2024年4月6日发(作者：风冰薇)
1 试验材料
吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过 10 目筛，去
除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。
1 .2 仪器设备及药品
电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、
电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。
TENP 缓 冲 液 （50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、
CTAB 提 取 缓 冲 液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na
Cl，1%CTAB，pH 8.0）、
SDS 提取缓冲液 （100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加 β
-巯基乙醇至 10 mmol/L）、
异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓
冲液、DNAMarker 等。
主要试剂有十二烷基硫酸钠 （ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸 （ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴
化铵 （ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。
1 .3 试验方法
1.3.1 土壤微生物的洗涤 取土壤样品 2g，置于 50m L 灭菌的离心管中；加入 10m L TENP
缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心 5min，弃上清，重复洗涤多
次至上清基本无色；最后将沉淀收集至 1.5ml 离心管中。
1.3.2 DNA 的提取
1.3.2.1 CTAB 法 按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→
65℃水浴 2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇 （24∶1），
12,000r/min 离心 10 min，取上清→加入 0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃
离心 20min 收集 DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于 100 μl p H 8.0 TE
缓冲液，备用。
1.3.2.2 SDS 法 按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀，重悬于500μl SDS 提取缓冲液，轻
轻混匀→向管中加入 50μL 20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组 DNA 断裂
→65℃保温 2h，每隔 20min 轻轻摇匀 1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇（24∶
1），混匀后 12000r/min 离心 10min，取上清 → 加 入 2 倍 体 积 的 无 水 乙 醇 ， 静
止 于 室 温 下 2h → 以12000r/min 离心 20min，收集 DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→
干燥后将沉淀溶于 100μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。
2.2 SDS法［3］称取1g土样分别加入4个5mL无菌离心管 中 ，依 次 加 入 1.35mLDNA 提
取 液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L 磷酸盐，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，
p H=8），4和5号离心管加入10μL蛋白酶K，6、7 号离心管加入 20μg/mL 的溶菌酶和 10
μL 蛋白酶K，在 恒 温 震 动 培 养 箱 中 以 225r/min 震 荡 2h，再 加 入0.15mL 的
20%SDS，60℃水浴 2h，每隔 15min 轻轻颠倒下，水浴结束后室温 12000r/min 离心 15min，
用移液枪收集上清于 1.5mL 离心管中，在沉淀中再加入 0.45mL 的DNA 提取液和 50μ
L20%的 SDS，在振荡器上涡旋 15s，60℃水浴15min，室温下12000r/min离心10min后，
用移液枪取上清液移到1.5mL离心管中，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混匀，
以12000r/min离心15min后，移到离心管中，加入 0.6 倍体积的异丙醇，混匀后室温沉淀
过夜，4℃下12000r/min离心20min后，用70%的乙醇清洗2~3次，待晾干后加入30μL的
TE溶解，-20℃保存。
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）,先加100ml酚，再加96ml氯仿，最后加4ml异戊醇，摇匀
即可（吸取下层液体）
实验概要
从土壤微生物中提取总DNA并纯化，高质量的DNA可用于后续文库构建。
主要试剂
TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)
PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na
2
HPO
4
, 2 mmol/L KH
2
PO
4
, pH 7.4)
DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na
3
PO
4
, 1.5 M NaCl, 1%CTAB,
pH 8.0)
蛋白酶K(25 mg/mL)
溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)
20% SDS
2024年4月6日发(作者：风冰薇)
1 试验材料
吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过 10 目筛，去
除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。
1 .2 仪器设备及药品
电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、
电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。
TENP 缓 冲 液 （50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、
CTAB 提 取 缓 冲 液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na
Cl，1%CTAB，pH 8.0）、
SDS 提取缓冲液 （100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加 β
-巯基乙醇至 10 mmol/L）、
异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓
冲液、DNAMarker 等。
主要试剂有十二烷基硫酸钠 （ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸 （ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴
化铵 （ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。
1 .3 试验方法
1.3.1 土壤微生物的洗涤 取土壤样品 2g，置于 50m L 灭菌的离心管中；加入 10m L TENP
缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心 5min，弃上清，重复洗涤多
次至上清基本无色；最后将沉淀收集至 1.5ml 离心管中。
1.3.2 DNA 的提取
1.3.2.1 CTAB 法 按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→
65℃水浴 2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇 （24∶1），
12,000r/min 离心 10 min，取上清→加入 0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃
离心 20min 收集 DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于 100 μl p H 8.0 TE
缓冲液，备用。
1.3.2.2 SDS 法 按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀，重悬于500μl SDS 提取缓冲液，轻
轻混匀→向管中加入 50μL 20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组 DNA 断裂
→65℃保温 2h，每隔 20min 轻轻摇匀 1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇（24∶
1），混匀后 12000r/min 离心 10min，取上清 → 加 入 2 倍 体 积 的 无 水 乙 醇 ， 静
止 于 室 温 下 2h → 以12000r/min 离心 20min，收集 DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→
干燥后将沉淀溶于 100μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。
2.2 SDS法［3］称取1g土样分别加入4个5mL无菌离心管 中 ，依 次 加 入 1.35mLDNA 提
取 液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L 磷酸盐，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，
p H=8），4和5号离心管加入10μL蛋白酶K，6、7 号离心管加入 20μg/mL 的溶菌酶和 10
μL 蛋白酶K，在 恒 温 震 动 培 养 箱 中 以 225r/min 震 荡 2h，再 加 入0.15mL 的
20%SDS，60℃水浴 2h，每隔 15min 轻轻颠倒下，水浴结束后室温 12000r/min 离心 15min，
用移液枪收集上清于 1.5mL 离心管中，在沉淀中再加入 0.45mL 的DNA 提取液和 50μ
L20%的 SDS，在振荡器上涡旋 15s，60℃水浴15min，室温下12000r/min离心10min后，
用移液枪取上清液移到1.5mL离心管中，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混匀，
以12000r/min离心15min后，移到离心管中，加入 0.6 倍体积的异丙醇，混匀后室温沉淀
过夜，4℃下12000r/min离心20min后，用70%的乙醇清洗2~3次，待晾干后加入30μL的
TE溶解，-20℃保存。
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）,先加100ml酚，再加96ml氯仿，最后加4ml异戊醇，摇匀
即可（吸取下层液体）
实验概要
从土壤微生物中提取总DNA并纯化，高质量的DNA可用于后续文库构建。
主要试剂
TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)
PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na
2
HPO
4
, 2 mmol/L KH
2
PO
4
, pH 7.4)
DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na
3
PO
4
, 1.5 M NaCl, 1%CTAB,
pH 8.0)
蛋白酶K(25 mg/mL)
溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)
20% SDS