2024年3月28日发(作者：淳于新曦)
实验操作过程 胡建和 共6页 第1页 2022-4-28
RiboMAX
TM
Large Scale RNA Production Systems-T7
保存方法：避免反复冻融或者经常变换温度，以防影响产品稳定性。
保存温度：-20℃
试剂组成：
ATP 100µl
CTP 100µl
GTP 100µl
UTP 100µl
RQ1 RNase-Free DNase 110U
醋酸钠 3.0M(pH 5.2) 1ml
T7线性化对照DNA 10µl
酶混合物，T7 RNA聚合酶 120µl
T7 5×转录缓冲液 240µl
无核酸酶水 1.25ml
质量控制：
32
P标记RNA除另外加入5µCi α-
32
P CTP 400Ci/mmol之外，其它参照TB166所述方案进行。在
这些条件下，经TCA沉淀计算，会有>40µg的RNA合成。
RNA完整性：
上述转录反应产物经凝胶电泳分析和放射自显影分析，最低标准应当有90%的RNA按预期大小迁
移成一条单一的带。
I．概述
体外转录反应广泛用于从重组DNA模板合成微克量的RNA探针。大多数用于生产RNA探针的转
录反应多用于放射标记核糖核酸的合成，而不是合成大量的RNA。但体外转录也用于需要大量具生物
活性RNA的时候。大量的RNA产物可用于体外翻译、合成tRNA、rRNA或其它小的功能性RNA、
RNA病毒基因组和核酶， 亦用于RNA拼接的底物、RNA的二级结构、反义RNA以及RNA-蛋白相
互作用的研究。
RiboMAX
TM
Large Scale RNA Production Systems可产生微克量的RNA，转录产物可达14kb；但是，
通常用于生产5~6kb的转录产物。RiboMAX
TM
Systems在1ml反应体系中可稳定地合成2~5mg RNA，
大约比标准Riboprobe
®
System转录反应多10~20倍。RiboMAX
TM
Systems不同于Riboprobe
®
System之
处主要有三个基本方面：(1) 使用HEPES(pH 7.5)缓冲液而不是Tris-HCl(pH 7.9)缓冲液，rNTP和镁浓
度调整到接近T7 RNA聚合酶活性浓度。(2) 反应中添加了酵母无机焦磷酸酶(pyrophosphatese)。(3) 体
系中含有rRNasein
®
RNA酶抑制剂。RiboMAX
TM
Systems另外的优点是，合成高质量的RNA可用于兔
网状细胞翻译系统的体外翻译。增强的翻译能力尤其体现在高RNA浓度通常抑制体外翻译的时候。尽
管影响RNA产物的改良和翻译效率的原因还不太清楚，RiboMAX
TM
Systems对希望合成大量用于体外
翻译RNA的研究工作者来说是有用的。成分中对翻译抑制作用的减少，可能对其它需要应用生物活性
RNA的工作来说，亦是极为有利的。
因为RiboMAX
TM
Systems产生大量的RNA，这些系统不推荐用于生产高特异活性的RNA探针。
产生此种探针的放射标记核苷酸的量将会极为昂贵。
II．定货信息
RiboMAX
TM
Large Scale RNA Production Systems-T7 P1300
每个系统中含足够的试剂用于1ml反应或50个标准的20µl反应体系。包括：
实验操作过程 胡建和 共6页 第2页 2022-4-28
酶混合物(RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、酵母无机焦磷酸酶) 120µl
5×转录缓冲液 240µl
各种rNTP，100mM 100µl
线性对照DNA，1mg/ml 10µl
3M醋酸钠，pH 5.2 1ml
无核酸酶水 1.25ml
技术材料 1份
保存：所有试剂存放于-20℃。长期使用或使用不频繁时，可存放在-70℃。RiboMAX
TM
Systems存
放和使用合适时，至少可保持6个月稳定。注意避免多次冻融。
III．DNA模板的准备
用户自备的试剂：
(溶液组成见VI部分)
氯仿:异戊醇(24:1)
TE饱和酚(pH 8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)
乙醇(70%和95%)
A．模板线性化
理想RNA合成依赖于使用高质量的DNA模板，氯化铯纯化和Wizard
®
Plus Minipreps DNA
Purification System(A7100)方法获得的DNA均适用于转录反应。在DNA中不含RNA酶至关重要。如
