2024年2月27日发(作者：仉蕴)
二次谐波结合双光子荧光成像方法观察人源胶原蛋白透皮吸收情况
孙娅楠;赵静;李超华;刘珏玲;李松林;陈辉;孙桂荣;王毅
【摘 要】目的:用二次谐波成像结合双光子荧光成像的方法观察人源胶原蛋白透皮吸收的情况.方法:将荧光标记的人源胶原蛋白(1 mg/mL)涂抹于小鼠表皮层经皮肤吸收1h后用背向二次谐波观察皮肤内胶原纤维作为真皮层定位标志,用双光子扫描共聚焦显微镜观察人源胶原蛋白透皮吸收深度,吸收方式.结果:二次谐波成像结合双光子荧光成像表明人源胶原蛋白透皮吸收1h后可观察到荧光信号沿着毛囊聚集,并有部分荧光分子由毛囊扩散至真皮层.结论:二次谐波可以更快速,更灵敏地检测皮肤中的胶原纤维,以此作为检测物质透皮吸收深度的定位标志,具有不受荧光信号干扰的优点.人源胶原蛋白可以沿着毛囊进入真皮层,并从毛囊中扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维.%Objective:Second harmonic generation imaging
(SHG) and two-photon fluorescence imaging were combined to trace the
transdermal absorption and distribution of Re-combinant human collagen
(R-hc) in mice :After applied the R-hc (1mg/mL) for 1 hour,the
mice skin was cut off at 2 cm × 2 cm for further location
of collagen fibers in the skin were observed by using the backwards SHG
as the dermal layer process of transdermal absorption and
observation of R-hc were traced by two photon :The
SHG combined with two-photon fluorescence imaging showed that the
fluorescence signal of R-hc was gathered along the hair follicle and some
fluorescent molecules diffused from the hair follicle to the dermis after
transdermal absorption for 1 sion:SHG can provide faster and
more sensitive detection of skin collagen fibers,which can be used as the
depth marker of the transdermal absorption of the test substance without
interfering with the fluorescence collagen can enter the
dermis along the hair follicle,and replenish to the collagen fiber layer in the
skin.
【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2017(026)001
【总页数】6页(P24-29)
【关键词】二次谐波;荧光成像;皮肤;胶原;透皮吸收
【作 者】孙娅楠;赵静;李超华;刘珏玲;李松林;陈辉;孙桂荣;王毅
【作者单位】中国中医科学院医学实验中心,北京100700;中国中医科学院医学实验中心,北京100700;中国中医科学院医学实验中心,北京100700;中国中医科学院医学实验中心,北京100700;天津伊瑞雅生物科技有限公司,天津300399;北京急救中心,北京100031;天津伊瑞雅生物科技有限公司,天津300399;中国中医科学院医学实验中心,北京100700
【正文语种】中 文
【中图分类】Q512
物质透皮途径主要有三条：角质层、毛囊及汗管。其中，后两条通路经常被称为“旁路”，因为皮肤附属器官与整个皮肤表面积相比，仅占1%以下，故在大多数情况下不成为主要吸收途径，但大分子物质及离子型物质难以通过富含类脂的角质层，可能经由这些途径进入皮肤。
