2024年2月17日发(作者：饶宛)
奥林巴斯荧光显微镜使用说明和注意事项
1、 初次使用者事先要经过培训。
2、 该显微镜有2套拍照系统；传统胶卷拍照和数码拍照。根据需要可更换相应的附件。
3、 该镜可作为明视场显微镜使用，也可作为荧光显微镜使用，根据需要，做相应的附件连接，开启相应的电源。禁止乱调设置，以免影响他人正常使用。
4、 作为明视场显微镜使用；A、接通电源后，打开显微镜底座前的电源开关，按光亮需要调节底座右侧的滑竿。B、根据需要，调节底座光栅和聚光器光栅及其高度，可获得最佳的图象效果。C、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。
5、 作为荧光显微镜使用；A、先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。B、等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。C、关闭显微镜光源，打开荧光通道。D、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。
注意事项：
1、 不要污染物镜镜头。一旦污染，先用擦镜纸擦除一遍，再用显微镜专用擦洗液擦洗，最后用镜纸再擦一遍。用油镜镜头后，以同样方法擦洗。
2、 关闭显微镜电源前，先把光源调到最低。
3、 用过荧光镜的，注意清洁载物台，防止有害有毒致癌物污染。
4、 结束工作，关闭所有电源，清洁工作台和房间。
5、 发现漏电和其他故障，及时报告。
荧光显微镜操作程序
1. 开机：
1.1. 打开房间总电源开关
1.2. 打开电脑电源开关
1.3. 打开数码相机电源开关
1.4. 打开显微镜电源开关（打开汞灯电源开关）
2. 调试显微镜光路：
2.1. 把载玻片放到载物台上。调节聚焦。
2.2. 根据物镜指数乘0.8确定聚光镜光圈值，调整到位。
2.3. 将视场光阑缩小，然后调节聚光镜高度，直到从目镜中观察到视场光阑的清晰成像。
2.4. 放大视场光阑，使其在目镜中的黑框扩展到视野以外。
3. 调试数码相机拍摄照片：
3.1. 在显微镜取景器中对好视野及焦距。
3.2. 打开photoshop程序。
3.3. 点击 “文件 -- 自动„。”调出相机控制窗口。
3.4. ZOOM定为77。拍摄图片格式为640*480。
3.5. 在相机控制窗口上点preview，观察预览图象的亮度。选择适当的曝光时间使预览图片的亮度合适。
3.6. 点拍摄按纽拍摄，等待几秒钟后图片传回电脑并在photoshop窗口里显示。
3.7. 继续拍摄下一张照片。
3.8. 拍摄十来张照片后要及时保存照片。
3.9. 先关闭相机控制按纽。并保存拍摄条件到默认值。
3.10. 在photoshop中保存刚拍摄的照片到指定文件夹中，保存后要关闭照片。
3.11. 保存并关闭全部照片后重新打开相机控制窗口继续拍摄。
3.12. 拍摄全部完成后保存所拍摄的照片。需要时将照片通过网络上传到校园网服务器上，不能使用U盘或软盘转移文件。或者将照片文件刻录到光盘上。
4. 关机：
4.1. 关闭显微镜电源。
4.2. 关闭汞灯电源。
4.3. 关闭数码相机电源。
4.4. 关闭电脑时点“重新启动电脑”，待电脑进入关闭状态并重新启动时按电脑电源开关强制关机。注意不能直接点击“关闭电脑”。
4.5. 关闭房间电源总开关。
体视荧光显微镜使用方法与注意事项
使用方法：
(1)将材料片放在载物台上。
(2)开启荧光显微镜稳压器．然后按下启动组点燃紫外灯15min内不得关闭，关闭后3min内不得再启动。
(3)将激发滤光片转至v，分色片调到v，选用495或475nm阻挡滤光片。
(4)选用uvFL40、uvFL100荧光接物镜镜检。
(5)在玻片上加无荧光油，先用40 x，再用100 x调焦镜检．呈现荧光。
(7)因荧光物质受紫外光照射时随时间的增长荧光逐渐变弱，因此镜检时应经常变换视野。
(8)亦可用uvFL10或uvFL20低倍镜镜检材料(用低倍镜时不加无荧光油)。
荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。
（四）封裱剂
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。
（五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
使用荧光显微镜的注意事项
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。
荧光图像的记录方法
荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。
荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。
荧光染料的使用
吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。
EB:染色DNA和RNA
荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。 一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原 生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力 的原生质体不能分解FAD无荧光产生。5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用 时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时,使最终浓度为0.01%。
荧光染料Ho33342和若丹明123: 活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。
荧光组化实验中应注意的几个问题
1．每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。
2．一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。
3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。
4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
荧光染料:
荧光染料
fluorescent dye
泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质
能发出荧光的染料。
在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。例如，酸性曙红、荧光黄、红汞以及某些分散染料等。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。
荧光染料 容易用于荧光染料产品,渗漏探测!
