2024年4月9日发(作者：后霞雰)
一 叶绿素的测定-丙酮乙醇提取比色法
参照张宪政（1986）的方法:
1、先配制乙醇：丙酮=1：1的混合溶液（80%:80%）装入棕色瓶中保存。
1
2、取叶片0.5-1g剪碎，放入50 ml的培养瓶中，再加入20 ml的配制好的上述混合液，盖上瓶盖，置于
10℃冷库避光存放36 h(直到叶片泛白)，其间摇晃2-3次，使叶绿素充分溶解在混合液中。
3、避光保存36 h后，过滤混合溶液，以提取液作为对照，在紫外分光光度计下分别测定652 nm、663 nm
和645 nm处的吸光值。
4、计算公式
叶绿素a的含量=（12.7*OD
663
-2.69*OD
645
）/50+
（22.9*OD
663
-4.68*OD
645
）/50
叶绿素b的含量=（22.9*OD
663
-4.68*OD
645
）/50
总叶绿素的含量=（20.2* OD
645
+8.02* OD
663
）*V/1000*W
或 总叶绿素的含量=(
A
652
/34.5)*V/1000*W (叶绿素a和叶绿素b在652nm下有相同的吸光系数，为34.5)
其中V为提取液体积，W为叶片重量，叶绿素含量单位为mg/g(FW).
二、维生素C含量的测定
李合生，2000年，比色法：常规测定抗坏血酸的方法是采用2，6—二氯酚靛酚滴定法，但因某些叶片
中花青素量较高，当用酸提取时呈红色，因而无法滴定。本实验采用二甲苯萃取比色法，测不受花青素的
干扰。
1、原理：向一定量提取液中加入过量的2，6—二氯酚靛酚染料溶液与维生素C作用后，多余染料用二甲
苯萃取比色。待测液中抗坏血酸的含量与二甲苯萃取的颜色呈线性负相关，即待测液中抗坏血酸含量越多，
未被还愿的染料就越少，二甲苯萃取的颜色也就越浅。由于水溶性的花青素不溶于二甲苯，因而不影响测
定结果。
2、试剂 （按照定容100ml计算）
(1) 1%草酸，称取1.4g；
(2) 2%草酸, 称取2.8g；
(3) 30%硫酸锌, 称取53.4g；
(4) 15%亚铁氰化钾, 称取17.2g；
(5) 染料溶液：称取100mg2，6—二氯酚靛酚和82mg碳酸氢钠溶于约60ml热水中，过滤定容至100ml容
量瓶中，倒入棕色试剂瓶存放于冰箱内。使用时稀释4倍，此溶液每毫升约相当于0.1mg的维生素C。
(6) 抗坏血酸标准溶液：精确称取100mg分析纯抗坏血酸，溶于1%草酸，定容至100ml，再从中吸取5ml，
用1%草酸再稀释至100ml, 稀释后每毫升含抗坏血酸0.05mg（标准溶液在使用前临时配置）
(7) 二甲苯,分析纯（本法使用过的二甲苯可用20%NaOH中和后，蒸馏回收）。
3、实验步骤
(1) 标准曲线
去具塞大试管6个，分别吸取抗坏血酸标准溶液0ml、1ml、2ml、2.5ml、3ml、4ml，用1%草酸补充至
4ml，各管中抗坏血酸含量相应为0mg、0.05mg、0.10mg、0.125mg、0.15mg、0.20mg。各管中加入染料溶
液2ml，随即加入二甲苯5ml, 迅速摇动约0.5min, 静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液轻轻
2
倒入比色杯，在500nm波长下测定吸光度。以二甲苯作空白调零，求得标准系列抗坏血酸毫克数与相应的
吸光度值的回归方程。
(2) 样品提取
取新鲜蔬菜洗净，擦干，在玻板上用不锈钢刀切碎混匀。称取2g样品放置研钵中，加入3ml2%草酸研
钵至匀浆，然后将匀浆倒置100ml容量瓶中，残渣用1%草酸冲洗，洗液一并倒置容量瓶中，加入1ml30%
硫酸锌，摇动容量瓶，再加入1ml15%亚铁氯化钾，以除去脂溶性色素，再用1%草酸定容至刻度，摇匀后过
滤到干净小烧杯中。
（3）测定
取上述提取液4ml(若抗坏血酸含量高，可适当减少取量，不足4ml的可用1%草酸补足至4ml)至具塞
大试管中，依次加入染料2ml、二甲苯5ml，按照标准曲线的方法测定吸光度。
（4）计算
根据测定液的吸光度值，按回归方程计算出抗坏血酸的毫克数，然后按下式计算样品中的抗坏血酸的