对于透皮吸收物质的探测，主要有体内方法和体外方法，体内方法包括化学测定(检查物质吸收入血的量)、组织检察(检察用药后组织结构的变化)、同位素示踪(用同位素标定药物，观察其透皮后的吸收分布)；体外方法包括各种静态或流通的扩散小室，观察药物能否透过皮片。但无论是体内还是体外的方法，都不能动态观察待测物质吸收的动态过程、进入皮肤的途径、在皮肤内分布的部位及范围，而这些指标对于美容护肤类产品的品质评估至关重要。化妆品中的透皮吸收与药物透过皮肤进入体循环具有本质的不同，其指的是化妆品中的功能性成分作用于皮肤表面或进入表皮或真皮并在该部位聚集和发挥作用的功效，因此明确美容护肤类产品作用于皮肤的部位有助于分析其功效。即使在医药研究领域，已有的组织定位观察方法如病理切片法，虽可以明确样品的病理信息，但无法在切片上标示大分子药物的位置信息。透皮吸收仪作为传统的研究透吸收作用的仪器，不能动态观察药物进入皮肤的位置与滞留情况[1,12]。
二次谐波(second harmonic generation，SHG)是光与介质的相互作用产生的二次非线性光学过程，其信号强度与激发光强度平方成线性关系[2]。在生物组织中，具有长程非中心对称的分子可以产生很强的SHG，如胶原、弹力纤维、纺锤体等[3,4]。在皮肤组织中，胶原主要存在于真皮层，因此，我们利用真皮层中胶原的SHG信号做为皮肤组织的结构内参，观察荧光标记的胶原蛋白经皮吸收的过程及聚集部位，荧光信号与SHG信号没有叠加，表征清晰，直观准确地反映胶原类物质透皮吸收的途径及作用部位，操作简便，快速准确，为透皮吸收的药品及美容产品的活性检测提供新的检测方法。
1.1 材料
基因工程菌表达的人源胶原蛋白(re-combinant human collagen, R-hc)，天津伊瑞雅生物科技有限公司(生产批号2005-03-18)；BALB/c小鼠，(20±2) g，北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2012-0001)；用于胶原蛋白
标记的荧光分子iFluorTM350 succinimidyl ester，AAT Bioquest，激发/发射波长(346 nm/443 nm)；双光子共聚焦扫描显微镜，Olympus(FV1000)，Mai Tai
DeepSee 激光器(120 fs，80 MHz)。
1.2 样品制备
1.2.1 荧光标记R-hc
精密称取R-hc干粉100 mg，向胶原蛋白中加入磷酸盐缓冲液10 mL充分溶解，用1 mol/L NaHCO3溶液调PH 8.5±0.5。向iFluorTM350中(1 mg)加入无水DMSO 1 mL得到1 mg/mL的染液。磁力搅拌器边搅拌边将荧光染液逐滴加入蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在20 min内加完)，加完后，继续避光搅拌12 h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4 ℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移入4 ℃冰箱中。将荧光标记后的蛋白取出放入透析袋中，置入避光含有超纯水的大烧杯中，每4 h换一次水，至超纯水中检测无荧光时停止透析。将荧光蛋白取出，冷冻干燥成粉末，待用。
采用5%浓缩胶，10%分离胶，R-hc和荧光标记R-hc(iFluorTM350-Re-combinant human collagen，iF-R-hc)的上样量为50 μg, 上样体积为20 μL，80 V电压下电泳150 min。电泳结束后，先用紫外光(365 nm)观察荧光条带，再经考马斯亮蓝染色后，白光下观察蛋白条带，依据荧光条带及蛋白条带与蛋白Marker的相对位置能够确定蛋白是否被荧光探针成功标记。
1.2.2 皮肤组织选取
小鼠麻醉后剃去背部毛发，将iF-R-hc溶液(1 mg/mL)均匀涂抹于已暴露的背部皮肤组织，避光，室温条件下待其皮肤自然吸收1 h后取下2 cm×2 cm全层皮肤组织，平铺于载玻片上。将全层皮肤组织置于双光子扫描共聚焦显微镜下进行图像采集。采集后皮肤做常规脱水、包埋、切片后进行HE染色。用Image Pro Plus 6.0软件图像处理，以基底层为起点，皮下组织与真皮层衔接处为终点，测量真皮层平
均厚度。
1.3 皮肤组织的SHG及双光子荧光成像
