银杏叶提取物对三氯乙烯诱导人角质形成细胞线粒体损伤的保护作用

2024年5月11日发(作者：东门高)

银杏叶提取物对三氯乙烯诱导人角质形成细胞线粒体损伤的保

护作用

朱启星;叶良平;马泰;沈彤

【摘要】背景与目的:研究三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)对人角质形成细胞

(kemtinocytes,KC)线粒体的损伤以及银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,EGb)

对其损伤的保护作用,为防治三氯乙烯药疹样皮炎提供基础资料和理论依据.材料与

方法:分离制备体外培养Kc,接种于培养板/皿中,分成TCE染毒组、EGb保护组,溶

剂对照组和空白对照组,TCE染毒组以不同浓度TCE(0、0.125、0.5和2.0

mmoL/L)及不同时间(0、4、8、12和24 h)处理体外培养的Kc,EGb保护组则以

不同浓度EGb(0、10、50、100和150 mg/L)预处理2 h后再用2.0 mmoL/L

TCE进行染毒,溶剂对照组和空白对照不加入TCE和EGb,以使用含1%丙酮(体积

分数)的培养基为溶剂对照组,以新鲜培养基作为空白对照组.采用MTT法观察细胞

活力和线粒体酶抑制率变化,检测ATP酶活力,间接反映线粒体能量变化情况,通过

流式细胞术结合罗丹明123(Rh123)和碘化丙啶(PI)双染法检测线粒体膜电位的改

变情况.结果:随着TCE浓度的升高和作用时间的延长,细胞活力、ATP酶活性和线

粒体膜电位下降,线粒体酶抑制率升高,当TCE浓度超过0.5 mmol/L,作用时间大于

8 h时,与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);EGb保护组在EGb浓度为

10 mg/L时即可起到保护作用(与2/0 mmnol/L TCE染毒组比较,P<0/01),当EGb

浓度增加到150 mg/L时线粒体功能状态接近正常对照组水平(与溶剂对照组比

较,P>0.05).结论:TCE可引起人KC线粒体损伤,EGb对这种损害具有保护作用.

【期刊名称】《癌变·畸变·突变》

【年(卷),期】2008(020)005

【总页数】5页(P337-341)