含量，以每百克鲜样含抗坏血酸毫克数（mg/g）表示。
每克鲜样的抗坏血酸含量=X*Vt/(W*Vm)（mg/g）
式中；X为4ml提取液中含抗坏血酸的毫克数；Vt为提取液总体积ml；W为样品鲜重g；Vm为测定用体积
量ml。
三、蛋白质的测定—考马斯亮蓝法
1、 称取10 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 100 μg／ml的原液。称取100 mg考马斯
亮蓝G－250，溶于50 ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100 ml，最后用蒸馏水定容到 1000 ml。
标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
操作项目
标准蛋白质溶液(ml)
蒸馏水(ml)
G-250试剂(ml)
蛋白质含量（μg）
管 号
1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
各5
0 20 40 60 80 100
盖上塞子，摇匀。放置2 min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量
（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2、 称取样品0.5~1.0 g，放入研钵中，加入5 ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000 r／min，10 min），
将上清液倒入10 ml容量瓶，再向残渣中加入2 ml蒸馏水，悬浮后再离心10 min，合并上清液，定客至
刻度。另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5 ml考马斯亮蓝G－250
试剂，充分混合，放置2 min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）
×测定时取用提取液的体积（ml））
四、 可溶性糖的测定—蒽酮比色法
1、 原理:糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可
与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖
的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测
所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖
2024年4月9日发(作者：后霞雰)
一 叶绿素的测定-丙酮乙醇提取比色法
参照张宪政（1986）的方法:
1、先配制乙醇：丙酮=1：1的混合溶液（80%:80%）装入棕色瓶中保存。
1
2、取叶片0.5-1g剪碎，放入50 ml的培养瓶中，再加入20 ml的配制好的上述混合液，盖上瓶盖，置于
10℃冷库避光存放36 h(直到叶片泛白)，其间摇晃2-3次，使叶绿素充分溶解在混合液中。
3、避光保存36 h后，过滤混合溶液，以提取液作为对照，在紫外分光光度计下分别测定652 nm、663 nm
和645 nm处的吸光值。
4、计算公式
叶绿素a的含量=（12.7*OD
663
-2.69*OD
645
）/50+
（22.9*OD
663
-4.68*OD
645
）/50
叶绿素b的含量=（22.9*OD
663
-4.68*OD
645
）/50
总叶绿素的含量=（20.2* OD
645
+8.02* OD
663
）*V/1000*W
或 总叶绿素的含量=(
A
652
/34.5)*V/1000*W (叶绿素a和叶绿素b在652nm下有相同的吸光系数，为34.5)
其中V为提取液体积，W为叶片重量，叶绿素含量单位为mg/g(FW).