SHG成像与双光子荧光成像均从背向收集信号，SHG激发波长950 nm，双光子荧光激发波长750 nm，激发光由物镜聚焦到样品上，产生的背向SHG信号与荧光信号由同一个物镜25倍数值孔径为1.05的水浸显微镜物镜来收集，双光子荧光通道使用高通滤波片，波长范围420-460 nm；在SHG通道使用窄带滤波片，波长范围465-485 nm，组织做全层Z轴扫描，步进5 μm，图像采集速度10
μm/pixel，将所得图像进行Imaris 7.4.2图像渲染处理，红色为SHG成像，蓝色为荧光成像。
2.1 R-hc荧光标记
A为考马斯亮蓝凝胶成像，B为紫外光下观察荧光条带图。由图A可见R-hc分子量在58 kD左右，图B显示其荧光标记成功，且标记过程对其分子量大小无显著影响。
2.2 利用SHG成像结合双光子扫描成像观察R-hc经皮吸收的情况
胶原主要存在于皮肤的真皮层中， 是真皮的支撑结构， 其网状架构为皮肤提供了保护和弹性(图2B)，在纤维之间则分布着大量的水分、细胞外基质和功能性细胞，是皮肤重要的生化反应场所，为表皮层提供水分和营养。小鼠皮肤的HE染色结果显示(图2A)，从表皮基底层到皮下组织，即真皮层平均厚度在158 μm左右，胶原蛋白层应存在于此区域中。
给小鼠皮肤涂抹iF-R-hc 1 h后取小鼠皮肤进行观察，SHG成像结果显示，小鼠皮肤本底胶原蛋白SHG信号较强，由前期研究表明[3]其可能为I型胶原纤维，位于皮下100 μm左右的真皮层中(图3A)，分布有毛囊结构的空腔(箭头所示)。
外源iF-R-hc双光子扫描成像结果显示(图3B)，该蛋白主要集中于毛囊内，但已有一点蛋白从毛囊扩散到真皮层内(如3E，3F箭头所示)，该蛋白聚集的位置在图
3C叠加图中可清晰显示。从图3D纵向剖面图中可以看出，外源iF-R-hc与内源胶原开始于同一深度并沿毛囊向下延伸，其深度可达150 μm，但未超过真皮层厚度。
皮肤组织中具有非常丰富的自发荧光，如表皮中的角蛋白，上皮细胞中的NADH，上皮组织中的胶原蛋白和弹性蛋白等[10]。这些荧光信号虽可被双光子显微镜所收集但易与样品标记的荧光信号相混淆不适合作为内参进行样品的皮肤吸收定位。SHG信号是生物组织原发性信号，因为没有能量吸收，从而消除了光毒性、光损伤和光漂白性，可以长时间的追踪活细胞组织的生理活动过程。SHG信号具有高度的方向性，能反映出样品内部的细微结构，其光强度与激发光强度平方成正比，光谱宽度在飞秒激光下理论上只有10 nm，利用窄波带通滤光片可以有效排除荧光的干扰[5]。 在生物组织中，胶原、微管、微丝等结构蛋白能够产生很强的SHG信号。
皮肤组织分为表皮、真皮、皮下组织三部分，是人体表面积最大的器官，由蛋白质、核酸、糖、辅酶等成分组成，主要承担着保护体内器官和组织、 排汗、感觉冷热和压力等功能[6]。真皮层来源于中胚层，由纤维、基质、细胞构成，其中I型胶原纤维为真皮的主要构成成分，约占95%，集合成束状。在乳头层纤维束较细，排列紧密，走行方向不一，不互相交织。它具有强烈的二阶非线性极化率和结构非中心对称性，是生物组织中能够产生SHG信号的重要物质[12]。
化妆品中的透皮吸收指的是化妆品中的功能性成分按产品的有效性作用于皮肤表面或进入表皮或真皮并在该部位聚集和发挥作用的功效。其透皮吸收与药物的主要区别在于不需要透过皮肤进入体循环[7]。例如，美白产品中的美白剂需要透过角质层作用于表皮中的基底层，阻断黑色素的产生。体外补充胶原蛋白使其进入真皮层补充体内的胶原纤维，恢复皮肤的弹性。现有的研究化妆品中的有效成分透皮吸收的技术如最常用的扩散池法不能动态观察被检测物在皮肤各层聚集的情况；分光镜
法由于光透入角质层的深度有限其仅能检测表皮部分透过情况；电镜法、功效检测法、剩余量法都是通过回推间接反应其透皮吸收情况不能做到准确检测。因此需要一种简单、直观、不影响待检测样品性状的检测方法。
本研究采用荧光标记的方法将R-hc标记上荧光探针涂抹于小鼠皮肤表皮层，经皮吸收1小时后，采用双光子扫描共聚焦显微镜结合SHG成像进行逐层扫描。结果显示皮肤真皮层I型胶原纤维SHG信号在皮下的深度可达100 μm，同层面亦可检测到荧光信号，且荧光信号深达皮下 150 μm。结合HE染色结果表明所采集信号深度未超过真皮层厚度。将本研究所得图像进行叠加和Imaris渲染，可以观察到荧光信号沿着毛囊聚集，表明R-hc可以沿着毛囊进入真皮层，并在经皮吸收1
