2024年5月6日发(作者：诺高)
Biacore X100简易操作指南
一、Biacore X100设备介绍
分子相互作用分析系统Biacore是由仪器主机和电脑两部分组成。
仪器开关在主机右后方，仪器正面左侧为缓冲液入口，可放置运行缓冲液，中上部分
为状态面板，以指示灯显示仪器状态，状态面板右边即为芯片的放置位置，芯片会与SPR
光学检测器、微流控系统IFC嵌合，开展结合分析过程。右侧为样品舱，可放置15个
1.5ml的EP管，下方放有废液瓶。如下图所示。
二、实验准备
实验前需根据实验需求选择芯片，GE提供羧基葡聚糖表面的CM系列芯片、适用于
HIS标签蛋白的NTA芯片、应用于生物素标记分子的SA芯片（通常用于核酸、多肽）等，
蛋白研究最常用CM5芯片，开展实验时会固定一个分子（配体）在芯片表面，另一个分
子（分析物）以流动相流过芯片，通过表面等离子共振SPR的原理研究相互作用的过程。
根据实验目的，需要确定配体的偶联量，可通过以下公式进行计算，其中R
max
代表芯
片的最大结合容量，为分析物在表面的最大响应值，Sm为化学计量比，LigandMW为配体
的分子量，AnalyteMW为分析物的分子量，R
L
代表配体的偶联水平，也即需要求得的值，
实际固定量一般设为1.5R
L
。动力学分析中，R
max
需低于100RU。
Biacore对分子的互作检测是基于功能性的，所以实验过程必须要新鲜有活性的样品，
0.22um膜过滤或者仔细离心，配体纯度要求在90%以上，分析物的纯度依实验类型而定，
进行动力学/亲和力分析时需要90%以上的纯度，进行浓度/特异性测定时可以进混合样品。
缓冲体系选择：大多数缓冲液均适用，可根据样品活性确定最适缓冲液，须新鲜配制，
经0.22um膜过滤及脱气。氨基偶联方法固定配体时，缓冲液中不能含有Tris、甘氨酸等
带有伯胺基的物质。分析物溶液中，不能含甘油、蔗糖、咪唑等高折光率物质，如果样品
中含有该物质，可通过缓冲液置换、透析的方法除去。
三、实验操作
在该部分中，选用CM5芯片，以配体mouse-anti-human β2-microglobulin antibody和分
析物human β2-microglobulin的动力学分析为例进行操作介绍（样品均来自 Biacore getting
started kit），实验流程为配体固定-表面测试-再生条件筛选-分析物进样-芯片再生-数据分
析。
首先将缓冲液更换为实验所用缓冲液HBS-EP+，芯片更换为CM5芯片，选择Tools-
undock chip，填入芯片信息，按照芯片表面箭头所指方向，将芯片放入并合上舱门，点击
dock chip。缓冲液、芯片放置完毕，选择Tools-prime进行缓冲体系更换。
1、pH scouting：在CM5芯片上固定配体之前，需要筛选合适的配体缓冲液pH，使
配体通过静电吸附的作用富集到芯片表面附近，达到较好的偶联效果，通常会从pH5.5，
5.0，4.5，4的10mM醋酸钠中筛选，一般配体浓度为10-100ug/ml，初次实验可尝试
20ug/ml。选择Assay flow-wizard
，
surface preparation-immobilization pH scouting，单击
New，可设置过程参数。首先选择芯片通道，可从1,2,3,4通道任选一个，buffer已经预置
四种条件，10mM醋酸钠，pH5.5 , 5.0 , 4.5, 4，单击Next，输入配体名称mouse-anti-
human β2-microglobulin antibody，contact time 180s，流速5ul/min，之后用50mM NaOH
再生表面，单击Next，可进行芯片表面温度和样品舱温度的设置，单击Next，左侧选择
sample and reagent rack1，按照样品架中对应位置放置溶液即可，点击Next保存实验方法，
即可开始实验。
2、配体固定：配体在表面的偶联有直接偶联法和捕获法，本实验中使用氨基直接偶
联的方法进行固定。选择Assay flow-wizard
，
surface preparation-immobilization，单击New，
芯片选择CM5，可对FC1、2、3、4 四通道分别设置，一般1，2通道配对使用（1通道作
为参比），3，4通道配对使用（3通道作为参比），参比通道可用空白对比或活化-封闭
无配体固定的方式，实验用通道1和2，通道2上偶联配体。直接的共价偶联方式有氨基、
巯基或醛基等方法可选，最常用氨基偶联，一般流程是先用EDC/NHS活化，固定配体，再
用乙醇胺封闭。偶联模式有aim for immobilized level 和specify contact time两种，aim for
immobilized level只需输入目标偶联水平，软件会自动实现相应水平的偶联，contact time
模式需要输入进样时间和流速，一般在一定的预实验基础上使用。本实验为动力学分析过
程，Rmax要低于100RU，所以1.5RL计算出来为1000RU左右，直接使用aim for
immobilized level模式，输入target level 1000RU，进行自动偶联。Next之后的步骤同上，
进行实验过程的参数设置。偶联结束后，通过Response bound进行偶联量的检测。
