2024年2月28日发(作者：松千山)
-256
-北京口
腔医学
2019
年第
27
卷第
5
期
Beijing
Journal
of
S/maO/gy
0c/ber
2019
,
Vol.
27
,
No.
5青少年唾液菌群结构的分析研究任雯赵梅李杰孙鹏张海萍
白玉兴刘敏【摘要】目的研究青少年唾液的群落结构，预测物种的功能及代谢信息。方法本研究采集非活动性E的
青少年及成年人的非刺激性唾液，利用16S
rRNA基因高通量测序进行物种组成、多样性及差异物种等分析。利用
PIIRUSt对16S
rRNA基因进行功能预测。结果
青少年唾液样本的物种#多样性比成年人低。青少年组放线菌
属0TU55的相对丰度高于成年组，而吓咻单胞菌属0TU9,牙髓吓咻单胞菌0TU51,普氏菌属0TU315，中间普氏菌
0TU 28,密螺旋体属0TU74,Filifador
0TU59的相对丰度成年组高于青少年组。在KEGG第三级通路上，半胱氨酸
和甲硫氨酸代谢在成年组更高，且与吓咻单胞菌属OTU9，牙髓吓咻单胞菌0TU51，中间普氏菌0TU
28,密螺旋体
属OTU74的相对丰度呈正相关关系）结论
青少年唾液的群落结构及功能与成年人有差异,该研究为开展该年龄
段的口腔微生物研究提供参考）【关键词】
青少年；唾液;微生物【中图号】R780.
2【文献标识码】A【文章编号】I006A73X（20I9）05A256A5The
salivary
mnrobiat
communities
of
teenagers
REN
Wer,
ZHAO
Mei,
LI
Jir,
SUN
Peng,
ZHANG
Hai-picg,
BAI
Yu-xicg,
LIU
Mix.
Depahnect o/
%revective Dentistry,
Capital
Medical
Uciversito
School
o
Stomatology,
Bejcg100050
,
Chxca'Abstract]
Objective
To
mvestigate
the sa/vary microbial
communities
of
teenagers.
Methods
In
this
study,
16teenagers
and
13
adults
without
active
dental
caries were recruited.
The
microbial
communities'
structure
was
analyzed
using
16S
eRNA
genehogh-eheoughpuesequencong,
oncaudongmoceoboaacomposoeoon,
doeeesoeyand
0TUswoeh
doteeeneeeaaeoee
abundances. Furthermore,
a
method
called
“
PICRUSt"
was
used
to make
functional
predictions
based
on
16S
rRNA
s
The
# diversity of
teenagers
was lower
than
that
of
adults.
The
relative
abundance
o/
ActinomycesOTU55
was
higher
in
sa/w
from
teenagers,
while
Po—hyomocas
OTU9,
%orphyro}nocasecdogoctalis00U5I
,
%revotello
OTU315,%revotellaintermedia
OTU
28
,
T—pocema
OTU74,
Filifactor
OTU59
had
higher
relative
abundance
in
sa/w
samples
of
adults.
At
KEGG
level
3,
Cysteine
and
Methionine
Metabolism
increased
in
adu/s'
sa/w
samples,
with
positive
correlations
betoeen
Poj'phy—mocas
OTU9,
%.
ecdogoctalis
OTU51
,
%.
ictermenx
OTU
28and
Teponema
sion
The microbial
community
and
functionsof
teenagers
and
adults
were
diFerent in
some
aspects.'Key
words］
Teenager；
Saliva；
Microbiota口腔是人体重要的组成部位，拥有其自身独特
经成为分析群落物种多样性和结构的重要手段［9］）
我们还希望了解这些物种的功能信息。PICRUSt
（phyloxenetic
investigation
of
communitias
by
的解剖结构和微环境，口腔适宜的温度、湿度及pH
值，共同为微生物的定植提供了有利条件。口腔内
栖息着超过700种细菌，它们的存在及其复杂的相
互作用维持口腔环境的稳态［1］）当口腔菌群失调
reconstruction
of
unobse/ed
stOvs）可
以
实现基于物
种16SINA基因序列信息来预测它们的代谢
功能［10］。第四次全国口腔流行病学调查结果显示,12岁
时,可引起E病、牙周病、种植体周围炎等口腔疾
病不仅局限在口腔，口腔微生物也关乎全身
健康。炎症性肠病、胃癌、肝硬化、类风湿性关节炎
年龄组的恒牙E患率为34.