h后可由毛囊扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维。虽然皮肤附属器官与整个皮肤表面积相比，仅占1 %以下， 在大多数情况下不是主要吸收途径， 但大分子物质及离子型物质难以通过富含类脂的角质层， 可能经由这些途径进入皮肤[8,9]。
在本研究中， 我们通过荧光标记结合SHG的定位， 直观准确的确定了分子量为58 kD左右的胶原蛋白可以透皮吸收入真皮层， 为该蛋白在护肤品中的进一步应用提供了数据支持。
在下一步的研究中， 我们将继续利用双光子扫描显微镜的优势， 在iF-R-hc透皮吸收时相、在皮肤中存留时间、降解后的去向问题做进一步的研究， 同时， 我们也将探讨直接用活体动物观察R-hc的透皮吸收过程， 为透皮吸收的药品及美容产品的活性检测提供新的检测方法和分析手段。
*通讯作者： 王毅(1971-)，女，满，吉林，研究员，博士，主要从事光学成像技术在中医药领域中的应用。(电子邮箱)***********************
【相关文献】
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2024年2月27日发(作者：仉蕴)
二次谐波结合双光子荧光成像方法观察人源胶原蛋白透皮吸收情况
孙娅楠;赵静;李超华;刘珏玲;李松林;陈辉;孙桂荣;王毅
【摘 要】目的:用二次谐波成像结合双光子荧光成像的方法观察人源胶原蛋白透皮吸收的情况.方法:将荧光标记的人源胶原蛋白(1 mg/mL)涂抹于小鼠表皮层经皮肤吸收1h后用背向二次谐波观察皮肤内胶原纤维作为真皮层定位标志,用双光子扫描共聚焦显微镜观察人源胶原蛋白透皮吸收深度,吸收方式.结果:二次谐波成像结合双光子荧光成像表明人源胶原蛋白透皮吸收1h后可观察到荧光信号沿着毛囊聚集,并有部分荧光分子由毛囊扩散至真皮层.结论:二次谐波可以更快速,更灵敏地检测皮肤中的胶原纤维,以此作为检测物质透皮吸收深度的定位标志,具有不受荧光信号干扰的优点.人源胶原蛋白可以沿着毛囊进入真皮层,并从毛囊中扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维.%Objective:Second harmonic generation imaging
(SHG) and two-photon fluorescence imaging were combined to trace the
transdermal absorption and distribution of Re-combinant human collagen
(R-hc) in mice :After applied the R-hc (1mg/mL) for 1 hour,the
mice skin was cut off at 2 cm × 2 cm for further location
of collagen fibers in the skin were observed by using the backwards SHG
as the dermal layer process of transdermal absorption and
observation of R-hc were traced by two photon :The
SHG combined with two-photon fluorescence imaging showed that the
fluorescence signal of R-hc was gathered along the hair follicle and some
fluorescent molecules diffused from the hair follicle to the dermis after
transdermal absorption for 1 sion:SHG can provide faster and
more sensitive detection of skin collagen fibers,which can be used as the
depth marker of the transdermal absorption of the test substance without
interfering with the fluorescence collagen can enter the
dermis along the hair follicle,and replenish to the collagen fiber layer in the
skin.
