2024年4月2日发(作者：利惠美)
步骤
：
样品制备
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞3次，去尽残留液体，可以将培养瓶倒置，下面放吸水纸或者干棉花。
3．加入1% SDS裂解液(我们用的是200ulRIPA,，注意整个装RIPA 的EP管先前需要加入10ul的PMSF.)(6-well
plate(6孔板), 100 μl /w；75 cm
2
plate, 500-1000 μl/瓶)，冰上静置5min后，用枪头折弯或者细胞刮刮落细胞，
转移到Ep管。注意：蛋白提取必须冰上操作，以免蛋白降解，先把细胞培养瓶放冰上预冷（裂解目的是
使细胞膜破裂，蛋白可以释放）。(此时可以-20℃保存，4-6步可以做WB当天再做)
4．超声功率10%， 10~15秒间歇20秒，剪切DNA以减低样品粘性，到蛋白尽量澄清。
5．离心 12000g, 5 min，取上清。
6．煮沸样品5 min。
制胶槽
前一天，清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精将板洗净。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水
冲洗干净后立在筐里晾干。
1） 玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧，即旋转到1.0（一定要对齐，以免漏胶，最好双人操作，一人用力
往下压，卡紧后一定要用梳子先试一下，看是否能插入，调节一下。否则配浓缩胶后插梳子很无奈）。然后
垂直卡在夹子上准备配胶。
2）
配胶
：先配分离胶，再配浓缩胶。（物品大部分在新冰箱4度，用完最好尽快拧紧放回）
我们实验室常配的
（单位均为ml）
超纯水
30％Acr/Bic（丙烯酰胺）
分离胶 分离胶
10ml 15ml
2．0
4．0
3．0
6．0
5．7
浓缩胶
2ml
1．4
0．33
浓缩胶
4ml
2．7
0．67
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）
3．8
1 mol/L Tris·HCl（pH6.8）
10％SDS
10%APS（过硫胺酸）
TEMED
0．1
0．1
0．004
0．15
0．15
0．006
0．25
0．02
0．02
0．002
0．5
0．04
0．04
0．004
注意：APS是催化剂，TEMED是加速剂。TEMED量很少，所以要注意观察有没有吸上来，也要注意不能
插太深，防止枪头壁上粘太多，TEMED加后凝固很快，并且凝固时间和温度关系很大，换句话说，冬天
TEMED加的要多些。
3） 按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，用枪多次吸取1ml胶沿玻璃放出，
待胶面升到制胶架？？？？高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。然后胶上加一层无
水酒精，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定
要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。加酒精时，可以来回移
动枪头）
4） 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固（30min左右）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上
的酒精，并用滤纸将酒精吸干（小心滤纸割伤胶，小心滤纸碎片留在里面）。
5） 按前面的方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶（这样安排配胶可以使酒精在这段时间
内继续挥发）。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中
有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平（梳子使用前保证干净且干燥，梳子有规格面朝里）。待到浓
缩胶凝固后（室温30min），将凝胶放入电泳槽中（先将部分电泳液倒在制胶槽内，否则会溢出，电泳液
可以重复利用，不要倒掉）。在上下槽内加入不够的电泳液，上槽内的电泳液应没过小玻璃板上缘，下槽
内的电泳液应没过金属丝，排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡。加入电泳液后，两手分别捏住梳子的
两边竖直向上轻轻将其拔出。
6）用电泳液冲洗一下浓缩胶，（目的是去除梳子遗留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成条带变形）
可以前一天配胶备用，保鲜膜4度保存，可一周
电泳分离：
1．样品与上样缓冲液混合（如果是10x上样缓冲液，就是1份的上样缓冲液加9份样品），上样
15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 胶 ( 10 cm x 10 cm)电泳。将枪头插至上样孔中加入样品（上样速度要快，防
止样品扩散导致相互影响，但上样过快又会使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一
个样品时要换枪头，以免交叉污染）。一般marker加6ul。为避免边缘效应，最好选择中间的孔上样（我
们一般都在边缘的）。
一般10齿，1.5mm梳子上样量可以到25ul；15齿，1.0mm梳子上样量可以到20ul。
