2024年4月25日发(作者：旷书云)
实验一 细菌的转导（演示实验）
一、基本知识与原理
转导是以噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。随着分子遗传
学的发展，转身已成为基因精细结构分析的常用方法之一。
根据噬菌体转导供体菌基因的差异，转导可分为普遍性转导和局限性转导。这里以局
限性转导为例说明转导的基本原理。局限性转导实验中常用的是大噬菌体，它能整合在大肠
杆菌染色体ＤＮＡ上的半乳糖基因（ｇａｌ）和生物素基因（ｂｉｂ）之间，因此，它能转
导半乳糖基因（一）又能转导生物素基因（ｂｉｏ）。
本实验选用大肠杆菌 Ｅ。ｏｈ Ｋ．２（Ａ）为供体菌（即大噬菌体的ＤＮＡ已整合
在大肠杆菌的ＤＮＡ上，我们称该大肠杆菌为溶源性大肠杆菌，’ｇａｔ””为带有半乳糖基
因）。由于在此供体菌中噬菌体与半乳糖基因（匆”）紧密连锁，因此，当此供体菌受紫外线
照射后会产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有半乳糖基因的转导噬菌
体。当这种转导噬菌体与受体菌 ＥＣＯ］ｉ Ｋ；。 Ｓ ｇａｌ－（此细菌不能利用半乳糖，
‘’表示此细菌半乳糖基因发生突变）混合接触时，带有一基因的转导噬菌体能以一定的频
率整合到受体首上，从而使不能利用半乳糖的 ｇａｌ一受体菌转变成了能利用半乳糖的 ｇ
ａｔ”细菌。整个过程可用图１２－’表示：ｌ
二、实验目的和要求
以局限性转导为例来说明转导的基本原理，进一步验证是遗传物质，并初步掌握转导
实验的基本方法。
三、实验器材
（1）实验材料：供体菌 受体菌
（２）实验试剂：肉汤液体培养基、肉汤固体培养基、ＺＥ 肉汤液体培养基、半固体
琼脂培养基、半乳糖ＥＭＢ培养基、灭菌生理盐水（或磷酸缓冲液）
Ｄ（３）实验设备：培养皿（９厘米）、三角烧瓶（５０毫升）、试管、离心管，离心机，
移液管，涂棒，水浴锅，离心机，紫外照射箱、温箱
四、实验方法与步骤
１ 噬菌体的诱导和裂解液的制备
（１）供体菌的活化与培养，取—环供体菌，接种于盛有ｓｍＬ肉汤液体培养基的三角
瓶中３７度培养１６ｈ后，吸取0.5毫升菌液，接种于盛有肉4.5毫升肉汤液体培养基的三
角瓶中，继续培养４～6小时。
（２）制备悬浮液将三角瓶中的菌液倒人离心管，以 ３ ５００ ｒｌｍｌｎ， 离心 １
０ ｍｉｎ。离心后，除去上清液，加 ４ｍＬ磷酸缓冲液，混匀沉淀，再以 ３ ｓｍｒ／ｍ
ｉｎ，离心 １０。ｉ。，这样反复洗三次，制备成悬浮液。
（３）诱导裂解：取悬浮液 ３。；Ｉ于培养皿中，经 ＵＶ处理（１５ Ｗ，距离 ４
０ｃｍ），诱导 １０－２０。
（４）避光培养； ＵＶ处理后，加人 ３ ｍＬ ＺＥ肉汤液体培养基，为了防止光
复活，立即置于３７ Ｔ避光培养 ２－３ ｈ．
（５）制备裂解液：吸取培养物于离心管中，以 ３ ５００ ｒ／ｒｕｉｎ，离心 １
０ ｍｉｎ，吸取上清液，再加人０２ ｍＬ氯仿（４－５滴），激烈振荡３０ ｓ，静置５ ｍ
ｌｎ，再次以 ３ ５５ ｒ／ｍｉｎ，离心 １０ ｍｌｎ，小心把上清波用无菌吸管转移到
另一试管，这就是噬菌体（Ａ） ｇａｌ”的裂解液。
２转导方法
（ｌ）点滴法：①取倒好ＥＭＢ培养基的培养皿２只，在皿底用记号笔按图中的样
子 画好。
②取一满环受体菌，涂出一条菌带，共涂二条， ３７ Ｔ培养 １５ ｈｏ ＠取出培养皿
在２个圆圈和四个方格处，各加一环噬菌体裂解液，２个圆圈作为对照，四个方格作为
转导处理，见图 １２—２，培养 ２ ｄ，观察结果。
3涂布法：①取倒好的ＥＭＢ培养皿三只，先做好标记，其中一加 ＯＪ ｍＬ噬菌体裂解
液，用于对照Ｚ一只加 ＯＪ ｍＬ受体菌，也用于对照，一只加噬菌体裂解液和受体菌液各
００５ ｍｌ、②用玻璃涂棒将各皿上的菌液（或噬菌体裂解液）涂开，相同的２只培养皿
用同一根玻璃涂棒，３７ ｔ培养 ２ ｄ，观察结果。