5%，比10年前上升
等均被证明与口腔微生物有一定关联但受限
于现有的实验条件，大多数细菌是无法培养出来的。
7.
8%，说明还需加强青少年的口腔卫生指导及E病
防治工作。了解青少年口腔菌群结构对于深入认识
和防治口腔疾病是必要的，但目前国内外研究大多
16S
rRNA基因高通量测序不依赖传统的培养法，已集中在低龄儿童（乳牙列）及成人，鲜有青少年的口
基金项目：北京市医院管理局临床医学发展专项经费
#ZYLX201703$腔菌群研究。本研究选取非活动性E的青少年为研
究对
,
采集
们的
激性唾
,
利
高通
测序作者单位：100050北京首都医科大学口腔医学院预防科（任
雯、赵梅、李杰、孙鹏、刘敏），正畸科（张海萍、白玉兴）分析群落结构,并对它们的功能进行预测，为今后针
对该年龄段口腔疾病的微生物研究提供基线数据,
供比对参考。通讯作者:刘敏,E-mail:sdyd2314@
163.
com,电话:
北京口
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Beijing
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of
Swmaw/ay
October
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No.
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-资料和方法1.
研究对象本研究选取2017年7月1日至2018年5月30
日在北京口腔医院正畸科就诊的初诊患者。纳入标
准:①患者和/或监护人自愿参与本研究;②第二磨
牙萌出;③无未治疗的E齿;④无中重度牙周病;⑤
无全身系统性疾病史;⑥3个月内未使用抗生素、激
素类药物及免疫抑制剂等;⑦女性不在妊娠期。根
据以上标准,最终纳入29名受试者，根据年龄划分
为青少年组（11
~18岁）及成年组（18岁以上），其
中青少年组16人（14.3
±1.6）岁，成年组13人
（27.2
±4.9）岁。所有受试者均进行口腔检查，包
括口腔卫生状况及E失补牙数等。本研究获得北京
口腔医院伦理委员会批准（批号：CMUSH-IRB-KJ-
PJ-2017-04），所有受试者均和/或监护人均签署知
情同意书。2.
样本采集及处理采集样本前，嘱研究对象用清水漱口。使用
50
ml无菌离心管收集非刺激性唾液2
ml）样本在
4'离心机以12000
r/min离丿卜力离心10
min,弃上
清。利用PrepIT
-
L2P试剂盒（DNA
Genotek公司，
加拿大）进行细菌基因组DNA提取）使用琼脂糖
凝胶电泳检测DNA完整性）3.
高通量测序对细菌基因组DNA的16S
rRNA基因V4可变区
进行PCR扩增，正向引物序列为515F（
5
-
-GTGC
CAGCMGCCGCGGTAA-3-），反向引物序列为
806R
（5
-
一GACTACHVGGGTWTCTAAT-3
-）。根据
Plumina
DNA文库制备说明书构建基因文库，利用2
X250
bp双端测序策略在Plumina
MiSeq平台进行测序。4.
数据处理及统计分析数据使用QIIME软件［11〕进行处理，质控标准和
具体流程如下:①去除低质量序列:设置30
bp为窗
口长度，如果窗口平均质量值低于20，从窗口开始
截除末端序列，移除最终长度低于原始长度75%的
序列；②去除有接头污染序列（设置重叠关系为
15
bp，允许错配数为3）;③去除含模糊碱基及低复
杂度序列（某个碱基连续出现的长度"10）;④利用
标签序列对过滤后的数据进行拆分，得到每个样本
的测序信息，标签序列允许错配个数为0
bp;⑤使用
序列拼接软件F/sh1.2.
11［12］，利用重叠关系将双
端测序得到的成对序列组装成一条序列，最小匹配
长度15
bp，重叠区域允许错配率为0.1）经过以上处理，得到高质量序列，用于后续分
析）利用软件Usearch
7.
