2024年4月21日发(作者：刚飞鸣)

红曲菌MpigE基因过表达质粒的构建

作者：郑学海 柳燕 朱锦懋 杨成龙 陈由强 陈建楠

来源：《福建农业科技》2020年第05期

摘要：以福建红曲菌MCL为出发菌株，以PSKH质粒为模板克隆PtrpC启动子及TrpC终

止子。通过重叠延伸PCR技术融合PtrpC启动子、MpigE（目的）基因、TrpC终止子，获得

PMT融合片段。为了验证融合片段PMT的正确性，进行琼脂糖凝胶电泳分析，在2100 bp左

右出现单一且清晰的条带。通过EcoR V和Spe I酶切PMT片段，插入带有潮霉素抗性的

PSKH质粒的EcoR V和Spe I位点，构建1个红曲菌过表达载体HPMT，大小为7 155 bp。通

过构建过表达载体，以期对红曲菌MCL进行改造，获得高产色素低产桔霉素的菌株。

關键词：红曲菌;MpigE基因;质粒;过表达;构建

中图分类号：TS261.3文献标志码：A文章编号：0253-2301（2020）05-0001-11

DOI： 10.13651/.2020.05.001

Abstract： By taking the MCL of Monascus in Fujian as the original strain， the PtrpC promoter

and TrpC terminator were cloned by using the PSKH plasmid as the template. The PMT fusion

fragments were obtained by fusing PtrpC promoter， MpigE target gene and TrpC terminator with the

overlap-extension PCR technology. In order to verify the correctness of the fusion fragment PMT，

the agarose gel electrophoresis analysis was carried out， and a single clear band appeared at about

2，100 bp. The fragment of PMT was digested by EcoR V and Spe I， and the EcoR V and Spe I

sites of the PSKH plasmid with hydthromycin resistance were inserted to construct an overexpression

vector HPMT of Monascus， with a size of 7 155 bp. By constructing the overexpression vector， the

MCL of Monascus was modified， thus to obtain the strain with high yield of pigment and low yield

of citrinin.

Key words： Monascus; MpigE gene; Plasmid; Overexpression; Construct

红曲霉是目前世界上唯一生产食用色素的微生物，广泛应用于制醋、制酒、酱油、饮料、

腐乳、香肠、肉制品、蜜饯等食品中[1-4]。但自从1995年法国Blance等[5]在红曲霉的发酵过

程中发现了桔霉素后，红曲产品的安全性问题引起人们的广泛关注。利用传统的诱变、控制发

酵条件等无法从根本上去除红曲发酵过程中的桔霉素，因此，人们逐渐将目光转向构建基因工

程菌这一途径[6]。

目前基因的过表达技术在米曲霉、酵母菌等其他真菌中有较多的应用，但在红曲菌中的应

用还相对较少。2005年秦丽娜[7]成功构建了酿酒酵母整合表达载体pUPGKAT（包括PGK强

启动子、酿酒酵母乙醇脱氢酶基因Ⅰ和CYC1终止子），并将其转入原始菌株YS2△adh2重

组菌株，结果表明构建的新菌株乙醇产量较出发菌株提高了8.84%。2009年王斌等[8]构建了

米曲霉的重组表达载体pNMA-RML，并转入米曲霉宿主菌niaD300，得到整合型的阳

性转化子ONL。由于红曲的次级代谢产物红曲色素、桔霉素在合成途径上有相关性，

具有共同的前体，如果对产红曲色素的相关基因进行过表达可能可以增强红曲产色素支路的代

谢力度而降低产桔霉素的代谢力度，从而获得高产色素而低产桔霉素的菌株，达到利用基因工

程进行分子育种的目的。目前已有研究表明pigR基因、MpigE基因均与红曲色素的合成具有

相关性[9-10]。

基因超表达技术作为一项重要的分子生物学技术，是将目的基因的全长序列与高活性的组

成型强启动子或组织特异性强启动子融合，从而构建功能型表达载体，通过转化获得该基因产

物大量积累的菌株[11-14]。在构建超表达载体时，为了增强外源基因表达及增加表达载体在宿

主内的稳定性需要慎重选择启动子及质粒。本研究所选用的启动子为PtrpC启动子，通过重叠

延伸PCR技术融合PtrpC启动子、MpigE（目的）基因、TrpC终止子，并将融合的片段插入

带有潮霉素抗性的PSKH质粒，构建一个红曲菌过表达载体。后期将再通过PEG介导原生质

体转化构建出基因工程菌，获取高产色素低产桔霉素的菌株，从根本上解决红曲产品的桔霉素

含量超标问题。

1材料与方法

1.1主要试剂材料

1.1.1菌种与质粒红曲霉MCL由实验室合作公司馈赠、DH5α大肠杆菌菌株由本实验室保

存、PSKH质粒（带有PtrpC启动子、TrpC终止子及Hygromycin B抗性基因）由华中农大馈

赠、pMD 19T 载体购自Takara（大连）有限公司。

1.1.2试验试剂Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、EcoR V限制性内切酶、Spe I限制性内切酶、

DNA Marker购自Takara（大连）有限公司;RNaseA、潮霉素购自Sigma公司;Fungal DNA Kit

购自Omega公司;胶回收试剂盒购自Promega公司;氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份