2024年5月6日发(作者：诺高)
Biacore X100简易操作指南
一、Biacore X100设备介绍
分子相互作用分析系统Biacore是由仪器主机和电脑两部分组成。
仪器开关在主机右后方，仪器正面左侧为缓冲液入口，可放置运行缓冲液，中上部分
为状态面板，以指示灯显示仪器状态，状态面板右边即为芯片的放置位置，芯片会与SPR
光学检测器、微流控系统IFC嵌合，开展结合分析过程。右侧为样品舱，可放置15个
1.5ml的EP管，下方放有废液瓶。如下图所示。
二、实验准备
实验前需根据实验需求选择芯片，GE提供羧基葡聚糖表面的CM系列芯片、适用于
HIS标签蛋白的NTA芯片、应用于生物素标记分子的SA芯片（通常用于核酸、多肽）等，
蛋白研究最常用CM5芯片，开展实验时会固定一个分子（配体）在芯片表面，另一个分
子（分析物）以流动相流过芯片，通过表面等离子共振SPR的原理研究相互作用的过程。
根据实验目的，需要确定配体的偶联量，可通过以下公式进行计算，其中R
max
代表芯
片的最大结合容量，为分析物在表面的最大响应值，Sm为化学计量比，LigandMW为配体
的分子量，AnalyteMW为分析物的分子量，R
L
代表配体的偶联水平，也即需要求得的值，
实际固定量一般设为1.5R
L
。动力学分析中，R
max
需低于100RU。
Biacore对分子的互作检测是基于功能性的，所以实验过程必须要新鲜有活性的样品，
0.22um膜过滤或者仔细离心，配体纯度要求在90%以上，分析物的纯度依实验类型而定，
进行动力学/亲和力分析时需要90%以上的纯度，进行浓度/特异性测定时可以进混合样品。
缓冲体系选择：大多数缓冲液均适用，可根据样品活性确定最适缓冲液，须新鲜配制，
经0.22um膜过滤及脱气。氨基偶联方法固定配体时，缓冲液中不能含有Tris、甘氨酸等
带有伯胺基的物质。分析物溶液中，不能含甘油、蔗糖、咪唑等高折光率物质，如果样品
中含有该物质，可通过缓冲液置换、透析的方法除去。
三、实验操作
在该部分中，选用CM5芯片，以配体mouse-anti-human β2-microglobulin antibody和分
析物human β2-microglobulin的动力学分析为例进行操作介绍（样品均来自 Biacore getting
started kit），实验流程为配体固定-表面测试-再生条件筛选-分析物进样-芯片再生-数据分
析。
首先将缓冲液更换为实验所用缓冲液HBS-EP+，芯片更换为CM5芯片，选择Tools-
undock chip，填入芯片信息，按照芯片表面箭头所指方向，将芯片放入并合上舱门，点击
dock chip。缓冲液、芯片放置完毕，选择Tools-prime进行缓冲体系更换。
1、pH scouting：在CM5芯片上固定配体之前，需要筛选合适的配体缓冲液pH，使
配体通过静电吸附的作用富集到芯片表面附近，达到较好的偶联效果，通常会从pH5.5，
5.0，4.5，4的10mM醋酸钠中筛选，一般配体浓度为10-100ug/ml，初次实验可尝试
20ug/ml。选择Assay flow-wizard
，
surface preparation-immobilization pH scouting，单击
New，可设置过程参数。首先选择芯片通道，可从1,2,3,4通道任选一个，buffer已经预置
四种条件，10mM醋酸钠，pH5.5 , 5.0 , 4.5, 4，单击Next，输入配体名称mouse-anti-
human β2-microglobulin antibody，contact time 180s，流速5ul/min，之后用50mM NaOH
再生表面，单击Next，可进行芯片表面温度和样品舱温度的设置，单击Next，左侧选择
sample and reagent rack1，按照样品架中对应位置放置溶液即可，点击Next保存实验方法，
即可开始实验。
2、配体固定：配体在表面的偶联有直接偶联法和捕获法，本实验中使用氨基直接偶
联的方法进行固定。选择Assay flow-wizard
，
surface preparation-immobilization，单击New，
芯片选择CM5，可对FC1、2、3、4 四通道分别设置，一般1，2通道配对使用（1通道作
为参比），3，4通道配对使用（3通道作为参比），参比通道可用空白对比或活化-封闭
无配体固定的方式，实验用通道1和2，通道2上偶联配体。直接的共价偶联方式有氨基、
巯基或醛基等方法可选，最常用氨基偶联，一般流程是先用EDC/NHS活化，固定配体，再
用乙醇胺封闭。偶联模式有aim for immobilized level 和specify contact time两种，aim for
immobilized level只需输入目标偶联水平，软件会自动实现相应水平的偶联，contact time
模式需要输入进样时间和流速，一般在一定的预实验基础上使用。本实验为动力学分析过
程，Rmax要低于100RU，所以1.5RL计算出来为1000RU左右，直接使用aim for
immobilized level模式，输入target level 1000RU，进行自动偶联。Next之后的步骤同上，
进行实验过程的参数设置。偶联结束后，通过Response bound进行偶联量的检测。