用于增白洗衣粉中的增白剂，指示信号用的各种荧光路标漆，荧光标志服等。
荧光染料用于: 渗漏污水系统 水和工业的污染物 连接系统 测量发电厂排出的液体 洗手间的渗漏 非法的连接污水管监察，研究流量和绘图 分析腐败的系统，除用于纤维织物印染外，还可用作某些特种标志（如暗处符号）及军事追踪等。
细胞核荧光染料(PI DAPI Hoechst33342)2010年07月12日02：18细胞核荧光染料PI碘化丙啶(简称PI)是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但PI能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而将细胞核染红，PI在绿色光(540nm波长)的激发下，会在600nm(红色光)处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光，与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍。
2024年2月17日发(作者：饶宛)
奥林巴斯荧光显微镜使用说明和注意事项
1、 初次使用者事先要经过培训。
2、 该显微镜有2套拍照系统；传统胶卷拍照和数码拍照。根据需要可更换相应的附件。
3、 该镜可作为明视场显微镜使用，也可作为荧光显微镜使用，根据需要，做相应的附件连接，开启相应的电源。禁止乱调设置，以免影响他人正常使用。
4、 作为明视场显微镜使用；A、接通电源后，打开显微镜底座前的电源开关，按光亮需要调节底座右侧的滑竿。B、根据需要，调节底座光栅和聚光器光栅及其高度，可获得最佳的图象效果。C、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。
5、 作为荧光显微镜使用；A、先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。B、等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。C、关闭显微镜光源，打开荧光通道。D、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。
注意事项：
1、 不要污染物镜镜头。一旦污染，先用擦镜纸擦除一遍，再用显微镜专用擦洗液擦洗，最后用镜纸再擦一遍。用油镜镜头后，以同样方法擦洗。
2、 关闭显微镜电源前，先把光源调到最低。
3、 用过荧光镜的，注意清洁载物台，防止有害有毒致癌物污染。
4、 结束工作，关闭所有电源，清洁工作台和房间。
5、 发现漏电和其他故障，及时报告。
荧光显微镜操作程序
1. 开机：
1.1. 打开房间总电源开关
1.2. 打开电脑电源开关
1.3. 打开数码相机电源开关
1.4. 打开显微镜电源开关（打开汞灯电源开关）
2. 调试显微镜光路：
2.1. 把载玻片放到载物台上。调节聚焦。
2.2. 根据物镜指数乘0.8确定聚光镜光圈值，调整到位。
2.3. 将视场光阑缩小，然后调节聚光镜高度，直到从目镜中观察到视场光阑的清晰成像。
2.4. 放大视场光阑，使其在目镜中的黑框扩展到视野以外。
3. 调试数码相机拍摄照片：
3.1. 在显微镜取景器中对好视野及焦距。
3.2. 打开photoshop程序。
3.3. 点击 “文件 -- 自动„。”调出相机控制窗口。
3.4. ZOOM定为77。拍摄图片格式为640*480。
3.5. 在相机控制窗口上点preview，观察预览图象的亮度。选择适当的曝光时间使预览图片的亮度合适。
3.6. 点拍摄按纽拍摄，等待几秒钟后图片传回电脑并在photoshop窗口里显示。
3.7. 继续拍摄下一张照片。
3.8. 拍摄十来张照片后要及时保存照片。
3.9. 先关闭相机控制按纽。并保存拍摄条件到默认值。
3.10. 在photoshop中保存刚拍摄的照片到指定文件夹中，保存后要关闭照片。
3.11. 保存并关闭全部照片后重新打开相机控制窗口继续拍摄。
3.12. 拍摄全部完成后保存所拍摄的照片。需要时将照片通过网络上传到校园网服务器上，不能使用U盘或软盘转移文件。或者将照片文件刻录到光盘上。
4. 关机：
4.1. 关闭显微镜电源。
4.2. 关闭汞灯电源。
4.3. 关闭数码相机电源。
4.4. 关闭电脑时点“重新启动电脑”，待电脑进入关闭状态并重新启动时按电脑电源开关强制关机。注意不能直接点击“关闭电脑”。
4.5. 关闭房间电源总开关。
体视荧光显微镜使用方法与注意事项
使用方法：
(1)将材料片放在载物台上。
(2)开启荧光显微镜稳压器．然后按下启动组点燃紫外灯15min内不得关闭，关闭后3min内不得再启动。
(3)将激发滤光片转至v，分色片调到v，选用495或475nm阻挡滤光片。
(4)选用uvFL40、uvFL100荧光接物镜镜检。
(5)在玻片上加无荧光油，先用40 x，再用100 x调焦镜检．呈现荧光。
(7)因荧光物质受紫外光照射时随时间的增长荧光逐渐变弱，因此镜检时应经常变换视野。
(8)亦可用uvFL10或uvFL20低倍镜镜检材料(用低倍镜时不加无荧光油)。
荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。
（四）封裱剂
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。
（五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
使用荧光显微镜的注意事项
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。
荧光图像的记录方法
荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。
荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。
荧光染料的使用
吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。
EB:染色DNA和RNA
荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。 一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原 生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力 的原生质体不能分解FAD无荧光产生。5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用 时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时,使最终浓度为0.01%。
荧光染料Ho33342和若丹明123: 活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。
荧光组化实验中应注意的几个问题
1．每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。
2．一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。
3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。
4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
荧光染料:
荧光染料
fluorescent dye
泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质
能发出荧光的染料。
在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。例如，酸性曙红、荧光黄、红汞以及某些分散染料等。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。
荧光染料 容易用于荧光染料产品,渗漏探测!
用于增白洗衣粉中的增白剂，指示信号用的各种荧光路标漆，荧光标志服等。
荧光染料用于: 渗漏污水系统 水和工业的污染物 连接系统 测量发电厂排出的液体 洗手间的渗漏 非法的连接污水管监察，研究流量和绘图 分析腐败的系统，除用于纤维织物印染外，还可用作某些特种标志（如暗处符号）及军事追踪等。
细胞核荧光染料(PI DAPI Hoechst33342)2010年07月12日02：18细胞核荧光染料PI碘化丙啶(简称PI)是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但PI能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而将细胞核染红，PI在绿色光(540nm波长)的激发下，会在600nm(红色光)处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光，与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍。