2023年12月7日发(作者：兰俏美)
“红米提取物”花青素类化合物测试报告
2012年8月2号接到云南瑞宝生物科技有限公司邮寄来的红米提取物S-HMT120731、紫甘薯提取物S-ZGT120730A、甘蓝提取物S-GT120730A、萝卜提取物S-LT120730A，其中除红米样品外的其他样品的测试工作仍未完成。
红米样品中已完成花青素的检测任务，具体工作内容及结果如下：
定性：采用制备色谱对样品中花青素进行分离纯化，收集纯化后的样品进行紫外光谱扫描（UV）、飞行时间多级质谱（MSn）检测，并将结果进行了数据解析，推测化合物结构。
定量：采用HPLC技术，外标法定量“红米样品”中三种花青素。
1. 研究方法
1.1 定性研究
1.1.1 仪器及试剂
WATERS 2695 高效液相色谱仪，配二极管矩阵检测器。
ESI-IT-TOF 质谱仪（Shimadzu公司，日本）。
岛津UV2550 紫外分光光度计。
甲醇，乙酸等。
1.1.2 样品溶液制备
称取红米样品400mg，用甲醇定容至10mL，配成质量浓度为40mg/mL的储备液，置于4℃冰箱中备用。
1.1.3实验条件
1.1.3.1制备色谱条件
制备色谱系统：色谱柱，C18，250mm×8 mm，粒径：20-40μm；流动相：V (甲醇) /V (水)/V (乙酸) = 40：60：0.5；检测波长：520 nm；进样体积：2.5 mL；进样量：100 mg；柱温：室温。
样品溶液分5次进样，每次2.5mL，收集保留时间为8.2，11.5和12.8min的三个流份。合并5次收集的流份，分别冷冻干燥，得三种花青素浓缩液，该浓缩液用于以下的质谱检测及紫外光谱扫描。
1.1.3.2 质谱条件
电喷雾电离：正离子模式喷雾电压4.5kV。加热模块（BH）温度200℃；曲形脱溶剂管（CDL）温度200℃。碰撞诱导解离（CID）参数: （1）碰撞能量：MS1～MS3，50%。（2）碰撞气比例：MS1～MS3, 50%。（3）碰撞时间：MS1～MS3，30ms。雾化气采用氮气（纯度≥99.5%），流速1.5L/min，检测器电压1.70kV。高纯（纯度≥99.99%）氩气作为CID碰撞气及冷却气。使用2.5mmol/L三氟醋酸钠溶液对正、负离子模式下m/z 100--1000范围的质量数进行校正。
使用自动采集模式，每一级质谱自动选择基峰离子作为下一级质谱的母离子进行碎裂。据分析由LCMS solution 3.41工作站完成。结合分子式预测软件（日本岛津公司）对多级质谱碎片作综合分析，得到化合物的分子式及碎片信息。
1.1.3.3 紫外扫描测试
将三种浓缩液分别配成约1mg/mL的水溶液在UV2550紫外/可见光度计上作1000-190nm全程扫描。花青素特征吸收峰为270-280nm与500-540 nm。
1.2 定量研究
1.2.1 仪器及试剂
WATERS 2695 高效液相色谱仪，配二极管矩阵检测器。
标准品飞燕草素葡萄糖苷，甲醇，乙腈，甲酸等。
1.2.2 溶液制备
样品溶液制备：称取红米样品60mg，用甲醇定容至10mL，配成质量浓度
1 为6mg/mL的储备液，置于4℃冰箱中备用。样品溶液0.22μm过滤膜过滤后用于液相色谱分析。
标准溶液制备：称取标准品飞燕草素葡萄糖苷1mg，用1mL甲醇溶解，配成质量浓度为1mg/mL的储备液，将上述储备液稀释至0.1mg/mL备用。样品溶液0.22μm过滤膜过滤后用于液相色谱分析。
1.2.3实验方法
1.2.3.1分析色谱条件
Diamonsil (钻石) C18色谱柱( 250 mm×4.6mm , 5μm)，流动相：A相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液，B相为0.1%（体积分数）甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序: 0~2min，90%A；2~9min，90%A→80%A；9~10min，80%A→70%A；10~12min，70%A→60%A；12~13min，60%A→55%A；13~14min，55%A→50%A；14~14.5min，50%A→80%A；14.5~16.5min，80%A ;16.5~30min，80%A→90%A。流速: 1.0 mL/min;
柱温: 35℃；检测波长范围: 520nm；进样量：20μL。
外标法定量
化合物色谱峰面积单点外标法计算出溶液浓度，从而计算出红米样品三种花青素的含量。
2. 图谱
45286mAU 7.07/ 1.00700nm
图1.化合物1（制备色谱8.2min）紫外扫描图
Inten.(x10,000,000)1.00.50.0100287.0527(1)227.98.32.1641(1)600725.8532700800897.240m/z449.1071(1)
图2. 化合物1（制备色谱8.2min）一级质谱图
Inten.(x10,000,000)287.0517(1)1.00.0118.1987213.0451.1074(1)40m/z