ｌ
实验二 ＤＮＡ指纹图谱
一、基本知识与原理
1984年英国莱斯特大学的遗传学家及其合作者首次将分离的人源小卫星用做基因探针，
同人体核的酶片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这
种图纹极少有两个人完全相同，故称为‘’ＤＮＡ指纹”，意思是它同人的指纹一样是每个
人所特有的，见图卜１８ＤＮＡ指纹的图像在Ｘ光胶片中呈一系列条纹，很象商品上的条形
码。利用ｎｗ＾指纹图谱的特点，可以检测”ｓｔ多态性（生物的不同个体或不同种群在Ｄ
ＮＡ结构上存在着差异）。目前有多种多样的手段，如ｍ右（限制性内切酶酶切片段长度多
态性）分析、串联重复序列分析、ＩＩＡＮ）（随机扩增多态性 ＤＮＡ分析等等等。各种分
析方法均以 ＤＮＡ的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的ＤＮＡ指纹图谱，由于Ｄ
ＮＡ指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成
为目前最具吸引力的遗传标记。
ＤＮＡ指纹具有下述特点：（ｌ）高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同 Ｄ
ＮＡ图形的概率仅 ３Ｘ１０－ＩＩ；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的
概率小于ＳＸ１０－”。全世界人口约５０亿，即ＳＸ１矿。因此，除非是同卵双生子女，
否则几乎不可能有两个人的ＤＮＡ 指纹的图形完全相同。（２）稳定的遗传性： ＤＮＡ是
人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，ＤＮＡ指纹图谱中几乎每一条带纹都能
在其双亲之一的图谱中找，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递５
０％给子代。图９－２为一家５口人的ＤＮＡ指纹图谱分析，显示ＤＮＡ指纹的遗传特性。
以体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的ＤＮＡ指纹图
形完全一致。
１９８５年Ｊ，ｆｆｅｒｖｓ博士首先将ＤＮＡ ｆｆｉ纹技术应用于法医鉴定。１９
８９年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用ＤＮＡ指纹技术已侦破
了数千例疑难案件。ＤＮＡ指纹图谱技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点如它从四
年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出来作分析：如果用线粒体＊＊Ａ检查，时间还将延长。
此外，千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决的沙皇尼古拉遗骸的身份鉴定，以及在一次
意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了ＤＮＡ指
纹技术。
此外，它在人类医学中被用于个体鉴别确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的
遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用干
区分不同物种．也有区分同一物种不同品系的潜力在作物的基因定位及育种卜也有非常广泛
的应用。
ＤＮＡ 指纹图谱法的基本操作，从生物样品中提取Ｗｐｅ一般都有部分的降解），可运
用ＰＣＲ 技术扩增出高可变位点如 系统联重复的小卫星ＤＮＡ等）或者完整的基因组Ｄ