0.1090
+切将拼接好的序列
在97%相似度下聚类为操作分类单元（OperaLw
nii，
OTU）
，
据
OTU
样本
的
例，计算OTU丰度）将OTU序列与数据库
Greengenes13.5比对，进行物种注释,置信度阈值设
置为0.
6。从样本中随机抽取一定数量的个体,统计个体
所代表的物种数目，以个体数与物种数构建稀释曲
线）基于
OTU
表格，计算
Observed
OTUs,
Chao1,
ACE,Shannon等#多样性指数）根据样本间进化
距离计算Weighted
Unidrac指数，表征0多样性）
比较两组间相对丰度有差异的物种）利用PIIRUSt
平台对微生物群落进行功能预测）使用独立样本t检验比较组间#多样性、OTU
丰度及代谢功能;使用Adonis比较组间！多样性）
所有统计学分析均使用R语言3.2.2完成）结
果1.基本信息为了探索青少年唾液菌群分布特征，本研究利
用16SrRNA基因高通量测序对29名正畸患者的唾
液样本进行分析）两组研究对象的年龄有统计学差
异（%<0.05）（表
1）。表1研究对象及测序基本信息（x
士*项目青少年组成年组男65女108例数1613平均年龄（岁）14.3
±1.627.2
±4.98E失补牙数3.9
±1.23.1
±1.48平均高质量序列数89137.0±753.089361.0
±726.0OTU数199.0±39.08222.0±40.08测序的下机数据经过质量控制、拆分、拼接、过
滤等处理,29个样本共得到2587887条高质量序
列，平均每个样本（89237
±737）条序列。根据序列
的97%相似性进行OTU聚类，共得到447个OTU
（表1
））通过对序列进行重采样,绘制稀释曲线（图
1）。OTU通过与Greengenas数据库比对，可注释到
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Joumgi
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SOmaO/vy
Oc/ber
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&
Nv. 516个I'］、27个纲*46个目、83个科*127个属*152个
）
平，
菌、放线菌门、拟菌门、放线菌门相对丰
99%
；
平，优势:
菌、
菌属、普菌属、
菌、纤毛菌属、菌。图1以500为基数在每个样本中随机抽取序列得
到的稀释曲线2.
多样性同样本测得的序列数有所差异,为
样本之间的
性，我们将所有样本重采样到同一测序深度，即以29
样本中最少的序列数为基准，随机抽取88326条序列，进行多样性 。本研究采用
Obseoed
OTUs,Chaol，ACE
和
Shannon
4
个指数
表征群落的#多样性。
唾
的#多样性指数
均低于成年人，有统计学差异（%<0.05）（图2）observed
OTUsChaol300*
300 -------—250 250
r~12OoJ
200::■
■50L
10TA0TAACE
Shannon注：#
:%<0.05；T：青少年组；A：成年组
图2样本#多样性分析#多样性
关注群落
样本包含的物数目，而0多样性
衡量样本间的相似度,通相似度抽
行比较。本研究采用Weighted
UniFrac距离，它
间的进化距离,也纳入了丰度信息。Weighted
UniFrac值越大，
表
群落中样本间的差异越大。
唾样本Weighted
UniFrac值比成年人小，有统计学差异（%
<0.05）o通
，利
降维的思想把样本映射到二维空间，进行
视化的直观表达，
看到， 和成
能较
地区
，且成样本
。
点代表
样本,X轴表示第一，
59.30%的差异;Y轴表示第
〕坐标，
14.62%的差异。（图3
））图3
基于Weighted
UniFroc距离的主坐标分析3. 差异OTU聚
及测序
等原因，可能会出现不同OTU被注释到同
的情况，也会OTU不能被注释到
的情况，本研究仅对注释到属和
平的OTU进行
和讨论。为了减测序
的影响，我们将序列数
所有29个样本总序列数的0.