图3. 化合物1（制备色谱8.2min）二级质谱图
2 Inten.(x1,000,000)2.5287.0526(1)0.0100213..470001100m/z
图4. 化合物1（制备色谱8.2min）三级质谱图
mAU550 9.50/ 1.542792002170-551725nm
图5.化合物2（制备色谱11.5min）紫外扫描图
Inten.(x1,000,000)5.0463.1219(1)301.0686(1)378.32231.0518.8473(1)500600765.1693(1)71100m/z
图6. 化合物2（制备色谱11.5min）一级质谱图
1.00.1268(1)40m/zInten.(x10,000,000)301.0676(1)
图7. 化合物2（制备色谱11.5min）二级质谱图
Inten.(x1,000,000)2.01.00.0286.045655.7044258.0518201.100m/z
图8. 化合物2（制备色谱11.5min）三级质谱图
3 mAU 12.79/ 1.25435222nm
图9.化合物3（制备色谱12.5min）紫外扫描图
Inten.(x1,000,000)287.0530(1)2.50.0100227.98.3211400518.8480(1)500600686.964171100m/z
图10. 化合物3（制备色谱12.5min）一级质谱图
Inten.(x1,000,000)2.5288.0576(1)0.0100213.m/z
图11. 化合物3（制备色谱12.5min）二级质谱图
Inten.(x10,000)5.0129.07130.m/z
图12. 化合物3（制备色谱12.5min）三级质谱图
1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0-0.10.02.55.07.510.012.515.017.520.022.5min2mAU(x1,000)Extract-520nm,4nm (1.00)13
图11.红米样品溶液液相色谱图
4 3. 花青素组分解析结果
Λmax by
Compounds
HPLC-PDNo.
A(nm)
[M+H]+
Measured
(m/z)
Predicted
(m/z)
Error
(ppm)
Formula MS2 MS3
化合物含量（w/w）
化合物名称
1
525
280
449.1071 449.1078 -1.56 C21H20O11
175.0378（4.15）
185.0584（4.27）
287.0517 (100.00)
231.0618（5.82）
288.0535（17.29） 241.0448（4.68）287.0526(100.00)
288.0570（57.51）
230.0574(13.63)
258.0518(26.88)
268.0394(9.44)
286.0456(100.00)
301.0680(55.35)
302.0706(74.29)
58.48%
Cyanidin-3-O-gal
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
2
517
279
463.1219 463.1235 -3.45 C22H22O11
301.0676 (100.00)
286.0474(7.63)
3.25%
Malvidin-3-O-arab
锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷
3
524
275
287.0542 287.0550 -2.79 C15H10O6
213.0567(31.35)
241.0395(12.54)
288.0525(100.00)
137.0284(12.54)
--
0.91%
Cyanidin
矢车菊素
文献 C19H24O7Cl2
5
分子量：493 矢车菊素半乳糖苷
484.84 C21H21ClO11 CAS NUMBER: 27661-36-56
4. 结论
红米提取物S-HMT120731中含有三种花青素类化合物，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷及矢车菊素；三种花青素占红米提取物的质量百分含量：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷58.48%，锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷3.25%，矢车菊素0.91%。
5. 研究费用清单
测试项目
制备色谱制样
多级质谱
紫外光谱
液相色谱定量
试剂费
劳务费
总 计
单价（元/个）
1000元/次
2000元/个
100元/个
200元/个
2000元
1000元
样品个数/次数
5
3
3
5
标样及常规试剂
学生劳务费
15300元
合计（元）
5000
6000
300
1000
2000
1000
8