有限公司产品;PCR扩增引物均由Primer Premier 5软件设计完成后由生工生物工程（上海）股

份有限公司合成。

1.1.3主要培养基麦芽汁（MES）液体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g溶于100 mL蒸馏

水，pH自然，121℃灭菌15 min。麦芽汁（MES）固体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g，琼

脂2 g，溶于100 mL蒸馏水，pH自然，121℃灭菌15 min。MPPY培养基：4%葡萄糖，

0.3%NaNO3，0.2%酵母浸粉，0.05%KCl，pH 6.8，121℃灭菌15 min。LB液体培养基：肉汤

培养基2.5 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。LB固体培养

基：琼脂培养基3.4 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。

1.1.4主要仪器设备微波炉（GRANT）;洁净工作台（苏州市安泰空气技术有限公司）;数

显三用恒温水浴箱（上海比朗仪器有限公司）;全自动新型鼓风干燥箱

ZFD5090（上海智城分析仪器有限公司）;紫外可见分光光度计（上海美谱达）;PCR仪

（美国 Applied Biosystems）;梯度PCR仪（美国 Applied Biosystems）;连接仪（DRY BATH）;

凝胶成像系统（上海培清有限公司）。

1.2試验方法

1.2.1红曲菌孢子悬液的制备（1）将实验室斜面保存的红曲菌MCL转接至MES固体培养

基中，30℃划线培养3～4 d，待长出白色的单菌落。（2）挑取单菌落接种于MES液体培养基

中，30℃、160 r·min-1，振荡培养2 d。（3）吸取200 μL菌液涂布MES固体培养基，28℃静

置培养7～10 d。（4）待长出大量孢子后，用灭过菌的超纯水轻轻洗脱孢子，并用500目双层

尼龙布过滤菌丝体。（5）用血球记数板测定孢子悬液浓度。

1.2.2红曲菌基因组DNA的提取红曲菌总DNA的提取采用Fungal DNA Kit进行提取，具

体步骤如下：（1）按照2.3.2 培养红曲菌菌丝，用500目尼龙布过滤收集菌丝体。（2）灭菌

的无菌水洗涤3次，滤纸挤压干水分，将菌丝放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉

末状。（3）将粉末分装至2 mL离心管中（约1/3），立即加入600 μL Buffer FG1，震荡摇

匀。65℃水浴10 min（水域期间震荡2～3次）。（4）加入140 μL Buffer FG2，震荡摇匀，

12000 r·min-1、4℃、离心10 min。（5）小心吸取上清液至新的离心管中，加入0.7体积的异

丙醇，震荡摇匀（这个步骤将去除大部分的多糖分子，通过提高DNA黏合物的容量来增加吸

附柱的能力），12000 r·min-1、4℃、离心2 min。弃上清液，倒置离心管于滤纸上，1 min。

（6）加入65℃遇热的300 μL无菌去离子水，震荡摇匀，65℃水浴短时间，促进DNA 溶解，

加入4 μL RNase，加入150 μL Buffer FG3，加300 μL无水乙醇，震荡摇匀。（7）将所有试样

移至有柱子的离心管中（试剂盒自带），12000 r·min-1、4℃、离心1 min。（8）将吸附柱移

至新的离心管中，加入稀释过的DNA Wash Buffer 700 μL，12000 r·min-1、4℃、离心1 min，

弃收集管中的液体。（9）重复步骤11。（10）以最高转速进行空离2 min。（11）将柱子移

至1.5 mL的离心管中，加入65℃预热的无菌去离子水50 μL，室温放置2～3 min，12000

r·min-1、4℃、离心2 min。

1.2.3重叠延伸PCR引物设计通过查找GenBank中公布的红曲菌MpigE基因序列、PtrpC

启动子序列、TrpC终止子序列，利用重叠延伸PCR原理设计3对叠套引物用于PtrpC、

MpigE、TrpC这3个片段的扩增与融合。引物序列、酶切位点、产物长度见表1、图1。引物

由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.4MpigE基因片段、PtrpC启动子片段、TrpC终止子片段的扩增重叠延伸PCR需要进

行两轮PCR，第一轮通过普通PCR程序进行扩增，依次获得需要融合的目的片段。以红曲菌

基因组DNA为模板，用引物M1、M2扩增MpigE基因片段;以PSKH质粒为模板，用引物

P1、P2扩增PtrpC启动子片段，引物T1、T2扩增TrpC终止子片段。

1.2.5PtrpC启动子片段与MpigE基因片段的融合和PM片段与TrpC片段的融合以PtrpC启

动子片段与MpigE基因片段为模板，P1为上游引物，M2为下游引物，采用重叠延伸PCR的

方法进行两片段的融合PM片段;再将PM片段与TrpC片段的融合片段称之为PMT片段。

PMT片段再与pMD19T载体连接构成重组质粒PMT19，转化DH5α感受态细胞，送往上海生

工进行测序分析。

1.2.6红曲菌过表达载体的构建红曲菌过表达载体构建见图2。

1.2.6.1PMT19质粒的双酶切将PMT19质粒用EcoR V和Spe I两种限制性内切酶按照表2

酶切体系进行双酶切。

1.1.2试验试剂Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、EcoR V限制性内切酶、Spe I限制性内切酶、

DNA Marker购自Takara（大连）有限公司;RNaseA、潮霉素购自Sigma公司;Fungal DNA Kit

购自Omega公司;胶回收试剂盒购自Promega公司;氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份