ＮＡ，然后将扩增出的ＤＮＡ酶切成ＤＮＡ片段，经琼脂糖凝胶电泳．按相对分子质量大小
分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星ＤＮＡ 探针与膜上具有互补碱基序列
的ＤＮＡ片段杂交，用放射自显影便可获得ＤＮＡ指纹图谱，实验流程见图琼脂糖凝胶电泳
是分离、鉴定和纯化ＤＮＡ片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料——溴化乙锭进行
染色，可确定ＤＮＡ在凝胶中的位置、如有必要，还可以从凝胶中回收ＤＮＡ条带，用于各
种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酸胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓
度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 20ｂｏ ｈｐ至近 ５０ ｋｂ的 ＤＮＡ。长度ｌｉｎ ｋｂ
或更大的ＤＮＡ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，
在强度和方向恒定的电场下进行电泳。ＤＮＡ分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，
在电场中由负极向正极迁移。分子迁移的速率受分子大小、构象、电场强度和方向、碱基组
成、温度和嵌入染料等因素的影响。
二、.实验目的和要求
（1）掌握ＤＮＡ指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程；
（２）学习ＤＮＡ的限制性酶切的基本操作技术；
（３）掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定ＤＮＡ片段
的长度，并能对实验结果进行分析。
三、实验器材
（ｌ）实验材料：犯罪现场ＤＮＡ样品（ＣＳ）、嫌疑犯 ＩＤＮＡ样品（ＳＩ）、嫌疑
犯２ ＤＮＡ样品（ＳＺ）、嫌疑犯３ ＤＮＡ样品（Ｓ３）、嫌疑犯４ＤＮＡ样品（Ｓ４）、
嫌疑犯５ ＤＮＡ样品（ＳＳ）。
（2）实验试剂：
①ＤＮＡ样品反应缓冲浪：ｌｌｍｍｏＭＩＴｒｉｓ、２２ｍｍｏＷＮａＣＩ、２０ｒ
ｎｚｎｏＭｉＭｇＣＩ。、 ２ ｒｎｍｏｗ ＤＴｈ， ＰＨ ８刀
② ＥｃＯＲＩ限制性内切酶；
③ Ｐｓｔｌ限制性内功酶；
④电泳缓冲液（５０ｘＴＡＥ， ｈａ：Ｘ） ｍＬ）
Ｔｒｉｓ ２４２ ｇ
冰醋酸 ５７１ ｒｎＬ
ＥＤＴＡ（０５ ｍｏｂｏ ｐＨ ８０） １００ ｍＬ
使用时用蒸馏水稀释５０倍Ｚ
⑤样品缓冲液（ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）： ０２５％汉酚蓝、
０２５％Ｔｈ甲苯青、４０％（Ｗ／Ｆ）蔗糖。
（3）实验药品：
①溴化乙锭（ＥＢ）ｌｔｈｅｇｌｍＬ。
2琼脂糖Ａｇａ。ｓｃ（电泳级）
（4）实验设备
ｌ电泳仪、电泳槽、样品流、微波炉、水浴锅、微量移液器、１０００毫升、离心管、一
次性枪头等。
四、实验方法与步骤
1、ＤＮＡ样品的制备
采集生物检测样本，在弱碱和鳌合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；
利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在３７℃孵化数小时，消化蛋白质分离ＤＮＡＳ使用有机溶剂
如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取ＤＮＡ；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀ＤＮＡ。
由于一般采集的样本中的ＤＮＡ都有不同程度的降解，采用ＰＣＲ技术扩增出完整的