【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2017(026)001
【总页数】6页(P24-29)
【关键词】二次谐波;荧光成像;皮肤;胶原;透皮吸收
【作 者】孙娅楠;赵静;李超华;刘珏玲;李松林;陈辉;孙桂荣;王毅
【作者单位】中国中医科学院医学实验中心,北京100700;中国中医科学院医学实验中心,北京100700;中国中医科学院医学实验中心,北京100700;中国中医科学院医学实验中心,北京100700;天津伊瑞雅生物科技有限公司,天津300399;北京急救中心,北京100031;天津伊瑞雅生物科技有限公司,天津300399;中国中医科学院医学实验中心,北京100700
【正文语种】中 文
【中图分类】Q512
物质透皮途径主要有三条：角质层、毛囊及汗管。其中，后两条通路经常被称为“旁路”，因为皮肤附属器官与整个皮肤表面积相比，仅占1%以下，故在大多数情况下不成为主要吸收途径，但大分子物质及离子型物质难以通过富含类脂的角质层，可能经由这些途径进入皮肤。
对于透皮吸收物质的探测，主要有体内方法和体外方法，体内方法包括化学测定(检查物质吸收入血的量)、组织检察(检察用药后组织结构的变化)、同位素示踪(用同位素标定药物，观察其透皮后的吸收分布)；体外方法包括各种静态或流通的扩散小室，观察药物能否透过皮片。但无论是体内还是体外的方法，都不能动态观察待测物质吸收的动态过程、进入皮肤的途径、在皮肤内分布的部位及范围，而这些指标对于美容护肤类产品的品质评估至关重要。化妆品中的透皮吸收与药物透过皮肤进入体循环具有本质的不同，其指的是化妆品中的功能性成分作用于皮肤表面或进入表皮或真皮并在该部位聚集和发挥作用的功效，因此明确美容护肤类产品作用于皮肤的部位有助于分析其功效。即使在医药研究领域，已有的组织定位观察方法如病理切片法，虽可以明确样品的病理信息，但无法在切片上标示大分子药物的位置信息。透皮吸收仪作为传统的研究透吸收作用的仪器，不能动态观察药物进入皮肤的位置与滞留情况[1,12]。
二次谐波(second harmonic generation，SHG)是光与介质的相互作用产生的二次非线性光学过程，其信号强度与激发光强度平方成线性关系[2]。在生物组织中，具有长程非中心对称的分子可以产生很强的SHG，如胶原、弹力纤维、纺锤体等[3,4]。在皮肤组织中，胶原主要存在于真皮层，因此，我们利用真皮层中胶原的SHG信号做为皮肤组织的结构内参，观察荧光标记的胶原蛋白经皮吸收的过程及聚集部位，荧光信号与SHG信号没有叠加，表征清晰，直观准确地反映胶原类物质透皮吸收的途径及作用部位，操作简便，快速准确，为透皮吸收的药品及美容产品的活性检测提供新的检测方法。
1.1 材料
基因工程菌表达的人源胶原蛋白(re-combinant human collagen, R-hc)，天津伊瑞雅生物科技有限公司(生产批号2005-03-18)；BALB/c小鼠，(20±2) g，北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2012-0001)；用于胶原蛋白
标记的荧光分子iFluorTM350 succinimidyl ester，AAT Bioquest，激发/发射波长(346 nm/443 nm)；双光子共聚焦扫描显微镜，Olympus(FV1000)，Mai Tai
DeepSee 激光器(120 fs，80 MHz)。
1.2 样品制备
1.2.1 荧光标记R-hc