2024年4月2日发(作者：利惠美)
步骤
：
样品制备
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞3次，去尽残留液体，可以将培养瓶倒置，下面放吸水纸或者干棉花。
3．加入1% SDS裂解液(我们用的是200ulRIPA,，注意整个装RIPA 的EP管先前需要加入10ul的PMSF.)(6-well
plate(6孔板), 100 μl /w；75 cm
2
plate, 500-1000 μl/瓶)，冰上静置5min后，用枪头折弯或者细胞刮刮落细胞，
转移到Ep管。注意：蛋白提取必须冰上操作，以免蛋白降解，先把细胞培养瓶放冰上预冷（裂解目的是
使细胞膜破裂，蛋白可以释放）。(此时可以-20℃保存，4-6步可以做WB当天再做)
4．超声功率10%， 10~15秒间歇20秒，剪切DNA以减低样品粘性，到蛋白尽量澄清。
5．离心 12000g, 5 min，取上清。
6．煮沸样品5 min。
制胶槽
前一天，清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精将板洗净。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水
冲洗干净后立在筐里晾干。
1） 玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧，即旋转到1.0（一定要对齐，以免漏胶，最好双人操作，一人用力
往下压，卡紧后一定要用梳子先试一下，看是否能插入，调节一下。否则配浓缩胶后插梳子很无奈）。然后
垂直卡在夹子上准备配胶。
2）
配胶
：先配分离胶，再配浓缩胶。（物品大部分在新冰箱4度，用完最好尽快拧紧放回）
我们实验室常配的
（单位均为ml）
超纯水
30％Acr/Bic（丙烯酰胺）
分离胶 分离胶
10ml 15ml
2．0
4．0
3．0
6．0
5．7
浓缩胶
2ml
1．4
0．33
浓缩胶
4ml
2．7
0．67
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）
3．8
1 mol/L Tris·HCl（pH6.8）
10％SDS
10%APS（过硫胺酸）
TEMED
0．1
0．1
0．004
0．15
0．15
0．006
0．25
0．02
0．02
0．002
0．5
0．04
0．04
0．004
注意：APS是催化剂，TEMED是加速剂。TEMED量很少，所以要注意观察有没有吸上来，也要注意不能
插太深，防止枪头壁上粘太多，TEMED加后凝固很快，并且凝固时间和温度关系很大，换句话说，冬天
TEMED加的要多些。
3） 按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，用枪多次吸取1ml胶沿玻璃放出，
待胶面升到制胶架？？？？高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。然后胶上加一层无
水酒精，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定
要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。加酒精时，可以来回移
动枪头）
4） 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固（30min左右）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上
的酒精，并用滤纸将酒精吸干（小心滤纸割伤胶，小心滤纸碎片留在里面）。
5） 按前面的方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶（这样安排配胶可以使酒精在这段时间
内继续挥发）。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中
有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平（梳子使用前保证干净且干燥，梳子有规格面朝里）。待到浓
缩胶凝固后（室温30min），将凝胶放入电泳槽中（先将部分电泳液倒在制胶槽内，否则会溢出，电泳液
可以重复利用，不要倒掉）。在上下槽内加入不够的电泳液，上槽内的电泳液应没过小玻璃板上缘，下槽
内的电泳液应没过金属丝，排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡。加入电泳液后，两手分别捏住梳子的
两边竖直向上轻轻将其拔出。
6）用电泳液冲洗一下浓缩胶，（目的是去除梳子遗留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成条带变形）
可以前一天配胶备用，保鲜膜4度保存，可一周
电泳分离：
1．样品与上样缓冲液混合（如果是10x上样缓冲液，就是1份的上样缓冲液加9份样品），上样
15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 胶 ( 10 cm x 10 cm)电泳。将枪头插至上样孔中加入样品（上样速度要快，防
止样品扩散导致相互影响，但上样过快又会使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一
个样品时要换枪头，以免交叉污染）。一般marker加6ul。为避免边缘效应，最好选择中间的孔上样（我
们一般都在边缘的）。
一般10齿，1.5mm梳子上样量可以到25ul；15齿，1.0mm梳子上样量可以到20ul。