2023年12月7日发(作者：兰俏美)
“红米提取物”花青素类化合物测试报告
2012年8月2号接到云南瑞宝生物科技有限公司邮寄来的红米提取物S-HMT120731、紫甘薯提取物S-ZGT120730A、甘蓝提取物S-GT120730A、萝卜提取物S-LT120730A，其中除红米样品外的其他样品的测试工作仍未完成。
红米样品中已完成花青素的检测任务，具体工作内容及结果如下：
定性：采用制备色谱对样品中花青素进行分离纯化，收集纯化后的样品进行紫外光谱扫描（UV）、飞行时间多级质谱（MSn）检测，并将结果进行了数据解析，推测化合物结构。
定量：采用HPLC技术，外标法定量“红米样品”中三种花青素。
1. 研究方法
1.1 定性研究
1.1.1 仪器及试剂
WATERS 2695 高效液相色谱仪，配二极管矩阵检测器。
ESI-IT-TOF 质谱仪（Shimadzu公司，日本）。
岛津UV2550 紫外分光光度计。
甲醇，乙酸等。
1.1.2 样品溶液制备
称取红米样品400mg，用甲醇定容至10mL，配成质量浓度为40mg/mL的储备液，置于4℃冰箱中备用。
1.1.3实验条件
1.1.3.1制备色谱条件
制备色谱系统：色谱柱，C18，250mm×8 mm，粒径：20-40μm；流动相：V (甲醇) /V (水)/V (乙酸) = 40：60：0.5；检测波长：520 nm；进样体积：2.5 mL；进样量：100 mg；柱温：室温。
样品溶液分5次进样，每次2.5mL，收集保留时间为8.2，11.5和12.8min的三个流份。合并5次收集的流份，分别冷冻干燥，得三种花青素浓缩液，该浓缩液用于以下的质谱检测及紫外光谱扫描。
1.1.3.2 质谱条件
电喷雾电离：正离子模式喷雾电压4.5kV。加热模块（BH）温度200℃；曲形脱溶剂管（CDL）温度200℃。碰撞诱导解离（CID）参数: （1）碰撞能量：MS1～MS3，50%。（2）碰撞气比例：MS1～MS3, 50%。（3）碰撞时间：MS1～MS3，30ms。雾化气采用氮气（纯度≥99.5%），流速1.5L/min，检测器电压1.70kV。高纯（纯度≥99.99%）氩气作为CID碰撞气及冷却气。使用2.5mmol/L三氟醋酸钠溶液对正、负离子模式下m/z 100--1000范围的质量数进行校正。
使用自动采集模式，每一级质谱自动选择基峰离子作为下一级质谱的母离子进行碎裂。据分析由LCMS solution 3.41工作站完成。结合分子式预测软件（日本岛津公司）对多级质谱碎片作综合分析，得到化合物的分子式及碎片信息。
1.1.3.3 紫外扫描测试
将三种浓缩液分别配成约1mg/mL的水溶液在UV2550紫外/可见光度计上作1000-190nm全程扫描。花青素特征吸收峰为270-280nm与500-540 nm。
1.2 定量研究
1.2.1 仪器及试剂
WATERS 2695 高效液相色谱仪，配二极管矩阵检测器。
标准品飞燕草素葡萄糖苷，甲醇，乙腈，甲酸等。
1.2.2 溶液制备
样品溶液制备：称取红米样品60mg，用甲醇定容至10mL，配成质量浓度
1 为6mg/mL的储备液，置于4℃冰箱中备用。样品溶液0.22μm过滤膜过滤后用于液相色谱分析。
标准溶液制备：称取标准品飞燕草素葡萄糖苷1mg，用1mL甲醇溶解，配成质量浓度为1mg/mL的储备液，将上述储备液稀释至0.1mg/mL备用。样品溶液0.22μm过滤膜过滤后用于液相色谱分析。
1.2.3实验方法
1.2.3.1分析色谱条件
Diamonsil (钻石) C18色谱柱( 250 mm×4.6mm , 5μm)，流动相：A相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液，B相为0.1%（体积分数）甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序: 0~2min，90%A；2~9min，90%A→80%A；9~10min，80%A→70%A；10~12min，70%A→60%A；12~13min，60%A→55%A；13~14min，55%A→50%A；14~14.5min，50%A→80%A；14.5~16.5min，80%A ;16.5~30min，80%A→90%A。流速: 1.0 mL/min;
柱温: 35℃；检测波长范围: 520nm；进样量：20μL。
外标法定量
化合物色谱峰面积单点外标法计算出溶液浓度，从而计算出红米样品三种花青素的含量。
2. 图谱
45286mAU 7.07/ 1.00700nm
图1.化合物1（制备色谱8.2min）紫外扫描图
Inten.(x10,000,000)1.00.50.0100287.0527(1)227.98.32.1641(1)600725.8532700800897.240m/z449.1071(1)
图2. 化合物1（制备色谱8.2min）一级质谱图
Inten.(x10,000,000)287.0517(1)1.00.0118.1987213.0451.1074(1)40m/z