01%的OTU去掉,认为剩余
OTU是测序准确的。
样本的
成不相同，但大多数OTU为所有样本共有。我们发
现，共7个OTU的相对丰
和成差异
著性，仅放线菌属OTU55
高
成年组，其余6个OTU（
jk单胞菌属OTU9,髓j
k单胞菌OTU51,普
菌属OTU315，中间普氏菌
OTU
28，密螺旋体属
OTU74,
FiltfactorOTU59）均为
成年组高（图4）。基于差异OTU丰度和Manhattan
,大 和成
样本
，从另一角
这些差异OTU的
（图5
）。OTU丰
对数转换及
化处理。
单格代表样本对应的OTU丰
，
-白-红逐渐增大。
北京
口
腔医学
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JournW
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StomWo/gy
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-中半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路成
，差异有统计学
高于青少年（％
<0.05
）。
差异OTU和行Pearson相关
，
吓咻代谢通路的丰
单胞菌属OTU9,髓吓咻单胞菌OTU51，间普氏
菌OTU28,密螺旋
OTU74
胱
酸和甲硫酸代谢通路的丰
正相关（表2 ））讨 论口腔中包
700种细菌，但大部分细菌无培养。
很多实验条件
研究依
统的培养法，
结果不全面。变
图4青少年组和成年组的差异OTU电
检测出难以培养的细菌，同的多样性和群落结构，曾较 的应评估
4.功能预测本研究利用PICRUSt对物种进行功能预测。
PICRUSt的原理是：利用IMG及Greengencs数据库
共同建立
包
研究中。但该方法仅对优势
存
性，
结果较确，
定
研究，且实验步骤繁琐，实
群落结构研究的首选方对细菌丰
息和基因信息的进化树,的基因信息预测未知物）本研究使用的16S
rRNA基因高通量测序，同
通过未知
的序列信息寻找其
化树中的亲缘样不依赖培养，
行定量分析，突破,
据知亲缘
了传统方法的局限性,提供更多的信息，在口腔
的基因信息，与KEGG数据库［14］对，注
物研究中得到了
通量测序，阐
口腔菌群
的应用。Dzidic等［⑸建间段的演替
的代功能。本研究首先 无关的测到6*25*80条立6
到7岁的
列，利
16SRNA基因高
，以代谢通路，在第、二、级
平均相对丰度大于0.
5%的代谢通路。其中第三级及
方式、
养、
素使用等因素的关）Chen等［16］利共聚
孑分
，探健康和牙周炎的特异性模
放线菌属OTU55
，同
手术
后
菌线
看吓咻单胞菌属OTU9
牙髓n卜I#单胞菌OTU51普氏菌属OTU315的组成
变化。本研究采用同的增加，获得的样的实验方法，
,随着测序
OTU数目最终趋
的测序
定，
当前样本中间普氏菌OTU28密螺旋体属OTU74Filifactor
OTU59eo
ooo9
r-■寸寸69seooiies9i>
CTj
Lp
i—H
h
，
大
所包含的细菌
，为后续的
列
提供了依据。口腔中包
境
同的生境，每个寸H其各自的
成特图5青少年组和成年组差异0TU热图及基于Manhattan距离矩阵的聚类图点。唾采集方
单、无创，易于表2差异OTU与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢的相关性数据分析r%放线菌属OTU55吓咻单胞菌属OTU90.540髓jk单胞菌OTU510.4040.030
#普菌属OTU315间普菌OTU28螺旋OTU740.5440.002
#Fila'actorOTU590.5950.4580.6080.3700.
1730.3430.5790.003#0.001#注：#
:%<0.05
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Beijing
Jourai
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S/maO/gy
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Vol.