有限公司产品;PCR扩增引物均由Primer Premier 5软件设计完成后由生工生物工程（上海）股

份有限公司合成。

1.1.3主要培养基麦芽汁（MES）液体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g溶于100 mL蒸馏

水，pH自然，121℃灭菌15 min。麦芽汁（MES）固体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g，琼

脂2 g，溶于100 mL蒸馏水，pH自然，121℃灭菌15 min。MPPY培养基：4%葡萄糖，

0.3%NaNO3，0.2%酵母浸粉，0.05%KCl，pH 6.8，121℃灭菌15 min。LB液体培养基：肉汤

培养基2.5 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。LB固体培养

基：琼脂培养基3.4 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。

1.1.4主要仪器设备微波炉（GRANT）;洁净工作台（苏州市安泰空气技术有限公司）;数

显三用恒温水浴箱（上海比朗仪器有限公司）;全自动新型鼓风干燥箱

ZFD5090（上海智城分析仪器有限公司）;紫外可见分光光度计（上海美谱达）;PCR仪

（美国 Applied Biosystems）;梯度PCR仪（美国 Applied Biosystems）;连接仪（DRY BATH）;

凝胶成像系统（上海培清有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1红曲菌孢子悬液的制备（1）将实验室斜面保存的红曲菌MCL转接至MES固体培养

基中，30℃划线培养3～4 d，待长出白色的单菌落。（2）挑取单菌落接种于MES液体培养基

中，30℃、160 r·min-1，振荡培养2 d。（3）吸取200 μL菌液涂布MES固体培养基，28℃静

置培养7～10 d。（4）待长出大量孢子后，用灭过菌的超纯水轻轻洗脱孢子，并用500目双层

尼龙布过滤菌丝体。（5）用血球记数板测定孢子悬液浓度。

1.2.2红曲菌基因组DNA的提取红曲菌总DNA的提取采用Fungal DNA Kit进行提取，具

体步骤如下：（1）按照2.3.2 培养红曲菌菌丝，用500目尼龙布过滤收集菌丝体。（2）灭菌

的无菌水洗涤3次，滤纸挤压干水分，将菌丝放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉

末状。（3）将粉末分装至2 mL离心管中（约1/3），立即加入600 μL Buffer FG1，震荡摇

匀。65℃水浴10 min（水域期间震荡2～3次）。（4）加入140 μL Buffer FG2，震荡摇匀，

12000 r·min-1、4℃、离心10 min。（5）小心吸取上清液至新的离心管中，加入0.7体积的异

丙醇，震荡摇匀（这个步骤将去除大部分的多糖分子，通过提高DNA黏合物的容量来增加吸

附柱的能力），12000 r·min-1、4℃、离心2 min。弃上清液，倒置离心管于滤纸上，1 min。

（6）加入65℃遇热的300 μL无菌去离子水，震荡摇匀，65℃水浴短时间，促进DNA 溶解，

加入4 μL RNase，加入150 μL Buffer FG3，加300 μL无水乙醇，震荡摇匀。（7）将所有试样

移至有柱子的离心管中（试剂盒自带），12000 r·min-1、4℃、离心1 min。（8）将吸附柱移

至新的离心管中，加入稀释过的DNA Wash Buffer 700 μL，12000 r·min-1、4℃、离心1 min，

弃收集管中的液体。（9）重复步骤11。（10）以最高转速进行空离2 min。（11）将柱子移

至1.5 mL的离心管中，加入65℃预热的无菌去离子水50 μL，室温放置2～3 min，12000

r·min-1、4℃、離心2 min。

1.2.3重叠延伸PCR引物设计通过查找GenBank中公布的红曲菌MpigE基因序列、PtrpC

启动子序列、TrpC终止子序列，利用重叠延伸PCR原理设计3对叠套引物用于PtrpC、

MpigE、TrpC这3个片段的扩增与融合。引物序列、酶切位点、产物长度见表1、图1。引物

由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.4MpigE基因片段、PtrpC启动子片段、TrpC终止子片段的扩增重叠延伸PCR需要进

行两轮PCR，第一轮通过普通PCR程序进行扩增，依次获得需要融合的目的片段。以红曲菌

基因组DNA为模板，用引物M1、M2扩增MpigE基因片段;以PSKH质粒为模板，用引物

P1、P2扩增PtrpC启动子片段，引物T1、T2扩增TrpC终止子片段。

1.2.5PtrpC启动子片段与MpigE基因片段的融合和PM片段与TrpC片段的融合以PtrpC启

动子片段与MpigE基因片段为模板，P1为上游引物，M2为下游引物，采用重叠延伸PCR的

方法进行两片段的融合PM片段;再将PM片段与TrpC片段的融合片段称之为PMT片段。

PMT片段再与pMD19T载体连接构成重组质粒PMT19，转化DH5α感受态细胞，送往上海生

工进行测序分析。

1.2.6红曲菌过表达载体的构建红曲菌过表达载体构建见图2。

1.2.6.1PMT19质粒的双酶切将PMT19质粒用EcoR V和Spe I两种限制性内切酶按照表2

酶切体系进行双酶切。

1.1.2试验试剂Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、EcoR V限制性内切酶、Spe I限制性内切酶、