基因组ＤＮＡ或者特定的高可变位点，以此制备出的ＤＮＡ样品备用。
２ ＤＮＡ样品的酶切反应
设置ＤＮＡ样品的双酶切反应，按表９－１所列顺序加样（体积：卜Ｕ）
注意：酶切时．应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超
过总体积的，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。
加完反应液，温和混匀，置于３７℃水浴中反应 ｌｈ，取出分别编号ＣＳ、Ｓ－ＳＳ，
备用。
3琼脂糖凝胶制备
（1）在 １００ ｍＬ电泳缓冲液（ｌｘＴＡＥ）中加人 1克琼脂糖，加热熔化．注意
观察，当心煮沸的液体溢出！当凝胶冷却至０℃左右时加人５卜Ｌ溴化乙锭溶液（终浓度为
０５卜势ｕ，充分混匀。
（2）先用透明胶带封固胶托边缘，放好梳子，然后再倒人凝胶（凝胶厚度在ｓｒｎｍ
左右）。
（３）在凝胶完全凝固后（室温放置３０－４５ ｍｉｎ），小心移去梳子和透明胶带，
将凝胶放人电泳槽中，加人电泳缓冲液（液面超过胶面约）。
４酶切产物的琼脂糖电泳
（ｌ）将 ６支酶切 ＤＮＡ样品离心管放人台式离心机中，以 １２ ０００ Ｉｎ’］
ｌｎ离心ｉｃ Ｓ，使管壁上的液滴集中到管底。
（２）取出离心管，分别加人ＺｕＬ样品缓冲液，充分混匀；再将离心管放人离心机中，
以 １２ ０００ ｒｈｏｉｎ离心 １０ ｓ。
（３）用移液器将样品小心地加人点样孔。在不同的点样孔中，分别加人６种酶切Ｄ
ＮＡ样品和对照各１０ ＭＯ盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用 ｓｔｈｌｏｐ Ｖ）
Ｉ到 １００ Ｖ，电泳 ３（）Ｍｌ ｍｉｎ。
３结果观察与分析
关闭电源，取出凝胶，在紫外灯下观察ＤＮＡ的迁移位置，并讨论实验结果。判断ＣＳ
与哪一个ＤＮＡ样品是同一个样品，找出罪犯。
2024年4月25日发(作者：旷书云)
实验一 细菌的转导（演示实验）
一、基本知识与原理
转导是以噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。随着分子遗传
学的发展，转身已成为基因精细结构分析的常用方法之一。
根据噬菌体转导供体菌基因的差异，转导可分为普遍性转导和局限性转导。这里以局
限性转导为例说明转导的基本原理。局限性转导实验中常用的是大噬菌体，它能整合在大肠
杆菌染色体ＤＮＡ上的半乳糖基因（ｇａｌ）和生物素基因（ｂｉｂ）之间，因此，它能转
导半乳糖基因（一）又能转导生物素基因（ｂｉｏ）。
本实验选用大肠杆菌 Ｅ。ｏｈ Ｋ．２（Ａ）为供体菌（即大噬菌体的ＤＮＡ已整合
在大肠杆菌的ＤＮＡ上，我们称该大肠杆菌为溶源性大肠杆菌，’ｇａｔ””为带有半乳糖基
因）。由于在此供体菌中噬菌体与半乳糖基因（匆”）紧密连锁，因此，当此供体菌受紫外线
照射后会产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有半乳糖基因的转导噬菌
体。当这种转导噬菌体与受体菌 ＥＣＯ］ｉ Ｋ；。 Ｓ ｇａｌ－（此细菌不能利用半乳糖，
‘’表示此细菌半乳糖基因发生突变）混合接触时，带有一基因的转导噬菌体能以一定的频
率整合到受体首上，从而使不能利用半乳糖的 ｇａｌ一受体菌转变成了能利用半乳糖的 ｇ
ａｔ”细菌。整个过程可用图１２－’表示：ｌ
二、实验目的和要求
以局限性转导为例来说明转导的基本原理，进一步验证是遗传物质，并初步掌握转导
实验的基本方法。
三、实验器材
（1）实验材料：供体菌 受体菌
（２）实验试剂：肉汤液体培养基、肉汤固体培养基、ＺＥ 肉汤液体培养基、半固体
琼脂培养基、半乳糖ＥＭＢ培养基、灭菌生理盐水（或磷酸缓冲液）
Ｄ（３）实验设备：培养皿（９厘米）、三角烧瓶（５０毫升）、试管、离心管，离心机，