果可疑含有RNA酶，用蛋白激酶K(100µg/ml)和SDS(0.5%)在50mM Tris-HCl(pH 7.5)和5mM CaCl
2
中，
37℃处理30min(6)，再用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，再用乙醇沉淀(见IV. B第3~6步)。
DNA模板通常在体外转录合成特定长度RNA之前先线性化，用合适的限制性内切酶线性化DNA，
再进行纯化，例如酚抽提后，乙醇沉淀或者用Wizard® DNA Clean-Up System(A7280)纯化。最好比转录
反应量DNA多30%用于补偿DNA纯化或凝胶电泳观察时的损失。
严格避免使用产生3’游离端的限制性内切酶(见表1)，使用这样的模板在转录时，除预期转录产物
之外，还会有额外的转录产物(7)，额外的转录产物会包含与预期转录产物互补的序列，也会产生和载
体DNA相应的序列。如果必须使用这些酶，可以用DNA聚合酶I大Klenow片段(M2201)在转录前钝
化线性模板。
Table 1．通常产生3’游离端的限制酶
略
PCR合成的含合适噬菌体转录启动子的DNA可用于转录反应。噬菌体启动子序列可以用带有噬菌
体启动子序列的载体或5’端带有启动子寡核苷酸在PCR反应时与DNA连接。PCR合成的DNA可以用
Wizard® PCR Preps DNA Purification System(A7170)进行纯化。
纯化的线性DNA在转录前应当用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，核实完全线性化且保证
出现一个干净(未降解的)与预期大小相附的DNA片段。
B．3’游离端的钝化。
略
IV．转录方案
本方案依据2个发表的用HEPES缓冲液(1)和酵母无机焦磷酸酶方案修改而成。与标准转录方案(8)
相比，本系统进行了改进，文献3资料表明，本系统合成的RNA翻译能力有所增强。
提供的线性化对照DNA，含有一个荧光素酶基因在T7启动子控制之下，这个DNA可产生一个
1800bp含有poly(A)尾巴的转录产物，因为荧光素酶必须全长才能表现活性，对照DNA的转录和翻译
用荧光素酶分析是一个极为方便的方法以核实是否为全长转录。
2024年3月28日发(作者：淳于新曦)
实验操作过程 胡建和 共6页 第1页 2022-4-28
RiboMAX
TM
Large Scale RNA Production Systems-T7
保存方法：避免反复冻融或者经常变换温度，以防影响产品稳定性。
保存温度：-20℃
试剂组成：
ATP 100µl
CTP 100µl
GTP 100µl
UTP 100µl
RQ1 RNase-Free DNase 110U
醋酸钠 3.0M(pH 5.2) 1ml
T7线性化对照DNA 10µl
酶混合物，T7 RNA聚合酶 120µl
T7 5×转录缓冲液 240µl
无核酸酶水 1.25ml
质量控制：
32
P标记RNA除另外加入5µCi α-
32
P CTP 400Ci/mmol之外，其它参照TB166所述方案进行。在
这些条件下，经TCA沉淀计算，会有>40µg的RNA合成。
RNA完整性：
上述转录反应产物经凝胶电泳分析和放射自显影分析，最低标准应当有90%的RNA按预期大小迁
移成一条单一的带。
I．概述
体外转录反应广泛用于从重组DNA模板合成微克量的RNA探针。大多数用于生产RNA探针的转
录反应多用于放射标记核糖核酸的合成，而不是合成大量的RNA。但体外转录也用于需要大量具生物
活性RNA的时候。大量的RNA产物可用于体外翻译、合成tRNA、rRNA或其它小的功能性RNA、
RNA病毒基因组和核酶， 亦用于RNA拼接的底物、RNA的二级结构、反义RNA以及RNA-蛋白相
互作用的研究。
RiboMAX
TM
Large Scale RNA Production Systems可产生微克量的RNA，转录产物可达14kb；但是，
通常用于生产5~6kb的转录产物。RiboMAX
TM
Systems在1ml反应体系中可稳定地合成2~5mg RNA，
大约比标准Riboprobe
®
System转录反应多10~20倍。RiboMAX
TM
Systems不同于Riboprobe
®
System之
处主要有三个基本方面：(1) 使用HEPES(pH 7.5)缓冲液而不是Tris-HCl(pH 7.9)缓冲液，rNTP和镁浓
度调整到接近T7 RNA聚合酶活性浓度。(2) 反应中添加了酵母无机焦磷酸酶(pyrophosphatese)。(3) 体