DNA Marker购自Takara（大连）有限公司;RNaseA、潮霉素购自Sigma公司;Fungal DNA Kit

购自Omega公司;胶回收试剂盒购自Promega公司;氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份

有限公司产品;PCR扩增引物均由Primer Premier 5软件设计完成后由生工生物工程（上海）股

份有限公司合成。

1.1.3主要培養基麦芽汁（MES）液体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g溶于100 mL蒸馏

水，pH自然，121℃灭菌15 min。麦芽汁（MES）固体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g，琼

脂2 g，溶于100 mL蒸馏水，pH自然，121℃灭菌15 min。MPPY培养基：4%葡萄糖，

0.3%NaNO3，0.2%酵母浸粉，0.05%KCl，pH 6.8，121℃灭菌15 min。LB液体培养基：肉汤

培养基2.5 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。LB固体培养

基：琼脂培养基3.4 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。

1.1.4主要仪器设备微波炉（GRANT）;洁净工作台（苏州市安泰空气技术有限公司）;数

显三用恒温水浴箱（上海比朗仪器有限公司）;全自动新型鼓风干燥箱

ZFD5090（上海智城分析仪器有限公司）;紫外可见分光光度计（上海美谱达）;PCR仪

（美国 Applied Biosystems）;梯度PCR仪（美国 Applied Biosystems）;连接仪（DRY BATH）;

凝胶成像系统（上海培清有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1红曲菌孢子悬液的制备（1）将实验室斜面保存的红曲菌MCL转接至MES固体培养

基中，30℃划线培养3～4 d，待长出白色的单菌落。（2）挑取单菌落接种于MES液体培养基

中，30℃、160 r·min-1，振荡培养2 d。（3）吸取200 μL菌液涂布MES固体培养基，28℃静

置培养7～10 d。（4）待长出大量孢子后，用灭过菌的超纯水轻轻洗脱孢子，并用500目双层

尼龙布过滤菌丝体。（5）用血球记数板测定孢子悬液浓度。

1.2.2红曲菌基因组DNA的提取红曲菌总DNA的提取采用Fungal DNA Kit进行提取，具

体步骤如下：（1）按照2.3.2 培养红曲菌菌丝，用500目尼龙布过滤收集菌丝体。（2）灭菌

的无菌水洗涤3次，滤纸挤压干水分，将菌丝放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉

末状。（3）将粉末分装至2 mL离心管中（约1/3），立即加入600 μL Buffer FG1，震荡摇

匀。65℃水浴10 min（水域期间震荡2～3次）。（4）加入140 μL Buffer FG2，震荡摇匀，

12000 r·min-1、4℃、离心10 min。（5）小心吸取上清液至新的离心管中，加入0.7体积的异

丙醇，震荡摇匀（这个步骤将去除大部分的多糖分子，通过提高DNA黏合物的容量来增加吸

附柱的能力），12000 r·min-1、4℃、离心2 min。弃上清液，倒置离心管于滤纸上，1 min。

（6）加入65℃遇热的300 μL无菌去离子水，震荡摇匀，65℃水浴短时间，促进DNA 溶解，

加入4 μL RNase，加入150 μL Buffer FG3，加300 μL无水乙醇，震荡摇匀。（7）将所有试样

移至有柱子的离心管中（试剂盒自带），12000 r·min-1、4℃、离心1 min。（8）将吸附柱移

至新的离心管中，加入稀释过的DNA Wash Buffer 700 μL，12000 r·min-1、4℃、离心1 min，

弃收集管中的液体。（9）重复步骤11。（10）以最高转速进行空离2 min。（11）将柱子移

至1.5 mL的离心管中，加入65℃预热的无菌去离子水50 μL，室温放置2～3 min，12000

r·min-1、4℃、离心2 min。

1.2.3重叠延伸PCR引物设计通过查找GenBank中公布的红曲菌MpigE基因序列、PtrpC

启动子序列、TrpC终止子序列，利用重叠延伸PCR原理设计3对叠套引物用于PtrpC、

MpigE、TrpC这3个片段的扩增与融合。引物序列、酶切位点、产物长度见表1、图1。引物

由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.4MpigE基因片段、PtrpC启动子片段、TrpC终止子片段的扩增重叠延伸PCR需要进

行两轮PCR，第一轮通过普通PCR程序进行扩增，依次获得需要融合的目的片段。以红曲菌

基因组DNA为模板，用引物M1、M2扩增MpigE基因片段;以PSKH质粒为模板，用引物

P1、P2扩增PtrpC启动子片段，引物T1、T2扩增TrpC终止子片段。

1.2.5PtrpC启动子片段与MpigE基因片段的融合和PM片段与TrpC片段的融合以PtrpC启

动子片段与MpigE基因片段为模板，P1为上游引物，M2为下游引物，采用重叠延伸PCR的

方法进行两片段的融合PM片段;再将PM片段与TrpC片段的融合片段称之为PMT片段。

PMT片段再与pMD19T载体连接构成重组质粒PMT19，转化DH5α感受态细胞，送往上海生

工进行测序分析。

1.2.6红曲菌过表达载体的构建红曲菌过表达载体构建见图2。

1.2.6.1PMT19质粒的双酶切将PMT19质粒用EcoR V和Spe I两种限制性内切酶按照表2

酶切体系进行双酶切。

2024年4月21日发(作者：刚飞鸣)