移液管，涂棒，水浴锅，离心机，紫外照射箱、温箱
四、实验方法与步骤
１ 噬菌体的诱导和裂解液的制备
（１）供体菌的活化与培养，取—环供体菌，接种于盛有ｓｍＬ肉汤液体培养基的三角
瓶中３７度培养１６ｈ后，吸取0.5毫升菌液，接种于盛有肉4.5毫升肉汤液体培养基的三
角瓶中，继续培养４～6小时。
（２）制备悬浮液将三角瓶中的菌液倒人离心管，以 ３ ５００ ｒｌｍｌｎ， 离心 １
０ ｍｉｎ。离心后，除去上清液，加 ４ｍＬ磷酸缓冲液，混匀沉淀，再以 ３ ｓｍｒ／ｍ
ｉｎ，离心 １０。ｉ。，这样反复洗三次，制备成悬浮液。
（３）诱导裂解：取悬浮液 ３。；Ｉ于培养皿中，经 ＵＶ处理（１５ Ｗ，距离 ４
０ｃｍ），诱导 １０－２０。
（４）避光培养； ＵＶ处理后，加人 ３ ｍＬ ＺＥ肉汤液体培养基，为了防止光
复活，立即置于３７ Ｔ避光培养 ２－３ ｈ．
（５）制备裂解液：吸取培养物于离心管中，以 ３ ５００ ｒ／ｒｕｉｎ，离心 １
０ ｍｉｎ，吸取上清液，再加人０２ ｍＬ氯仿（４－５滴），激烈振荡３０ ｓ，静置５ ｍ
ｌｎ，再次以 ３ ５５ ｒ／ｍｉｎ，离心 １０ ｍｌｎ，小心把上清波用无菌吸管转移到
另一试管，这就是噬菌体（Ａ） ｇａｌ”的裂解液。
２转导方法
（ｌ）点滴法：①取倒好ＥＭＢ培养基的培养皿２只，在皿底用记号笔按图中的样
子 画好。
②取一满环受体菌，涂出一条菌带，共涂二条， ３７ Ｔ培养 １５ ｈｏ ＠取出培养皿
在２个圆圈和四个方格处，各加一环噬菌体裂解液，２个圆圈作为对照，四个方格作为
转导处理，见图 １２—２，培养 ２ ｄ，观察结果。
3涂布法：①取倒好的ＥＭＢ培养皿三只，先做好标记，其中一加 ＯＪ ｍＬ噬菌体裂解
液，用于对照Ｚ一只加 ＯＪ ｍＬ受体菌，也用于对照，一只加噬菌体裂解液和受体菌液各
００５ ｍｌ、②用玻璃涂棒将各皿上的菌液（或噬菌体裂解液）涂开，相同的２只培养皿
用同一根玻璃涂棒，３７ ｔ培养 ２ ｄ，观察结果。
ｌ
实验二 ＤＮＡ指纹图谱
一、基本知识与原理
1984年英国莱斯特大学的遗传学家及其合作者首次将分离的人源小卫星用做基因探针，
同人体核的酶片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这
种图纹极少有两个人完全相同，故称为‘’ＤＮＡ指纹”，意思是它同人的指纹一样是每个
人所特有的，见图卜１８ＤＮＡ指纹的图像在Ｘ光胶片中呈一系列条纹，很象商品上的条形
码。利用ｎｗ＾指纹图谱的特点，可以检测”ｓｔ多态性（生物的不同个体或不同种群在Ｄ
ＮＡ结构上存在着差异）。目前有多种多样的手段，如ｍ右（限制性内切酶酶切片段长度多
态性）分析、串联重复序列分析、ＩＩＡＮ）（随机扩增多态性 ＤＮＡ分析等等等。各种分
析方法均以 ＤＮＡ的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的ＤＮＡ指纹图谱，由于Ｄ
ＮＡ指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成
为目前最具吸引力的遗传标记。
ＤＮＡ指纹具有下述特点：（ｌ）高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同 Ｄ
ＮＡ图形的概率仅 ３Ｘ１０－ＩＩ；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的
概率小于ＳＸ１０－”。全世界人口约５０亿，即ＳＸ１矿。因此，除非是同卵双生子女，
否则几乎不可能有两个人的ＤＮＡ 指纹的图形完全相同。（２）稳定的遗传性： ＤＮＡ是
人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，ＤＮＡ指纹图谱中几乎每一条带纹都能