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,
No. 5被受试者接受，是口腔
研究最
的样本来
源。本研究中，检的高丰
平为:厚壁菌门、放线菌门、拟菌门、放线菌门；
平:链球
菌属、
菌、普菌属、
菌、纤菌属、菌属。这与国内外一些学者的研究结果基本一
"叫
之,高丰
，即势
的
i
同年龄的人群
相似的。但势
序可同，这就
着唾液菌群的组成和结
同龄存在差异，随着年龄
，唾液菌群也
变化并逐渐趋
定[19-21]o本研究选取
成
.(27.2±4.9)岁作为对照组，更能
较小年龄区间内唾液菌群的变化。结果表明，成
的#多样性和0多样性均
高，
唾的
，
成
相似，
成
的唾
菌群结
多样
，这差异
原因
龄增带来的菌群变化成熟，但也与口腔卫生、饮、生
活
及环境因素相关[22
,
23])通过相对丰度的比较
，吓咻单胞菌属
OTU9,牙髓jk单胞菌OTU51，普
菌属OTU315，中间普氏菌OTU
28,密螺旋体属OTU74,
Filifactor
OTU59等6个OTU在成
唾液菌群中升高，这些细菌均
菌或机会
菌,与口腔感染性
-相关，特
周炎。虽然研究对象无
周，
但成
检
的这些高丰
差异
，提示他们
周炎的风
高。另外,jk单胞菌属、普菌
的某些
能够利用胱氨酸和甲硫氨酸代谢产生硫化氢及二甲基
硫+24
,
25]
,
KEGG第三级半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路与差异OTU丰度的正相关关系。本研究的研究对
正畸前的患者，有错畸,加了菌斑控制的难度，不能代表所
，这是本研究的不足。 和成
的口腔况无
差异，
了部
。本研究
断
面研究，样本
小,如果观测同
同年龄段口腔
的演替，形成
列，并大样本量，
。参考文献1
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effects
of
family
&
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on
the
sa/vao
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Estmayon
of
bacterial
hydrogen
su/ide
production
in
vitro.
J
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Microbiol,
2015,
7:
28166.(2018年8月3日收稿)
2024年2月28日发(作者：松千山)
-256
-北京口
腔医学
2019
年第
27
卷第
5
期
Beijing
Journal
of
S/maO/gy
0c/ber
2019
,
Vol.
27
,
No.
5青少年唾液菌群结构的分析研究任雯赵梅李杰孙鹏张海萍
白玉兴刘敏【摘要】目的研究青少年唾液的群落结构，预测物种的功能及代谢信息。方法本研究采集非活动性E的
青少年及成年人的非刺激性唾液，利用16S
rRNA基因高通量测序进行物种组成、多样性及差异物种等分析。利用
PIIRUSt对16S
rRNA基因进行功能预测。结果
青少年唾液样本的物种#多样性比成年人低。青少年组放线菌
属0TU55的相对丰度高于成年组，而吓咻单胞菌属0TU9,牙髓吓咻单胞菌0TU51,普氏菌属0TU315，中间普氏菌
0TU 28,密螺旋体属0TU74,Filifador
0TU59的相对丰度成年组高于青少年组。在KEGG第三级通路上，半胱氨酸
和甲硫氨酸代谢在成年组更高，且与吓咻单胞菌属OTU9，牙髓吓咻单胞菌0TU51，中间普氏菌0TU
28,密螺旋体
属OTU74的相对丰度呈正相关关系）结论
青少年唾液的群落结构及功能与成年人有差异,该研究为开展该年龄
段的口腔微生物研究提供参考）【关键词】
青少年；唾液;微生物【中图号】R780.
2【文献标识码】A【文章编号】I006A73X（20I9）05A256A5The
salivary
mnrobiat
communities
of
teenagers
REN
Wer,
ZHAO
Mei,
LI
Jir,
SUN
Peng,
ZHANG
Hai-picg,
BAI
Yu-xicg,
LIU
Mix.
Depahnect o/
%revective Dentistry,
Capital
Medical
Uciversito
School
o
Stomatology,
Bejcg100050
,
Chxca'Abstract]
Objective
To
mvestigate
the sa/vary microbial
communities
of
teenagers.
Methods
In
this
study,
16teenagers
and
13
adults
without
active
dental
caries were recruited.
The
microbial
communities'
structure
was
analyzed
using
16S
eRNA
genehogh-eheoughpuesequencong,
oncaudongmoceoboaacomposoeoon,
doeeesoeyand
0TUswoeh
doteeeneeeaaeoee
abundances. Furthermore,
a
method
called
“
PICRUSt"
was
used
to make
functional
predictions
based
on
16S
rRNA
s
The
# diversity of
teenagers
was lower
than
that
of
adults.
