2024年4月2日发(作者：第五丹)
.
蛋白提取（所有操作在冰上进行）
1. 裂解
1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）
取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀
2) 称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液
体与组织比例为20：1），冰上静置10min
2. 匀浆
先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）
在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min
3. 离心（在基础4楼416室）
1) 自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量
超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）
2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min
3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中
4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1）
将样品转移至2~3个0.5mlAP管中
加上样缓冲液，100℃变性10min
仪器屏幕：
5. 保存
变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用
精选范本
S5
S5
100．0
00：10
00：10
温度（℃）
时间（时：分钟）
.
WB实验步骤
1.
清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对
齐，以免漏胶。
2. 配制分离胶
1)
2)
准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）
10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）
5.91ml
4.95ml
3.75ml
150
μl
150
μl
9
μl
超纯水
丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效
Ph8.8Tris▪HCL
10%SDS
AP（催化剂促凝作用）
TEMED
混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）
3.
灌胶
沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出
防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止
4.
水封
立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响
电泳效果，等待20-30min
5.
浓缩胶的配制（5%）
4.13ml
1ml
750
μl
60
μl
60
μl
6
μl
超纯水
丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效
Ph6.8 Tris▪HCL
10%SDS
AP（催化剂促凝作用）
TEMED
精选范本
.
搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min
6.
1)
电泳（电泳液最多使用两次）
安装电泳装置
低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔
出防止拔歪）
2) 点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）
Mark
样品
4μl
8μl
（Protern ladder）推荐9μ，实际4μ已经足够
7-10μl均可内参挑齐即可
组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪
3) 连接电泳仪
电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳
先调电压至70mV，跑约20min。（Mark跑开，分出彩带即可）
再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）
注：Mark的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在
哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸
泡
7.
1)
转膜（转移液可用3-4次）
剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终
保持湿润）
2)
3)
剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上
“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、
两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）
4)
5)
安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）
打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰
转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色
8. 封闭
1) 配制5%脱脂奶粉：
2.5g脱脂奶粉
50mlTBST
精选范本
小烧杯中混匀加入皿中
.
2) 将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移
液可以重复利用2次）
9. 一抗
1) 用TBST配，每一格加5ml TBST，再分别加入抗体
抗体的量：
2l（Psmad2l）免抗
2l（Psmad2l）免抗
Jnk免抗
内参（小鼠抗GAPH）
单抗，中杉金桥
2)
3)
10. 洗脱
用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。
11. 二抗
1) 用3%的脱脂奶粉
1.5g的脱脂奶粉
50mlTBST
2) 每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即加入1μl
注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用
免抗
3)
12. 洗脱
用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。
精选范本
膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）
小烧杯中混匀加入皿中
膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）
4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）
1:1000
1:500
1:1000
1:5000
5μl：5ml
10μl：5ml
5μl：5ml
1μl：5ml
58（分子量）
58
双带
36
.
13. 显影：
1)
2)
3)
4)
U盘
A液，B液（显影液。4℃保存）
所需物品
200μl枪+枪头（黄）
膜（置于皿中）
开机后自动预冷，温度降到1-20℃才可
显影液现配现用（A液：B液=1：1）
膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上
先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗
细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体
的专一性。
5) 每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘
试剂配方：
精选范本
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精选范本
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精选范本
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精选范本
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精选范本
2024年4月2日发(作者：第五丹)
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蛋白提取（所有操作在冰上进行）
1. 裂解
1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）
取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀
2) 称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液
体与组织比例为20：1），冰上静置10min
2. 匀浆
先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）
在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min
3. 离心（在基础4楼416室）
1) 自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量
超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）
2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min
3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中
4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1）
将样品转移至2~3个0.5mlAP管中
加上样缓冲液，100℃变性10min
仪器屏幕：
5. 保存
变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用
精选范本
S5
S5
100．0
00：10
00：10
温度（℃）
时间（时：分钟）
.
WB实验步骤
1.
清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对
齐，以免漏胶。
2. 配制分离胶
1)
2)
准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）
10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）
5.91ml
4.95ml
3.75ml
150
μl
150
μl
9
μl
超纯水
丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效
Ph8.8Tris▪HCL
10%SDS
AP（催化剂促凝作用）
TEMED
混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）
3.
灌胶
沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出
防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止
4.
水封
立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响
电泳效果，等待20-30min
5.
浓缩胶的配制（5%）
4.13ml
1ml
750
μl
60
μl
60
μl
6
μl
超纯水
丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效
Ph6.8 Tris▪HCL
10%SDS
AP（催化剂促凝作用）
TEMED
精选范本
.
搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min
6.
1)
电泳（电泳液最多使用两次）
安装电泳装置
低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔
出防止拔歪）
2) 点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）
Mark
样品
4μl
8μl
（Protern ladder）推荐9μ，实际4μ已经足够
7-10μl均可内参挑齐即可
组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪
3) 连接电泳仪
电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳
先调电压至70mV，跑约20min。（Mark跑开，分出彩带即可）
再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）
注：Mark的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在
哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸
泡
7.
1)
转膜（转移液可用3-4次）
剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终
保持湿润）
2)
3)
剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上
“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、
两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）
4)
5)
安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）
打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰
转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色
8. 封闭
1) 配制5%脱脂奶粉：
2.5g脱脂奶粉
50mlTBST
精选范本
小烧杯中混匀加入皿中
.
2) 将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移
液可以重复利用2次）
9. 一抗
1) 用TBST配，每一格加5ml TBST，再分别加入抗体
抗体的量：
2l（Psmad2l）免抗
2l（Psmad2l）免抗
Jnk免抗
内参（小鼠抗GAPH）
单抗，中杉金桥
2)
3)
10. 洗脱
用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。
11. 二抗
1) 用3%的脱脂奶粉
1.5g的脱脂奶粉
50mlTBST
2) 每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即加入1μl
注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用
免抗
3)
12. 洗脱
用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。
精选范本
膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）
小烧杯中混匀加入皿中
膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）
4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）
1:1000
1:500
1:1000
1:5000
5μl：5ml
10μl：5ml
5μl：5ml
1μl：5ml
58（分子量）
58
双带
36
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13. 显影：
1)
2)
3)
4)
U盘
A液，B液（显影液。4℃保存）
所需物品
200μl枪+枪头（黄）
膜（置于皿中）
开机后自动预冷，温度降到1-20℃才可
显影液现配现用（A液：B液=1：1）
膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上
先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗
细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体
的专一性。
5) 每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘
试剂配方：
精选范本
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精选范本
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精选范本
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精选范本
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精选范本