2024年4月2日发(作者：检觅山)
WB常见问题----westernblot条件摸索的问题
1. 用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能
显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要
的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发
现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮
钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞，4度12000g离
心5分钟，取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上
样。不知道是哪里出了问题？
解答：建议：a、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测
蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。
b、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的
分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10％和12％的胶。60-80V，1小时左右。跑
过积层胶与分离胶的线时，换用100V，3-4小时。
c、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，
并不是真正的少，而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和
45分钟的区别并不大。
d、根据MARKER的条带（我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD），
您根据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条
带。这样第一，可以节省抗体，第二，您要的目的条带肯定在上面。
e、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。
f、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应该先找其他方面的
原因。
2. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100
分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白
不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。
解答：电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。
正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。
建议你用恒压80－100伏。
3. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），
当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。
就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用
恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20 v
左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到8OmA，30min后就
稳定在40mA，不就相当于恒流吗？
解答：恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故，如果
电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd
以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。
2024年4月2日发(作者：检觅山)
WB常见问题----westernblot条件摸索的问题
1. 用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能
显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要
的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发
现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮
钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞，4度12000g离
心5分钟，取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上
样。不知道是哪里出了问题？
解答：建议：a、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测
蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。
b、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的
分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10％和12％的胶。60-80V，1小时左右。跑
过积层胶与分离胶的线时，换用100V，3-4小时。
c、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，
并不是真正的少，而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和
45分钟的区别并不大。
d、根据MARKER的条带（我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD），
您根据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条
带。这样第一，可以节省抗体，第二，您要的目的条带肯定在上面。
e、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。
f、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应该先找其他方面的
原因。
2. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100
分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白
不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。
解答：电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。
正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。
建议你用恒压80－100伏。
3. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），
当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。
就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用
恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20 v
左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到8OmA，30min后就
稳定在40mA，不就相当于恒流吗？
解答：恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故，如果
电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd
以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。