图3. 化合物1（制备色谱8.2min）二级质谱图
2 Inten.(x1,000,000)2.5287.0526(1)0.0100213..470001100m/z
图4. 化合物1（制备色谱8.2min）三级质谱图
mAU550 9.50/ 1.542792002170-551725nm
图5.化合物2（制备色谱11.5min）紫外扫描图
Inten.(x1,000,000)5.0463.1219(1)301.0686(1)378.32231.0518.8473(1)500600765.1693(1)71100m/z
图6. 化合物2（制备色谱11.5min）一级质谱图
1.00.1268(1)40m/zInten.(x10,000,000)301.0676(1)
图7. 化合物2（制备色谱11.5min）二级质谱图
Inten.(x1,000,000)2.01.00.0286.045655.7044258.0518201.100m/z
图8. 化合物2（制备色谱11.5min）三级质谱图
3 mAU 12.79/ 1.25435222nm
图9.化合物3（制备色谱12.5min）紫外扫描图
Inten.(x1,000,000)287.0530(1)2.50.0100227.98.3211400518.8480(1)500600686.964171100m/z
图10. 化合物3（制备色谱12.5min）一级质谱图
Inten.(x1,000,000)2.5288.0576(1)0.0100213.m/z
图11. 化合物3（制备色谱12.5min）二级质谱图
Inten.(x10,000)5.0129.07130.m/z
图12. 化合物3（制备色谱12.5min）三级质谱图
1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0-0.10.02.55.07.510.012.515.017.520.022.5min2mAU(x1,000)Extract-520nm,4nm (1.00)13
图11.红米样品溶液液相色谱图
4 3. 花青素组分解析结果
Λmax by
Compounds
HPLC-PDNo.
A(nm)
[M+H]+
Measured
(m/z)
Predicted
(m/z)
Error
(ppm)
Formula MS2 MS3
化合物含量（w/w）
化合物名称
1
525
280
449.1071 449.1078 -1.56 C21H20O11
175.0378（4.15）
185.0584（4.27）
287.0517 (100.00)
231.0618（5.82）
288.0535（17.29） 241.0448（4.68）287.0526(100.00)
288.0570（57.51）
230.0574(13.63)
258.0518(26.88)
268.0394(9.44)
286.0456(100.00)
301.0680(55.35)
302.0706(74.29)
58.48%
Cyanidin-3-O-gal
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷
2
517
279
463.1219 463.1235 -3.45 C22H22O11
301.0676 (100.00)
286.0474(7.63)
3.25%
Malvidin-3-O-arab
锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷
3
524
275
287.0542 287.0550 -2.79 C15H10O6
213.0567(31.35)
241.0395(12.54)
288.0525(100.00)
137.0284(12.54)
--
0.91%
Cyanidin
矢车菊素
文献 C19H24O7Cl2
5
分子量：493 矢车菊素半乳糖苷
484.84 C21H21ClO11 CAS NUMBER: 27661-36-56
4. 结论
红米提取物S-HMT120731中含有三种花青素类化合物，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷及矢车菊素；三种花青素占红米提取物的质量百分含量：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷58.48%，锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷3.25%，矢车菊素0.91%。
5. 研究费用清单
测试项目
制备色谱制样
多级质谱
紫外光谱
液相色谱定量
试剂费
劳务费
总 计
单价（元/个）
1000元/次
2000元/个
100元/个
200元/个
2000元
1000元
样品个数/次数
5
3
3
5
标样及常规试剂
学生劳务费
15300元
合计（元）
5000
6000
300
1000
2000
1000
8