【关键词】三氯乙烯;角质形成细胞;线粒体;银杏叶提取物

【作者】朱启星;叶良平;马泰;沈彤

【作者单位】安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生系,安徽,合

肥,230032;安徽医科大学皮肤病研究所,安徽,合肥,230023;安徽医科大学公共卫生

学院劳动卫生与环境卫生系,安徽,合肥,230032;安徽医科大学公共卫生学院劳动卫

生与环境卫生系,安徽,合肥,230032;安徽医科大学皮肤病研究所,安徽,合肥,230023

【正文语种】中文

【中图分类】R285.5;R758.22

在生产和使用三氯乙烯（trichloroethylene，TCE)过程中，少数接触者会发生职

业性三氯乙烯药疹样皮炎（occupational dermatitis medicamentosa-like of

trichloroethylene，ODMLT)，表现为迅速出现的表皮剥脱、松解和皮肤细胞的

损伤、死亡，而多数皮肤接触TCE的工人，则有不同程度的皮肤接触刺激性损伤，

其发病机制都亟待探讨［1-2］。有研究表明，三氯乙烯通过线粒体途径诱导人角

质形成细胞（keratinocyte，KC)损伤、凋亡，TCE对KC的细胞毒性作用可能参

与上述职业性疾患的发生过程［3］。线粒体不仅是细胞能量的代谢场所，而且可

以介导细胞凋亡，启动细胞死亡［4］，许多外源性化合物可通过线粒体途径发挥

细胞毒性作用。而银杏叶提取物（ginkgo biloba extract，EGb)具有天然的抗氧

化活性，且可以有效地保护线粒体功能，对各种不同原因导致的组织和细胞损伤起

到防护作用［5-6］。本研究通过观察TCE直接作用以及EGb预处理再行TCE染

毒后，皮肤角质形成细胞线粒体功能的变化，以期深入揭示TCE的皮肤毒性机制

并为开发研制皮肤防护用品提供基础资料。

1.1 试剂和材料

三氯乙烯（99.5%AR，美国Alfa Aesar公司)，胰蛋白酶、DMEM、Defined

Keratinocyte-SFM培养基均购自GIBCO公司，胎牛血清（FBS)为杭州四季青生

物工程材料有限公司产品，银杏叶提取物由江苏扬子江药业提供，四甲基噻唑蓝

（MTT)、罗丹明123（Rh123)染料为Sigma公司产品，DNA-PrepTMStain

（PI+RNase，美国Beckman Coulter公司)，超微量ATP酶测定试剂盒（南京

建成生物工程有限公司)，uQuabtTM酶标仪（美国Bio-Tek公司)，EPICS流式

细胞仪（美国Beckman Coulter公司)。

1.2 角质形成细胞的分离和培养

临床泌尿外科包皮环切术后的正常皮肤用D-Hanks液漂洗3次并去除皮下组织后，

剪成1 cm×0.5 cm大小的皮片，经0.25%胰蛋白酶在4℃消化10 h分离出表皮，

再以0.25%胰蛋白酶37℃消化10 min，吹打、过滤、离心后分离KC，用含

10%FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2条件下进行培养，贴壁后换成

Defined Keratinocyte-SFM培养基继续培养，待细胞长至80%汇合后用于实验

研究。

1.3 细胞染毒组和保护组的设置

根据要求调整细胞密度接种至培养板/皿中，以不同浓度的TCE（0、0.125、0.5

和2.0 mmol/L)染毒不同时间（0、4、8、12和24 h)，使用含1%丙酮（体积分

数)的培养基作为溶剂对照，新鲜培养基作为空白对照，每个组分别设3个重复孔。

EGb保护实验中，EGb的保护浓度取0、10、50、100和150 mg/L，于染毒前

2 h分别加入不同浓度的EGb预处理，弃去含EGb培养基后，用2.0 mmol/L

TCE染毒，每个组设3个复孔。

1.4 MTT实验

调整细胞密度至5×104/ml，将细胞悬液以每孔100 μl接种至96孔培养板，染

毒组和保护组处理至不同的时间后，每孔加入50μl的0.5 mg/ml MTT工作液孵

育5 h。加入50μl的10%SDS、0.1 mol/L HCI溶液终止反应，置培养箱内放置

过夜后，酶标仪上570 nm下测定吸光度（A570)。按下式分别计算细胞存活率和

线粒体酶活力抑制率。

细胞存活率=处理组A570/对照组A570×100%

线粒体酶活力抑制率=（对照组A570-处理组A570)/对照组A570×100%

1.5 ATP酶活力检测

收集细胞，调整密度至107/ml（PBS稀释)，取0.3 ml低温环境下进行超声破碎

（超声时间：10 s，间隔时间：5 s，全程时间：4 min)，根据ATP酶试剂盒说明

书测定ATP酶活力，结果以U/mg蛋白表示（每小时每毫克细胞匀浆蛋白中ATP

酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为1个ATP酶活力单位)。

1.6 Rh123/PI双染法检测膜电位变化

细胞以5×105/ml的密度接种至6孔培养板，染毒组和保护组均处理8 h。收集

细胞，PBS洗涤1遍；加入1 ml Rh123工作液（2μg/ml)，37℃孵育30 min；

PBS洗涤细胞2遍，加入500μl DNA-PrepTMStain（即PI染料)，室温避光染色

30 min后进行流式细胞仪检测，激发光波长为488 nm。

1.7 统计学方法

所有数据采用SPSS11.5统计软件包进行数据处理，结果以±s表示，采用单因素

方差分析。并将各指标的测量值与染毒剂量进行曲线拟合，分析剂量-效应关系。

2.1 EGb对细胞活力的保护作用

TCE可引起KC的细胞活力呈时间和剂量依赖性降低（表1。0.5和2.0 mmol/L

TCE在作用4 h后细胞活力即降低，与溶剂对照组相比，差异具有统计学意义（P

＜0.01)。

EGb的保护作用如表2所示。150 mg/L EGb单独作用细胞活力与空白对照组比

较，无明显改变（P＞0.05)；而2.0 mmol/L TCE单独处理后细胞活力下降至

39.56% ±1.95%，与溶剂对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01)。经EGb预处