红曲菌MpigE基因过表达质粒的构建

作者：郑学海 柳燕 朱锦懋 杨成龙 陈由强 陈建楠

来源：《福建农业科技》2020年第05期

摘要：以福建红曲菌MCL为出发菌株，以PSKH质粒为模板克隆PtrpC启动子及TrpC终

止子。通过重叠延伸PCR技术融合PtrpC启动子、MpigE（目的）基因、TrpC终止子，获得

PMT融合片段。为了验证融合片段PMT的正确性，进行琼脂糖凝胶电泳分析，在2100 bp左

右出现单一且清晰的条带。通过EcoR V和Spe I酶切PMT片段，插入带有潮霉素抗性的

PSKH质粒的EcoR V和Spe I位点，构建1个红曲菌过表达载体HPMT，大小为7 155 bp。通

过构建过表达载体，以期对红曲菌MCL进行改造，获得高产色素低产桔霉素的菌株。

關键词：红曲菌;MpigE基因;质粒;过表达;构建

中图分类号：TS261.3文献标志码：A文章编号：0253-2301（2020）05-0001-11

DOI： 10.13651/.2020.05.001

Abstract： By taking the MCL of Monascus in Fujian as the original strain， the PtrpC promoter

and TrpC terminator were cloned by using the PSKH plasmid as the template. The PMT fusion

fragments were obtained by fusing PtrpC promoter， MpigE target gene and TrpC terminator with the

overlap-extension PCR technology. In order to verify the correctness of the fusion fragment PMT，

the agarose gel electrophoresis analysis was carried out， and a single clear band appeared at about

2，100 bp. The fragment of PMT was digested by EcoR V and Spe I， and the EcoR V and Spe I

sites of the PSKH plasmid with hydthromycin resistance were inserted to construct an overexpression

vector HPMT of Monascus， with a size of 7 155 bp. By constructing the overexpression vector， the

MCL of Monascus was modified， thus to obtain the strain with high yield of pigment and low yield

of citrinin.

Key words： Monascus; MpigE gene; Plasmid; Overexpression; Construct

红曲霉是目前世界上唯一生产食用色素的微生物，广泛应用于制醋、制酒、酱油、饮料、

腐乳、香肠、肉制品、蜜饯等食品中[1-4]。但自从1995年法国Blance等[5]在红曲霉的发酵过

程中发现了桔霉素后，红曲产品的安全性问题引起人们的广泛关注。利用传统的诱变、控制发

酵条件等无法从根本上去除红曲发酵过程中的桔霉素，因此，人们逐渐将目光转向构建基因工

程菌这一途径[6]。

目前基因的过表达技术在米曲霉、酵母菌等其他真菌中有较多的应用，但在红曲菌中的应

用还相对较少。2005年秦丽娜[7]成功构建了酿酒酵母整合表达载体pUPGKAT（包括PGK强

启动子、酿酒酵母乙醇脱氢酶基因Ⅰ和CYC1终止子），并将其转入原始菌株YS2△adh2重

组菌株，结果表明构建的新菌株乙醇产量较出发菌株提高了8.84%。2009年王斌等[8]构建了

米曲霉的重组表达载体pNMA-RML，并转入米曲霉宿主菌niaD300，得到整合型的阳

性转化子ONL。由于红曲的次级代谢产物红曲色素、桔霉素在合成途径上有相关性，

具有共同的前体，如果对产红曲色素的相关基因进行过表达可能可以增强红曲产色素支路的代

谢力度而降低产桔霉素的代谢力度，从而获得高产色素而低产桔霉素的菌株，达到利用基因工

程进行分子育种的目的。目前已有研究表明pigR基因、MpigE基因均与红曲色素的合成具有

相关性[9-10]。

基因超表达技术作为一项重要的分子生物学技术，是将目的基因的全长序列与高活性的组

成型强启动子或组织特异性强启动子融合，从而构建功能型表达载体，通过转化获得该基因产

物大量积累的菌株[11-14]。在构建超表达载体时，为了增强外源基因表达及增加表达载体在宿

主内的稳定性需要慎重选择启动子及质粒。本研究所选用的启动子为PtrpC启动子，通过重叠

延伸PCR技术融合PtrpC启动子、MpigE（目的）基因、TrpC终止子，并将融合的片段插入

带有潮霉素抗性的PSKH质粒，构建一个红曲菌过表达载体。后期将再通过PEG介导原生质

体转化构建出基因工程菌，获取高产色素低产桔霉素的菌株，从根本上解决红曲产品的桔霉素

含量超标问题。

1材料与方法

1.1主要试剂材料

1.1.1菌种与质粒红曲霉MCL由实验室合作公司馈赠、DH5α大肠杆菌菌株由本实验室保

存、PSKH质粒（带有PtrpC启动子、TrpC终止子及Hygromycin B抗性基因）由华中农大馈

赠、pMD 19T 载体购自Takara（大连）有限公司。

1.1.2试验试剂Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、EcoR V限制性内切酶、Spe I限制性内切酶、

DNA Marker购自Takara（大连）有限公司;RNaseA、潮霉素购自Sigma公司;Fungal DNA Kit

购自Omega公司;胶回收试剂盒购自Promega公司;氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份

有限公司产品;PCR扩增引物均由Primer Premier 5软件设计完成后由生工生物工程（上海）股

份有限公司合成。

1.1.3主要培养基麦芽汁（MES）液体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g溶于100 mL蒸馏