精密称取R-hc干粉100 mg，向胶原蛋白中加入磷酸盐缓冲液10 mL充分溶解，用1 mol/L NaHCO3溶液调PH 8.5±0.5。向iFluorTM350中(1 mg)加入无水DMSO 1 mL得到1 mg/mL的染液。磁力搅拌器边搅拌边将荧光染液逐滴加入蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在20 min内加完)，加完后，继续避光搅拌12 h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4 ℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移入4 ℃冰箱中。将荧光标记后的蛋白取出放入透析袋中，置入避光含有超纯水的大烧杯中，每4 h换一次水，至超纯水中检测无荧光时停止透析。将荧光蛋白取出，冷冻干燥成粉末，待用。
采用5%浓缩胶，10%分离胶，R-hc和荧光标记R-hc(iFluorTM350-Re-combinant human collagen，iF-R-hc)的上样量为50 μg, 上样体积为20 μL，80 V电压下电泳150 min。电泳结束后，先用紫外光(365 nm)观察荧光条带，再经考马斯亮蓝染色后，白光下观察蛋白条带，依据荧光条带及蛋白条带与蛋白Marker的相对位置能够确定蛋白是否被荧光探针成功标记。
1.2.2 皮肤组织选取
小鼠麻醉后剃去背部毛发，将iF-R-hc溶液(1 mg/mL)均匀涂抹于已暴露的背部皮肤组织，避光，室温条件下待其皮肤自然吸收1 h后取下2 cm×2 cm全层皮肤组织，平铺于载玻片上。将全层皮肤组织置于双光子扫描共聚焦显微镜下进行图像采集。采集后皮肤做常规脱水、包埋、切片后进行HE染色。用Image Pro Plus 6.0软件图像处理，以基底层为起点，皮下组织与真皮层衔接处为终点，测量真皮层平
均厚度。
1.3 皮肤组织的SHG及双光子荧光成像
SHG成像与双光子荧光成像均从背向收集信号，SHG激发波长950 nm，双光子荧光激发波长750 nm，激发光由物镜聚焦到样品上，产生的背向SHG信号与荧光信号由同一个物镜25倍数值孔径为1.05的水浸显微镜物镜来收集，双光子荧光通道使用高通滤波片，波长范围420-460 nm；在SHG通道使用窄带滤波片，波长范围465-485 nm，组织做全层Z轴扫描，步进5 μm，图像采集速度10
μm/pixel，将所得图像进行Imaris 7.4.2图像渲染处理，红色为SHG成像，蓝色为荧光成像。
2.1 R-hc荧光标记
A为考马斯亮蓝凝胶成像，B为紫外光下观察荧光条带图。由图A可见R-hc分子量在58 kD左右，图B显示其荧光标记成功，且标记过程对其分子量大小无显著影响。
2.2 利用SHG成像结合双光子扫描成像观察R-hc经皮吸收的情况
胶原主要存在于皮肤的真皮层中， 是真皮的支撑结构， 其网状架构为皮肤提供了保护和弹性(图2B)，在纤维之间则分布着大量的水分、细胞外基质和功能性细胞，是皮肤重要的生化反应场所，为表皮层提供水分和营养。小鼠皮肤的HE染色结果显示(图2A)，从表皮基底层到皮下组织，即真皮层平均厚度在158 μm左右，胶原蛋白层应存在于此区域中。
给小鼠皮肤涂抹iF-R-hc 1 h后取小鼠皮肤进行观察，SHG成像结果显示，小鼠皮肤本底胶原蛋白SHG信号较强，由前期研究表明[3]其可能为I型胶原纤维，位于皮下100 μm左右的真皮层中(图3A)，分布有毛囊结构的空腔(箭头所示)。
外源iF-R-hc双光子扫描成像结果显示(图3B)，该蛋白主要集中于毛囊内，但已有一点蛋白从毛囊扩散到真皮层内(如3E，3F箭头所示)，该蛋白聚集的位置在图
3C叠加图中可清晰显示。从图3D纵向剖面图中可以看出，外源iF-R-hc与内源胶原开始于同一深度并沿毛囊向下延伸，其深度可达150 μm，但未超过真皮层厚度。