理的各组，细胞活力逐渐回升，与2.0 mmol/L TCE单独处理组比较差异均有统

计学意义（P均＜0.01)，EGb浓度增加为100和150 mg/L时细胞活力与溶剂对

照组比较差异无统计学意义（P＞0.05)。

2.2 EGb对线粒体酶活力的保护作用

根据MTT检测的结果可以计算线粒体酶活性抑制率，此指标可以间接反映线粒体

功能。如表3所示，随着TCE剂量的增加以及作用时间的延长，线粒体酶活力抑

制率增加，线粒体功能下降，呈一定的时间、剂量依赖关系。KC用含EGb的培养

基预孵育后暴露于2.0 mmol/L TCE时，从表2中可以看到EGb对TCE引起的线

粒体酶抑制具有明显的保护作用，2.0 mmol/L TCE使得细胞的酶活性抑制率升高

到60.44±1.95（与溶剂对照组比较，P＜0.01)，保护组则随着EGb剂量的加大酶

活性抑制率逐渐下降（与2.0 mmol/L TCE染毒组比较，P＜0.01)，当EGb浓度

为100 mg/L和150 mg/L时线粒体酶抑制率与溶剂对照组比较差异无统计学意

义（P＞0.05)

2.3 EGb对ATP酶抑制的保护作用

如表4所示，随着TCE浓度的升高和染毒时间的延长，ATP酶活力下降越明显。

EGb的保护作用如表2所示，使用EGb预处理后，随着EGb剂量的加大ATP酶

活力逐渐上升，当EGb浓度超过50 mg/L时EGb可以保护ATP酶活性的降低

（与2.0 mmol/L TCE染毒组比较，P＜0.01)，超过100 mg/L EGb保护组ATP

酶活力与溶剂对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05)。

2.4 EGb对线粒体膜电位的保护作用

流式细胞仪根据Rh123和PI的荧光强度高低将细胞分为4群：Rh123/PI细胞为

细胞膜完整，线粒体膜电位（用△Ψm表示)处于“稳态”的细胞；Rh123-/PI-细

胞为细胞膜完整，△Ψm降低的细胞，即将发生调亡；Rh123-/PI+细胞为细胞膜

破坏，△Ψm降低的坏死细胞；Rh123+/PI+细胞为△Ψm正常，细胞膜遭到破坏

的细胞，为机械损伤所致。分别检测Rh123的荧光强度以及各群细胞所占的百分

比（Rh123+/PI+群细胞计数)，结果如表5所示。

不同浓度的TCE处理细胞8 h后均能显著降低KC线粒体膜电位水平（Rh123荧

光强度与对照组相比，P＜0.01)，呈剂量-效应关系；从各群细胞所占的比例来分

析，染毒剂量增加可引起Rh123+/PI-群细胞（正常细胞)减少，同时伴随Rh123-

/PI-群（凋亡早期细胞)和Rh123-/PI+群细胞（坏死细胞)增多（表5)，且均有统

计学意义（与对照组相比，P＜0.01)。从表5中可看出，不同浓度EGb预处理可

以保护TCE（2.0 mmol/L)引起的膜电位下降，各保护组Rh123荧光强度均高于

2.0 mmol/L TCE染毒组（P＜0.01)，Rh123-/PI-细胞群的比例均较TCE染毒阳

性组减少（与2.0 mmol/L TCE组比较，P＜0.01)。且当EGb浓度提高到100和

150 mg/L时，Rh123荧光强度、Rh123-/PI-细胞群的比例与正常对照组比较差

异无统计学意义（P＞0.05)。

2.5 剂量-效应关系的曲线拟合

对各指标结果进行单因素方差分析和组间两两比较，差异具有统计学意义。各指标

实测值与染毒剂量进行曲线拟合后，得到的曲线方程均为直线模式，即符合Y=

a+bX模式（Y为各指标的实测值，X为染毒剂量)，拟合优度系数R2均大于0.8，

P＜0.05，说明各指标在实验选择的剂量范围内，存在剂量-效应和时间-效应关系。