在其双亲之一的图谱中找，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递５
０％给子代。图９－２为一家５口人的ＤＮＡ指纹图谱分析，显示ＤＮＡ指纹的遗传特性。
以体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的ＤＮＡ指纹图
形完全一致。
１９８５年Ｊ，ｆｆｅｒｖｓ博士首先将ＤＮＡ ｆｆｉ纹技术应用于法医鉴定。１９
８９年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用ＤＮＡ指纹技术已侦破
了数千例疑难案件。ＤＮＡ指纹图谱技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点如它从四
年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出来作分析：如果用线粒体＊＊Ａ检查，时间还将延长。
此外，千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决的沙皇尼古拉遗骸的身份鉴定，以及在一次
意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了ＤＮＡ指
纹技术。
此外，它在人类医学中被用于个体鉴别确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的
遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用干
区分不同物种．也有区分同一物种不同品系的潜力在作物的基因定位及育种卜也有非常广泛
的应用。
ＤＮＡ 指纹图谱法的基本操作，从生物样品中提取Ｗｐｅ一般都有部分的降解），可运
用ＰＣＲ 技术扩增出高可变位点如 系统联重复的小卫星ＤＮＡ等）或者完整的基因组Ｄ
ＮＡ，然后将扩增出的ＤＮＡ酶切成ＤＮＡ片段，经琼脂糖凝胶电泳．按相对分子质量大小
分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星ＤＮＡ 探针与膜上具有互补碱基序列
的ＤＮＡ片段杂交，用放射自显影便可获得ＤＮＡ指纹图谱，实验流程见图琼脂糖凝胶电泳
是分离、鉴定和纯化ＤＮＡ片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料——溴化乙锭进行
染色，可确定ＤＮＡ在凝胶中的位置、如有必要，还可以从凝胶中回收ＤＮＡ条带，用于各
种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酸胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓
度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 20ｂｏ ｈｐ至近 ５０ ｋｂ的 ＤＮＡ。长度ｌｉｎ ｋｂ
或更大的ＤＮＡ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，
在强度和方向恒定的电场下进行电泳。ＤＮＡ分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，
在电场中由负极向正极迁移。分子迁移的速率受分子大小、构象、电场强度和方向、碱基组
成、温度和嵌入染料等因素的影响。
二、.实验目的和要求
（1）掌握ＤＮＡ指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程；
（２）学习ＤＮＡ的限制性酶切的基本操作技术；
（３）掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定ＤＮＡ片段
