.
经过本实验室前期研究发现AtARRE负调控ABA信号途径并鉴定了AtARRE的
E3连接酶活性.基于以上研究成果,本研究利用酵母双杂交技术、基于绿色荧光蛋白
瞬时表达的植物亚细胞定位方法、GST-Pull down实验和双分子荧光互补法(BiFC)
对AtARRE与ABI5的相互作用展开了研究.结果显示,AtARRE与ABA信号途径中
的转录因子ABI5存在相互作用,且AtARRE主要与ABI5的C端存在相互作用.因
此,我们的研究结果预示了AtARRE可能通过泛素化修饰ABI5来负调控ABA信号
途径,进而调节拟南芥响应非生物胁迫.为了进一步揭示AtARRE与ABI5之间的关
系,清楚AtARRE在ABA信号途径中的调控作用,最终达到了解植物抗逆分子机制
的目的,后期的研究需要利用体外泛素化和Co-IP等研究手段,从体外和体内两个角
度研究AtARRE是否能够泛素化修饰ABI5,从而探究AtARRE在ABA信号途径中
的功能.
参考文献:
【相关文献】
[1] Bray E A, Bailey-Serres J, Weretilnyk E. Responses to abiotic stresses [C]// Buchanan B
B, Gruissem W, Jones R L. Biochemistry and molecular biology of plants. Rockville:
American Society of Plant Physiologists, 2000.
[2] Wang W, Vinocur B, Altman A. Plant responses to drought, salinity and extreme
temperatures: Towards genetic engineering for stress tolerance [J]. Planta, 2003, 218: 1.
[3] Reece J, Taylor M R, Simon E J, et al. Campbell biology [M]. Amsterdam: Addison-
Wesley Longman, 2011.
[4] Deshaies R J, Joazeiro C A P. RING Domain E3 Ubiquitin Ligases [J]. Annu Rev Biochem,
2009, 78: 399.
[5] Zhang X, Garreton V, Chua N H. The AIP2 E3 ligase acts as a novel negative regulator
of ABA signaling by promoting ABI3 degradation [J]. Gene Dev, 2005, 19: 1532.
[6] Stone S L, Williams L A, Farmer L M, et al. KEEP ON GOING, a RING E3 ligase essential
for Arabidopsis growth and development, is involved in abscisic acid signaling [J]. Plant
Cell, 2006, 18: 3415.
[7] Bu Q, Li H, Zhao Q, et al. The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2a is a novel
positive regulator of abscisic acid signaling during seed germination and early seedling
development [J]. Plant Physiol, 2009, 150: 463.
[8] Liu H, Stone S L. Abscisic acid increases Arabidopsis ABI5 transcription factor levels by
promoting KEG E3 ligase self-ubiquitination and proteasomal degradation [J]. Plant Cell,
2010, 22: 2630.
[9] Li H, Jiang H, Bu Q, et al. The Arabidopsis RING finger E3 ligase RHA2b acts additively
with RHA2a in regulating abscisic acid signaling and drought Response [J]. Plant Physiol,
2011, 156: 550.
[10] Takahashi S, Seki M, Ishida J, et al. Monitoring the expression profiles of genes
induced by hyperosmotic, high salinity, and oxidative stress and abscisic acid treatment in
Arabidopsis cell culture using a full-length cDNA microarray [J]. Plant Mol Biol, 2004, 56:
29.
[11] Tuteja N. Cold, salinity, and drought stress [C]// Plant stress biology: from genomics
to systems biology. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2009.
[12] Kaur N, Gupta A K. Signal transduction pathways under abiotic stresses in plants [J].
Curr Sci, 2005, 88: 1771.
[13] Goda H, Sasaki E, Akiyama K, et al. The AtGenExpress hormone and chemical
treatment data set: experimental design, data evaluation, model data analysis and data
access [J]. Plant J, 2008, 55: 526.
[14] Bansal K C, Lenka S K, Tuteja N. Abscisic acid in abiotic stress tolerance: an 'omics'
approach [M]. Omics and plant abiotic stress tolerance. Sharjah: Bentham Science, 2011.
[15] Hubbard K E, Nishimura N, Hitomi K, et al. Early abscisic acid signal transduction
mechanisms: newly discovered components and newly emerging questions [J]. Gene Dev,
2010, 24: 1695.
[16] Finkelstein R R, Lynch T J. The Arabidopsis abscisic acid response gene ABI5 encodes
a basic leucine zipper transcription factor [J]. Plant Cell, 2000, 12: 599.
[17] Vidyasagar A, Lutkenhaus J. Sumoylation of ABI5 by the Arabidopsis SUMO E3 ligase
SIZ1 negatively regulates abscisic acid signaling [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:
5418.
[18] Seiler C, Harshavardhan V T, Rajesh K, et al. ABA biosynthesis and degradation
contributing to ABA homeostasis during barley seed development under control and
terminal drought-stress conditions [J]. J Exp Biol, 2011, 62: 2615.
[19] Viswanathan, Chinnusamy, Zhizhong, et al. Abscisic acid-mediated epigenetic
processes in plant development and stress responses [J]. J Integr Plant Biol, 2008, 50: 1187.
[20] Leung J, Giraudat J. Abscisic acid signal transduction [J]. Annu Rev Plant Phys, 1998,
49: 199.
[21] Rock C D. Pathways to abscisic acid-regulated gene expression [J]. New Phytol, 2000,
148: 357.
[22] Rohde A, Kurup S, Holdswoth M. ABI3 emerges from the seed [J]. Trends Plant Sci,
2000, 5: 418.
[23] Shinozaki K, Yamaguchishinozaki K. Molecular responses to dehydration and low
temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways [J]. Curr
Opin Plant Biol, 2000, 3: 217.