细胞线粒体是许多外来化学物最早累及，也是最有效的作用靶点［7］，可引起

ROS产生增多、细胞钙稳态失调、线粒体膜蛋白释放等一系列事件［8］，这些事

件或互为因果或相互协同，往往发生放大效应作用于细胞，因此检测线粒体的形态

功能变化情况可以反映细胞的早期功能状态和损伤状况，为机制研究提供第一手的

资料。银杏叶提取物制剂具有公认的抗氧化作用，研究发现它还能够保护线粒体功

能形态以及抗凋亡的作用，包括改善线粒体呼吸功能［9］、阻止衰老导致的线粒

体形态学改变、保护△Ψm的下降［10］、抑制线粒体cyt C的释放和caspase的

激活从而阻滞细胞凋亡的发生［11-12］，因此EGb被认为是线粒体和细胞损伤

有效的保护剂。

MTT法可检测细胞活力，同时该法也可间接反映线粒体酶的活性［13］。本研究

结果显示TCE染毒后线粒体酶活性抑制程度逐渐加重，细胞活力则逐渐下降，

EGb预处理后则起到明显的保护作用。细胞的能量代谢其实质是在线粒体中进行

的一系列由线粒体酶系所催化的氧化还原反应，产生的能量储存于ATP的高能磷

酸键中，线粒体酶活性的抑制将影响ATP的产生。由于ATP是ATP酶的唯一底

物，测定ATP酶的活性可从侧面反映出细胞内ATP的水平。本实验中，TCE处理

后细胞总ATP酶活性降低，表明细胞ATP生成减少，EGb保护组则能有效提高

ATP酶的活性。结合MTT的实验结果，提示TCE可直接作用于KC线粒体代谢酶

和呼吸功能，干扰细胞的能量代谢，引起ATP生成减少，而ATP量的多少又决定

细胞受损时是选择凋亡还是坏死的方式消亡［14］，因此这一作用在细胞损伤研

究中值得关注。

流式细胞术结合Rh123/PI双染法可反映△Ψm的变化情况以及细胞的存活状态

［15］。△Ψm是反映线粒体功能极为敏感指标，对细胞的存活和维持细胞的正常

功能至关重要［16］。在观察到经典的细胞凋亡特征之前，线粒体功能就已经发

生了改变，其中△Ψm的下降或崩溃被认为是不可逆的早期凋亡事件，抑制其下降

则可避免细胞进入凋亡，是细胞凋亡中有意义的限速步骤［17］。研究表明，

△Ψm的下降与由线粒体外膜、内膜蛋白构成的线粒体膜通透性转换孔

（mitochondrial permeability transition pores，MPTP)开放有关，MPTP一旦

持续性开放，大量物质涌入，破坏内膜两侧的电子梯度，△Ψm崩溃，呼吸链与氧

化磷酸化失偶联，影响细胞ATP产生、Ca2+稳态、活性氧的产量以及细胞色素C

的释放［8，18］，这些事件的发生与发展也会介导细胞凋亡。因此考察△Ψm的

变化在研究细胞凋亡中的意义不言而喻。本次研究结果显示，TCE可显著降低

△Ψm，且呈现一定的时间剂量效应关系。从细胞各群分布来看，随着TCE染毒剂

量的增大和时间的延长，正常细胞比例不断减少，进入早期凋亡状态的细胞不断增

多，提示线粒体膜电位的下降参与了这一细胞毒性作用。在进行了EGb预处理以

后，△Ψm较TCE染毒组明显提高，且随着EGb剂量的增加保护作用更为明显，

表明EGb对△Ψm的保护是其保护TCE所致的KC损伤和凋亡的重要机制。

综上，线粒体损伤在TCE所致的KC细胞损伤和凋亡中起到了重要的作用，而

EGb可以有效地保护TCE所引起的KC线粒体的损伤，提示EGb可以作为开发防

治TCE药疹样皮炎防护用品的重要候选物。当然，EGb成分复杂，具体是何种物

质还是几种物质协同作用才起到保护作用还有待进一步探究，此外其保护作用的机

制也需要进一步研究。

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