The
relative
abundance
o/
ActinomycesOTU55
was
higher
in
sa/w
from
teenagers,
while
Po—hyomocas
OTU9,
%orphyro}nocasecdogoctalis00U5I
,
%revotello
OTU315,%revotellaintermedia
OTU
28
,
T—pocema
OTU74,
Filifactor
OTU59
had
higher
relative
abundance
in
sa/w
samples
of
adults.
At
KEGG
level
3,
Cysteine
and
Methionine
Metabolism
increased
in
adu/s'
sa/w
samples,
with
positive
correlations
betoeen
Poj'phy—mocas
OTU9,
%.
ecdogoctalis
OTU51
,
%.
ictermenx
OTU
28and
Teponema
sion
The microbial
community
and
functionsof
teenagers
and
adults
were
diFerent in
some
aspects.'Key
words］
Teenager；
Saliva；
Microbiota口腔是人体重要的组成部位，拥有其自身独特
经成为分析群落物种多样性和结构的重要手段［9］）
我们还希望了解这些物种的功能信息。PICRUSt
（phyloxenetic
investigation
of
communitias
by
的解剖结构和微环境，口腔适宜的温度、湿度及pH
值，共同为微生物的定植提供了有利条件。口腔内
栖息着超过700种细菌，它们的存在及其复杂的相
互作用维持口腔环境的稳态［1］）当口腔菌群失调
reconstruction
of
unobse/ed
stOvs）可
以
实现基于物
种16SINA基因序列信息来预测它们的代谢
功能［10］。第四次全国口腔流行病学调查结果显示,12岁
时,可引起E病、牙周病、种植体周围炎等口腔疾
病不仅局限在口腔，口腔微生物也关乎全身
健康。炎症性肠病、胃癌、肝硬化、类风湿性关节炎
年龄组的恒牙E患率为34.
5%，比10年前上升
等均被证明与口腔微生物有一定关联但受限
于现有的实验条件，大多数细菌是无法培养出来的。
7.
8%，说明还需加强青少年的口腔卫生指导及E病
防治工作。了解青少年口腔菌群结构对于深入认识
和防治口腔疾病是必要的，但目前国内外研究大多
16S
rRNA基因高通量测序不依赖传统的培养法，已集中在低龄儿童（乳牙列）及成人，鲜有青少年的口
基金项目：北京市医院管理局临床医学发展专项经费
#ZYLX201703$腔菌群研究。本研究选取非活动性E的青少年为研
究对
,
采集
们的
激性唾
,
利
高通
测序作者单位：100050北京首都医科大学口腔医学院预防科（任
雯、赵梅、李杰、孙鹏、刘敏），正畸科（张海萍、白玉兴）分析群落结构,并对它们的功能进行预测，为今后针
对该年龄段口腔疾病的微生物研究提供基线数据,
供比对参考。通讯作者:刘敏,E-mail:sdyd2314@
163.
com,电话:
北京口
腔医学
2019
年第
27
卷第
5
期
Beijing
Journal
of
Swmaw/ay
October
2019
,
Vol.
27
,
No.
5-257
-资料和方法1.
研究对象本研究选取2017年7月1日至2018年5月30
日在北京口腔医院正畸科就诊的初诊患者。纳入标
准:①患者和/或监护人自愿参与本研究;②第二磨
牙萌出;③无未治疗的E齿;④无中重度牙周病;⑤
无全身系统性疾病史;⑥3个月内未使用抗生素、激
素类药物及免疫抑制剂等;⑦女性不在妊娠期。根
据以上标准,最终纳入29名受试者，根据年龄划分
为青少年组（11
~18岁）及成年组（18岁以上），其
中青少年组16人（14.3
±1.6）岁，成年组13人
（27.2
±4.9）岁。所有受试者均进行口腔检查，包
括口腔卫生状况及E失补牙数等。本研究获得北京
口腔医院伦理委员会批准（批号：CMUSH-IRB-KJ-
PJ-2017-04），所有受试者均和/或监护人均签署知
情同意书。2.