系中含有rRNasein
®
RNA酶抑制剂。RiboMAX
TM
Systems另外的优点是，合成高质量的RNA可用于兔
网状细胞翻译系统的体外翻译。增强的翻译能力尤其体现在高RNA浓度通常抑制体外翻译的时候。尽
管影响RNA产物的改良和翻译效率的原因还不太清楚，RiboMAX
TM
Systems对希望合成大量用于体外
翻译RNA的研究工作者来说是有用的。成分中对翻译抑制作用的减少，可能对其它需要应用生物活性
RNA的工作来说，亦是极为有利的。
因为RiboMAX
TM
Systems产生大量的RNA，这些系统不推荐用于生产高特异活性的RNA探针。
产生此种探针的放射标记核苷酸的量将会极为昂贵。
II．定货信息
RiboMAX
TM
Large Scale RNA Production Systems-T7 P1300
每个系统中含足够的试剂用于1ml反应或50个标准的20µl反应体系。包括：
实验操作过程 胡建和 共6页 第2页 2022-4-28
酶混合物(RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、酵母无机焦磷酸酶) 120µl
5×转录缓冲液 240µl
各种rNTP，100mM 100µl
线性对照DNA，1mg/ml 10µl
3M醋酸钠，pH 5.2 1ml
无核酸酶水 1.25ml
技术材料 1份
保存：所有试剂存放于-20℃。长期使用或使用不频繁时，可存放在-70℃。RiboMAX
TM
Systems存
放和使用合适时，至少可保持6个月稳定。注意避免多次冻融。
III．DNA模板的准备
用户自备的试剂：
(溶液组成见VI部分)
氯仿:异戊醇(24:1)
TE饱和酚(pH 8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)
乙醇(70%和95%)
A．模板线性化
理想RNA合成依赖于使用高质量的DNA模板，氯化铯纯化和Wizard
®
Plus Minipreps DNA
Purification System(A7100)方法获得的DNA均适用于转录反应。在DNA中不含RNA酶至关重要。如
果可疑含有RNA酶，用蛋白激酶K(100µg/ml)和SDS(0.5%)在50mM Tris-HCl(pH 7.5)和5mM CaCl
2
中，
37℃处理30min(6)，再用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，再用乙醇沉淀(见IV. B第3~6步)。
DNA模板通常在体外转录合成特定长度RNA之前先线性化，用合适的限制性内切酶线性化DNA，
再进行纯化，例如酚抽提后，乙醇沉淀或者用Wizard® DNA Clean-Up System(A7280)纯化。最好比转录
反应量DNA多30%用于补偿DNA纯化或凝胶电泳观察时的损失。
严格避免使用产生3’游离端的限制性内切酶(见表1)，使用这样的模板在转录时，除预期转录产物
之外，还会有额外的转录产物(7)，额外的转录产物会包含与预期转录产物互补的序列，也会产生和载
体DNA相应的序列。如果必须使用这些酶，可以用DNA聚合酶I大Klenow片段(M2201)在转录前钝
化线性模板。
Table 1．通常产生3’游离端的限制酶
略
PCR合成的含合适噬菌体转录启动子的DNA可用于转录反应。噬菌体启动子序列可以用带有噬菌
体启动子序列的载体或5’端带有启动子寡核苷酸在PCR反应时与DNA连接。PCR合成的DNA可以用
Wizard® PCR Preps DNA Purification System(A7170)进行纯化。
纯化的线性DNA在转录前应当用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，核实完全线性化且保证
出现一个干净(未降解的)与预期大小相附的DNA片段。
B．3’游离端的钝化。
略
IV．转录方案
本方案依据2个发表的用HEPES缓冲液(1)和酵母无机焦磷酸酶方案修改而成。与标准转录方案(8)
相比，本系统进行了改进，文献3资料表明，本系统合成的RNA翻译能力有所增强。
提供的线性化对照DNA，含有一个荧光素酶基因在T7启动子控制之下，这个DNA可产生一个
1800bp含有poly(A)尾巴的转录产物，因为荧光素酶必须全长才能表现活性，对照DNA的转录和翻译
用荧光素酶分析是一个极为方便的方法以核实是否为全长转录。