皮肤组织中具有非常丰富的自发荧光，如表皮中的角蛋白，上皮细胞中的NADH，上皮组织中的胶原蛋白和弹性蛋白等[10]。这些荧光信号虽可被双光子显微镜所收集但易与样品标记的荧光信号相混淆不适合作为内参进行样品的皮肤吸收定位。SHG信号是生物组织原发性信号，因为没有能量吸收，从而消除了光毒性、光损伤和光漂白性，可以长时间的追踪活细胞组织的生理活动过程。SHG信号具有高度的方向性，能反映出样品内部的细微结构，其光强度与激发光强度平方成正比，光谱宽度在飞秒激光下理论上只有10 nm，利用窄波带通滤光片可以有效排除荧光的干扰[5]。 在生物组织中，胶原、微管、微丝等结构蛋白能够产生很强的SHG信号。
皮肤组织分为表皮、真皮、皮下组织三部分，是人体表面积最大的器官，由蛋白质、核酸、糖、辅酶等成分组成，主要承担着保护体内器官和组织、 排汗、感觉冷热和压力等功能[6]。真皮层来源于中胚层，由纤维、基质、细胞构成，其中I型胶原纤维为真皮的主要构成成分，约占95%，集合成束状。在乳头层纤维束较细，排列紧密，走行方向不一，不互相交织。它具有强烈的二阶非线性极化率和结构非中心对称性，是生物组织中能够产生SHG信号的重要物质[12]。
化妆品中的透皮吸收指的是化妆品中的功能性成分按产品的有效性作用于皮肤表面或进入表皮或真皮并在该部位聚集和发挥作用的功效。其透皮吸收与药物的主要区别在于不需要透过皮肤进入体循环[7]。例如，美白产品中的美白剂需要透过角质层作用于表皮中的基底层，阻断黑色素的产生。体外补充胶原蛋白使其进入真皮层补充体内的胶原纤维，恢复皮肤的弹性。现有的研究化妆品中的有效成分透皮吸收的技术如最常用的扩散池法不能动态观察被检测物在皮肤各层聚集的情况；分光镜
法由于光透入角质层的深度有限其仅能检测表皮部分透过情况；电镜法、功效检测法、剩余量法都是通过回推间接反应其透皮吸收情况不能做到准确检测。因此需要一种简单、直观、不影响待检测样品性状的检测方法。
本研究采用荧光标记的方法将R-hc标记上荧光探针涂抹于小鼠皮肤表皮层，经皮吸收1小时后，采用双光子扫描共聚焦显微镜结合SHG成像进行逐层扫描。结果显示皮肤真皮层I型胶原纤维SHG信号在皮下的深度可达100 μm，同层面亦可检测到荧光信号，且荧光信号深达皮下 150 μm。结合HE染色结果表明所采集信号深度未超过真皮层厚度。将本研究所得图像进行叠加和Imaris渲染，可以观察到荧光信号沿着毛囊聚集，表明R-hc可以沿着毛囊进入真皮层，并在经皮吸收1
h后可由毛囊扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维。虽然皮肤附属器官与整个皮肤表面积相比，仅占1 %以下， 在大多数情况下不是主要吸收途径， 但大分子物质及离子型物质难以通过富含类脂的角质层， 可能经由这些途径进入皮肤[8,9]。
在本研究中， 我们通过荧光标记结合SHG的定位， 直观准确的确定了分子量为58 kD左右的胶原蛋白可以透皮吸收入真皮层， 为该蛋白在护肤品中的进一步应用提供了数据支持。
在下一步的研究中， 我们将继续利用双光子扫描显微镜的优势， 在iF-R-hc透皮吸收时相、在皮肤中存留时间、降解后的去向问题做进一步的研究， 同时， 我们也将探讨直接用活体动物观察R-hc的透皮吸收过程， 为透皮吸收的药品及美容产品的活性检测提供新的检测方法和分析手段。
*通讯作者： 王毅(1971-)，女，满，吉林，研究员，博士，主要从事光学成像技术在中医药领域中的应用。(电子邮箱)***********************
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