水，pH自然，121℃灭菌15 min。麦芽汁（MES）固体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g，琼

脂2 g，溶于100 mL蒸馏水，pH自然，121℃灭菌15 min。MPPY培养基：4%葡萄糖，

0.3%NaNO3，0.2%酵母浸粉，0.05%KCl，pH 6.8，121℃灭菌15 min。LB液体培养基：肉汤

培养基2.5 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。LB固体培养

基：琼脂培养基3.4 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。

1.1.4主要仪器设备微波炉（GRANT）;洁净工作台（苏州市安泰空气技术有限公司）;数

显三用恒温水浴箱（上海比朗仪器有限公司）;全自动新型鼓风干燥箱

ZFD5090（上海智城分析仪器有限公司）;紫外可见分光光度计（上海美谱达）;PCR仪

（美国 Applied Biosystems）;梯度PCR仪（美国 Applied Biosystems）;连接仪（DRY BATH）;

凝胶成像系统（上海培清有限公司）。

1.2試验方法

1.2.1红曲菌孢子悬液的制备（1）将实验室斜面保存的红曲菌MCL转接至MES固体培养

基中，30℃划线培养3～4 d，待长出白色的单菌落。（2）挑取单菌落接种于MES液体培养基

中，30℃、160 r·min-1，振荡培养2 d。（3）吸取200 μL菌液涂布MES固体培养基，28℃静

置培养7～10 d。（4）待长出大量孢子后，用灭过菌的超纯水轻轻洗脱孢子，并用500目双层

尼龙布过滤菌丝体。（5）用血球记数板测定孢子悬液浓度。

1.2.2红曲菌基因组DNA的提取红曲菌总DNA的提取采用Fungal DNA Kit进行提取，具

体步骤如下：（1）按照2.3.2 培养红曲菌菌丝，用500目尼龙布过滤收集菌丝体。（2）灭菌

的无菌水洗涤3次，滤纸挤压干水分，将菌丝放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉

末状。（3）将粉末分装至2 mL离心管中（约1/3），立即加入600 μL Buffer FG1，震荡摇

匀。65℃水浴10 min（水域期间震荡2～3次）。（4）加入140 μL Buffer FG2，震荡摇匀，

12000 r·min-1、4℃、离心10 min。（5）小心吸取上清液至新的离心管中，加入0.7体积的异

丙醇，震荡摇匀（这个步骤将去除大部分的多糖分子，通过提高DNA黏合物的容量来增加吸

附柱的能力），12000 r·min-1、4℃、离心2 min。弃上清液，倒置离心管于滤纸上，1 min。

（6）加入65℃遇热的300 μL无菌去离子水，震荡摇匀，65℃水浴短时间，促进DNA 溶解，

加入4 μL RNase，加入150 μL Buffer FG3，加300 μL无水乙醇，震荡摇匀。（7）将所有试样

移至有柱子的离心管中（试剂盒自带），12000 r·min-1、4℃、离心1 min。（8）将吸附柱移

至新的离心管中，加入稀释过的DNA Wash Buffer 700 μL，12000 r·min-1、4℃、离心1 min，

弃收集管中的液体。（9）重复步骤11。（10）以最高转速进行空离2 min。（11）将柱子移

至1.5 mL的离心管中，加入65℃预热的无菌去离子水50 μL，室温放置2～3 min，12000

r·min-1、4℃、离心2 min。

1.2.3重叠延伸PCR引物设计通过查找GenBank中公布的红曲菌MpigE基因序列、PtrpC

启动子序列、TrpC终止子序列，利用重叠延伸PCR原理设计3对叠套引物用于PtrpC、

MpigE、TrpC这3个片段的扩增与融合。引物序列、酶切位点、产物长度见表1、图1。引物

由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.4MpigE基因片段、PtrpC启动子片段、TrpC终止子片段的扩增重叠延伸PCR需要进

行两轮PCR，第一轮通过普通PCR程序进行扩增，依次获得需要融合的目的片段。以红曲菌

基因组DNA为模板，用引物M1、M2扩增MpigE基因片段;以PSKH质粒为模板，用引物

P1、P2扩增PtrpC启动子片段，引物T1、T2扩增TrpC终止子片段。

1.2.5PtrpC启动子片段与MpigE基因片段的融合和PM片段与TrpC片段的融合以PtrpC启

动子片段与MpigE基因片段为模板，P1为上游引物，M2为下游引物，采用重叠延伸PCR的

方法进行两片段的融合PM片段;再将PM片段与TrpC片段的融合片段称之为PMT片段。

PMT片段再与pMD19T载体连接构成重组质粒PMT19，转化DH5α感受态细胞，送往上海生

工进行测序分析。

1.2.6红曲菌过表达载体的构建红曲菌过表达载体构建见图2。

1.2.6.1PMT19质粒的双酶切将PMT19质粒用EcoR V和Spe I两种限制性内切酶按照表2

酶切体系进行双酶切。

1.1.2试验试剂Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、EcoR V限制性内切酶、Spe I限制性内切酶、

DNA Marker购自Takara（大连）有限公司;RNaseA、潮霉素购自Sigma公司;Fungal DNA Kit

购自Omega公司;胶回收试剂盒购自Promega公司;氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份

有限公司产品;PCR扩增引物均由Primer Premier 5软件设计完成后由生工生物工程（上海）股

份有限公司合成。

1.1.3主要培养基麦芽汁（MES）液体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g溶于100 mL蒸馏

水，pH自然，121℃灭菌15 min。麦芽汁（MES）固体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g，琼

脂2 g，溶于100 mL蒸馏水，pH自然，121℃灭菌15 min。MPPY培养基：4%葡萄糖，

0.3%NaNO3，0.2%酵母浸粉，0.05%KCl，pH 6.8，121℃灭菌15 min。LB液体培养基：肉汤

培养基2.5 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。LB固体培养

基：琼脂培养基3.4 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。

1.1.4主要仪器设备微波炉（GRANT）;洁净工作台（苏州市安泰空气技术有限公司）;数

显三用恒温水浴箱（上海比朗仪器有限公司）;全自动新型鼓风干燥箱

ZFD5090（上海智城分析仪器有限公司）;紫外可见分光光度计（上海美谱达）;PCR仪

（美国 Applied Biosystems）;梯度PCR仪（美国 Applied Biosystems）;连接仪（DRY BATH）;

凝胶成像系统（上海培清有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1红曲菌孢子悬液的制备（1）将实验室斜面保存的红曲菌MCL转接至MES固体培养

基中，30℃划线培养3～4 d，待长出白色的单菌落。（2）挑取单菌落接种于MES液体培养基

中，30℃、160 r·min-1，振荡培养2 d。（3）吸取200 μL菌液涂布MES固体培养基，28℃静

置培养7～10 d。（4）待长出大量孢子后，用灭过菌的超纯水轻轻洗脱孢子，并用500目双层

尼龙布过滤菌丝体。（5）用血球记数板测定孢子悬液浓度。

1.2.2红曲菌基因组DNA的提取红曲菌总DNA的提取采用Fungal DNA Kit进行提取，具

体步骤如下：（1）按照2.3.2 培养红曲菌菌丝，用500目尼龙布过滤收集菌丝体。（2）灭菌

的无菌水洗涤3次，滤纸挤压干水分，将菌丝放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉

末状。（3）将粉末分装至2 mL离心管中（约1/3），立即加入600 μL Buffer FG1，震荡摇

匀。65℃水浴10 min（水域期间震荡2～3次）。（4）加入140 μL Buffer FG2，震荡摇匀，

12000 r·min-1、4℃、离心10 min。（5）小心吸取上清液至新的离心管中，加入0.7体积的异

丙醇，震荡摇匀（这个步骤将去除大部分的多糖分子，通过提高DNA黏合物的容量来增加吸

附柱的能力），12000 r·min-1、4℃、离心2 min。弃上清液，倒置离心管于滤纸上，1 min。

（6）加入65℃遇热的300 μL无菌去离子水，震荡摇匀，65℃水浴短时间，促进DNA 溶解，

加入4 μL RNase，加入150 μL Buffer FG3，加300 μL无水乙醇，震荡摇匀。（7）将所有试样

移至有柱子的离心管中（试剂盒自带），12000 r·min-1、4℃、离心1 min。（8）将吸附柱移

至新的离心管中，加入稀释过的DNA Wash Buffer 700 μL，12000 r·min-1、4℃、离心1 min，

弃收集管中的液体。（9）重复步骤11。（10）以最高转速进行空离2 min。（11）将柱子移

至1.5 mL的离心管中，加入65℃预热的无菌去离子水50 μL，室温放置2～3 min，12000

r·min-1、4℃、離心2 min。

1.2.3重叠延伸PCR引物设计通过查找GenBank中公布的红曲菌MpigE基因序列、PtrpC

启动子序列、TrpC终止子序列，利用重叠延伸PCR原理设计3对叠套引物用于PtrpC、

MpigE、TrpC这3个片段的扩增与融合。引物序列、酶切位点、产物长度见表1、图1。引物

由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.4MpigE基因片段、PtrpC启动子片段、TrpC终止子片段的扩增重叠延伸PCR需要进

行两轮PCR，第一轮通过普通PCR程序进行扩增，依次获得需要融合的目的片段。以红曲菌

基因组DNA为模板，用引物M1、M2扩增MpigE基因片段;以PSKH质粒为模板，用引物

P1、P2扩增PtrpC启动子片段，引物T1、T2扩增TrpC终止子片段。

1.2.5PtrpC启动子片段与MpigE基因片段的融合和PM片段与TrpC片段的融合以PtrpC启

动子片段与MpigE基因片段为模板，P1为上游引物，M2为下游引物，采用重叠延伸PCR的

方法进行两片段的融合PM片段;再将PM片段与TrpC片段的融合片段称之为PMT片段。

PMT片段再与pMD19T载体连接构成重组质粒PMT19，转化DH5α感受态细胞，送往上海生

工进行测序分析。

1.2.6红曲菌过表达载体的构建红曲菌过表达载体构建见图2。

1.2.6.1PMT19质粒的双酶切将PMT19质粒用EcoR V和Spe I两种限制性内切酶按照表2

酶切体系进行双酶切。

1.1.2试验试剂Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、EcoR V限制性内切酶、Spe I限制性内切酶、

DNA Marker购自Takara（大连）有限公司;RNaseA、潮霉素购自Sigma公司;Fungal DNA Kit

购自Omega公司;胶回收试剂盒购自Promega公司;氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份