的长度，并能对实验结果进行分析。
三、实验器材
（ｌ）实验材料：犯罪现场ＤＮＡ样品（ＣＳ）、嫌疑犯 ＩＤＮＡ样品（ＳＩ）、嫌疑
犯２ ＤＮＡ样品（ＳＺ）、嫌疑犯３ ＤＮＡ样品（Ｓ３）、嫌疑犯４ＤＮＡ样品（Ｓ４）、
嫌疑犯５ ＤＮＡ样品（ＳＳ）。
（2）实验试剂：
①ＤＮＡ样品反应缓冲浪：ｌｌｍｍｏＭＩＴｒｉｓ、２２ｍｍｏＷＮａＣＩ、２０ｒ
ｎｚｎｏＭｉＭｇＣＩ。、 ２ ｒｎｍｏｗ ＤＴｈ， ＰＨ ８刀
② ＥｃＯＲＩ限制性内切酶；
③ Ｐｓｔｌ限制性内功酶；
④电泳缓冲液（５０ｘＴＡＥ， ｈａ：Ｘ） ｍＬ）
Ｔｒｉｓ ２４２ ｇ
冰醋酸 ５７１ ｒｎＬ
ＥＤＴＡ（０５ ｍｏｂｏ ｐＨ ８０） １００ ｍＬ
使用时用蒸馏水稀释５０倍Ｚ
⑤样品缓冲液（ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）： ０２５％汉酚蓝、
０２５％Ｔｈ甲苯青、４０％（Ｗ／Ｆ）蔗糖。
（3）实验药品：
①溴化乙锭（ＥＢ）ｌｔｈｅｇｌｍＬ。
2琼脂糖Ａｇａ。ｓｃ（电泳级）
（4）实验设备
ｌ电泳仪、电泳槽、样品流、微波炉、水浴锅、微量移液器、１０００毫升、离心管、一
次性枪头等。
四、实验方法与步骤
1、ＤＮＡ样品的制备
采集生物检测样本，在弱碱和鳌合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；
利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在３７℃孵化数小时，消化蛋白质分离ＤＮＡＳ使用有机溶剂
如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取ＤＮＡ；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀ＤＮＡ。
由于一般采集的样本中的ＤＮＡ都有不同程度的降解，采用ＰＣＲ技术扩增出完整的
基因组ＤＮＡ或者特定的高可变位点，以此制备出的ＤＮＡ样品备用。
２ ＤＮＡ样品的酶切反应
设置ＤＮＡ样品的双酶切反应，按表９－１所列顺序加样（体积：卜Ｕ）
注意：酶切时．应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超
过总体积的，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。
加完反应液，温和混匀，置于３７℃水浴中反应 ｌｈ，取出分别编号ＣＳ、Ｓ－ＳＳ，
备用。
3琼脂糖凝胶制备
（1）在 １００ ｍＬ电泳缓冲液（ｌｘＴＡＥ）中加人 1克琼脂糖，加热熔化．注意
观察，当心煮沸的液体溢出！当凝胶冷却至０℃左右时加人５卜Ｌ溴化乙锭溶液（终浓度为
０５卜势ｕ，充分混匀。
（2）先用透明胶带封固胶托边缘，放好梳子，然后再倒人凝胶（凝胶厚度在ｓｒｎｍ
左右）。
（３）在凝胶完全凝固后（室温放置３０－４５ ｍｉｎ），小心移去梳子和透明胶带，
将凝胶放人电泳槽中，加人电泳缓冲液（液面超过胶面约）。
４酶切产物的琼脂糖电泳
（ｌ）将 ６支酶切 ＤＮＡ样品离心管放人台式离心机中，以 １２ ０００ Ｉｎ’］
ｌｎ离心ｉｃ Ｓ，使管壁上的液滴集中到管底。
（２）取出离心管，分别加人ＺｕＬ样品缓冲液，充分混匀；再将离心管放人离心机中，
以 １２ ０００ ｒｈｏｉｎ离心 １０ ｓ。
（３）用移液器将样品小心地加人点样孔。在不同的点样孔中，分别加人６种酶切Ｄ
ＮＡ样品和对照各１０ ＭＯ盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用 ｓｔｈｌｏｐ Ｖ）
Ｉ到 １００ Ｖ，电泳 ３（）Ｍｌ ｍｉｎ。
３结果观察与分析
关闭电源，取出凝胶，在紫外灯下观察ＤＮＡ的迁移位置，并讨论实验结果。判断ＣＳ
与哪一个ＤＮＡ样品是同一个样品，找出罪犯。