二、维生素C含量的测定
李合生，2000年，比色法：常规测定抗坏血酸的方法是采用2，6—二氯酚靛酚滴定法，但因某些叶片
中花青素量较高，当用酸提取时呈红色，因而无法滴定。本实验采用二甲苯萃取比色法，测不受花青素的
干扰。
1、原理：向一定量提取液中加入过量的2，6—二氯酚靛酚染料溶液与维生素C作用后，多余染料用二甲
苯萃取比色。待测液中抗坏血酸的含量与二甲苯萃取的颜色呈线性负相关，即待测液中抗坏血酸含量越多，
未被还愿的染料就越少，二甲苯萃取的颜色也就越浅。由于水溶性的花青素不溶于二甲苯，因而不影响测
定结果。
2、试剂 （按照定容100ml计算）
(1) 1%草酸，称取1.4g；
(2) 2%草酸, 称取2.8g；
(3) 30%硫酸锌, 称取53.4g；
(4) 15%亚铁氰化钾, 称取17.2g；
(5) 染料溶液：称取100mg2，6—二氯酚靛酚和82mg碳酸氢钠溶于约60ml热水中，过滤定容至100ml容
量瓶中，倒入棕色试剂瓶存放于冰箱内。使用时稀释4倍，此溶液每毫升约相当于0.1mg的维生素C。
(6) 抗坏血酸标准溶液：精确称取100mg分析纯抗坏血酸，溶于1%草酸，定容至100ml，再从中吸取5ml，
用1%草酸再稀释至100ml, 稀释后每毫升含抗坏血酸0.05mg（标准溶液在使用前临时配置）
(7) 二甲苯,分析纯（本法使用过的二甲苯可用20%NaOH中和后，蒸馏回收）。
3、实验步骤
(1) 标准曲线
去具塞大试管6个，分别吸取抗坏血酸标准溶液0ml、1ml、2ml、2.5ml、3ml、4ml，用1%草酸补充至
4ml，各管中抗坏血酸含量相应为0mg、0.05mg、0.10mg、0.125mg、0.15mg、0.20mg。各管中加入染料溶
液2ml，随即加入二甲苯5ml, 迅速摇动约0.5min, 静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液轻轻
2
倒入比色杯，在500nm波长下测定吸光度。以二甲苯作空白调零，求得标准系列抗坏血酸毫克数与相应的
吸光度值的回归方程。
(2) 样品提取
取新鲜蔬菜洗净，擦干，在玻板上用不锈钢刀切碎混匀。称取2g样品放置研钵中，加入3ml2%草酸研
钵至匀浆，然后将匀浆倒置100ml容量瓶中，残渣用1%草酸冲洗，洗液一并倒置容量瓶中，加入1ml30%
硫酸锌，摇动容量瓶，再加入1ml15%亚铁氯化钾，以除去脂溶性色素，再用1%草酸定容至刻度，摇匀后过
滤到干净小烧杯中。
（3）测定
取上述提取液4ml(若抗坏血酸含量高，可适当减少取量，不足4ml的可用1%草酸补足至4ml)至具塞
大试管中，依次加入染料2ml、二甲苯5ml，按照标准曲线的方法测定吸光度。
（4）计算
根据测定液的吸光度值，按回归方程计算出抗坏血酸的毫克数，然后按下式计算样品中的抗坏血酸的
含量，以每百克鲜样含抗坏血酸毫克数（mg/g）表示。
每克鲜样的抗坏血酸含量=X*Vt/(W*Vm)（mg/g）
式中；X为4ml提取液中含抗坏血酸的毫克数；Vt为提取液总体积ml；W为样品鲜重g；Vm为测定用体积
量ml。
三、蛋白质的测定—考马斯亮蓝法
1、 称取10 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 100 μg／ml的原液。称取100 mg考马斯
亮蓝G－250，溶于50 ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100 ml，最后用蒸馏水定容到 1000 ml。
标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
操作项目
标准蛋白质溶液(ml)
蒸馏水(ml)
G-250试剂(ml)
蛋白质含量（μg）
管 号
1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
各5
0 20 40 60 80 100
盖上塞子，摇匀。放置2 min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量
（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2、 称取样品0.5~1.0 g，放入研钵中，加入5 ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000 r／min，10 min），
将上清液倒入10 ml容量瓶，再向残渣中加入2 ml蒸馏水，悬浮后再离心10 min，合并上清液，定客至
刻度。另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5 ml考马斯亮蓝G－250
试剂，充分混合，放置2 min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）
×测定时取用提取液的体积（ml））
四、 可溶性糖的测定—蒽酮比色法
1、 原理:糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可
与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖
的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测
所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