有限公司产品;PCR扩增引物均由Primer Premier 5软件设计完成后由生工生物工程（上海）股

份有限公司合成。

1.1.3主要培養基麦芽汁（MES）液体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g溶于100 mL蒸馏

水，pH自然，121℃灭菌15 min。麦芽汁（MES）固体培养基：准确称取麦芽膏粉13.1 g，琼

脂2 g，溶于100 mL蒸馏水，pH自然，121℃灭菌15 min。MPPY培养基：4%葡萄糖，

0.3%NaNO3，0.2%酵母浸粉，0.05%KCl，pH 6.8，121℃灭菌15 min。LB液体培养基：肉汤

培养基2.5 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。LB固体培养

基：琼脂培养基3.4 g溶于100 mL蒸馏水，pH自然，1×105 Pa、121℃、灭菌20 min。

1.1.4主要仪器设备微波炉（GRANT）;洁净工作台（苏州市安泰空气技术有限公司）;数

显三用恒温水浴箱（上海比朗仪器有限公司）;全自动新型鼓风干燥箱

ZFD5090（上海智城分析仪器有限公司）;紫外可见分光光度计（上海美谱达）;PCR仪

（美国 Applied Biosystems）;梯度PCR仪（美国 Applied Biosystems）;连接仪（DRY BATH）;

凝胶成像系统（上海培清有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1红曲菌孢子悬液的制备（1）将实验室斜面保存的红曲菌MCL转接至MES固体培养

基中，30℃划线培养3～4 d，待长出白色的单菌落。（2）挑取单菌落接种于MES液体培养基

中，30℃、160 r·min-1，振荡培养2 d。（3）吸取200 μL菌液涂布MES固体培养基，28℃静

置培养7～10 d。（4）待长出大量孢子后，用灭过菌的超纯水轻轻洗脱孢子，并用500目双层

尼龙布过滤菌丝体。（5）用血球记数板测定孢子悬液浓度。

1.2.2红曲菌基因组DNA的提取红曲菌总DNA的提取采用Fungal DNA Kit进行提取，具

体步骤如下：（1）按照2.3.2 培养红曲菌菌丝，用500目尼龙布过滤收集菌丝体。（2）灭菌

的无菌水洗涤3次，滤纸挤压干水分，将菌丝放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉

末状。（3）将粉末分装至2 mL离心管中（约1/3），立即加入600 μL Buffer FG1，震荡摇

匀。65℃水浴10 min（水域期间震荡2～3次）。（4）加入140 μL Buffer FG2，震荡摇匀，

12000 r·min-1、4℃、离心10 min。（5）小心吸取上清液至新的离心管中，加入0.7体积的异

丙醇，震荡摇匀（这个步骤将去除大部分的多糖分子，通过提高DNA黏合物的容量来增加吸

附柱的能力），12000 r·min-1、4℃、离心2 min。弃上清液，倒置离心管于滤纸上，1 min。

（6）加入65℃遇热的300 μL无菌去离子水，震荡摇匀，65℃水浴短时间，促进DNA 溶解，

加入4 μL RNase，加入150 μL Buffer FG3，加300 μL无水乙醇，震荡摇匀。（7）将所有试样

移至有柱子的离心管中（试剂盒自带），12000 r·min-1、4℃、离心1 min。（8）将吸附柱移

至新的离心管中，加入稀释过的DNA Wash Buffer 700 μL，12000 r·min-1、4℃、离心1 min，

弃收集管中的液体。（9）重复步骤11。（10）以最高转速进行空离2 min。（11）将柱子移

至1.5 mL的离心管中，加入65℃预热的无菌去离子水50 μL，室温放置2～3 min，12000

r·min-1、4℃、离心2 min。

1.2.3重叠延伸PCR引物设计通过查找GenBank中公布的红曲菌MpigE基因序列、PtrpC

启动子序列、TrpC终止子序列，利用重叠延伸PCR原理设计3对叠套引物用于PtrpC、

MpigE、TrpC这3个片段的扩增与融合。引物序列、酶切位点、产物长度见表1、图1。引物

由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.4MpigE基因片段、PtrpC启动子片段、TrpC终止子片段的扩增重叠延伸PCR需要进

行两轮PCR，第一轮通过普通PCR程序进行扩增，依次获得需要融合的目的片段。以红曲菌

基因组DNA为模板，用引物M1、M2扩增MpigE基因片段;以PSKH质粒为模板，用引物

P1、P2扩增PtrpC启动子片段，引物T1、T2扩增TrpC终止子片段。

1.2.5PtrpC启动子片段与MpigE基因片段的融合和PM片段与TrpC片段的融合以PtrpC启

动子片段与MpigE基因片段为模板，P1为上游引物，M2为下游引物，采用重叠延伸PCR的

方法进行两片段的融合PM片段;再将PM片段与TrpC片段的融合片段称之为PMT片段。

PMT片段再与pMD19T载体连接构成重组质粒PMT19，转化DH5α感受态细胞，送往上海生

工进行测序分析。

1.2.6红曲菌过表达载体的构建红曲菌过表达载体构建见图2。

1.2.6.1PMT19质粒的双酶切将PMT19质粒用EcoR V和Spe I两种限制性内切酶按照表2

酶切体系进行双酶切。