样本采集及处理采集样本前，嘱研究对象用清水漱口。使用
50
ml无菌离心管收集非刺激性唾液2
ml）样本在
4'离心机以12000
r/min离丿卜力离心10
min,弃上
清。利用PrepIT
-
L2P试剂盒（DNA
Genotek公司，
加拿大）进行细菌基因组DNA提取）使用琼脂糖
凝胶电泳检测DNA完整性）3.
高通量测序对细菌基因组DNA的16S
rRNA基因V4可变区
进行PCR扩增，正向引物序列为515F（
5
-
-GTGC
CAGCMGCCGCGGTAA-3-），反向引物序列为
806R
（5
-
一GACTACHVGGGTWTCTAAT-3
-）。根据
Plumina
DNA文库制备说明书构建基因文库，利用2
X250
bp双端测序策略在Plumina
MiSeq平台进行测序。4.
数据处理及统计分析数据使用QIIME软件［11〕进行处理，质控标准和
具体流程如下:①去除低质量序列:设置30
bp为窗
口长度，如果窗口平均质量值低于20，从窗口开始
截除末端序列，移除最终长度低于原始长度75%的
序列；②去除有接头污染序列（设置重叠关系为
15
bp，允许错配数为3）;③去除含模糊碱基及低复
杂度序列（某个碱基连续出现的长度"10）;④利用
标签序列对过滤后的数据进行拆分，得到每个样本
的测序信息，标签序列允许错配个数为0
bp;⑤使用
序列拼接软件F/sh1.2.
11［12］，利用重叠关系将双
端测序得到的成对序列组装成一条序列，最小匹配
长度15
bp，重叠区域允许错配率为0.1）经过以上处理，得到高质量序列，用于后续分
析）利用软件Usearch
7.
0.1090
+切将拼接好的序列
在97%相似度下聚类为操作分类单元（OperaLw
nii，
OTU）
，
据
OTU
样本
的
例，计算OTU丰度）将OTU序列与数据库
Greengenes13.5比对，进行物种注释,置信度阈值设
置为0.
6。从样本中随机抽取一定数量的个体,统计个体
所代表的物种数目，以个体数与物种数构建稀释曲
线）基于
OTU
表格，计算
Observed
OTUs,
Chao1,
ACE,Shannon等#多样性指数）根据样本间进化
距离计算Weighted
Unidrac指数，表征0多样性）
比较两组间相对丰度有差异的物种）利用PIIRUSt
平台对微生物群落进行功能预测）使用独立样本t检验比较组间#多样性、OTU
丰度及代谢功能;使用Adonis比较组间！多样性）
所有统计学分析均使用R语言3.2.2完成）结
果1.基本信息为了探索青少年唾液菌群分布特征，本研究利
用16SrRNA基因高通量测序对29名正畸患者的唾
液样本进行分析）两组研究对象的年龄有统计学差
异（%<0.05）（表
1）。表1研究对象及测序基本信息（x
士*项目青少年组成年组男65女108例数1613平均年龄（岁）14.3
±1.627.2
±4.98E失补牙数3.9
±1.23.1
±1.48平均高质量序列数89137.0±753.089361.0
±726.0OTU数199.0±39.08222.0±40.08测序的下机数据经过质量控制、拆分、拼接、过
滤等处理,29个样本共得到2587887条高质量序
列，平均每个样本（89237
±737）条序列。根据序列
的97%相似性进行OTU聚类，共得到447个OTU
（表1
））通过对序列进行重采样,绘制稀释曲线（图
1）。OTU通过与Greengenas数据库比对，可注释到
-258
-北京口
腔医学
2019
年第
27
卷第
5
期
Beijing
Joumgi
of
SOmaO/vy
Oc/ber
2019
&
Vol.
27
&
Nv. 516个I'］、27个纲*46个目、83个科*127个属*152个
）
平，
菌、放线菌门、拟菌门、放线菌门相对丰
99%
；
平，优势:
菌、
菌属、普菌属、
菌、纤毛菌属、菌。图1以500为基数在每个样本中随机抽取序列得
到的稀释曲线2.
多样性同样本测得的序列数有所差异,为
样本之间的
性，我们将所有样本重采样到同一测序深度，即以29
样本中最少的序列数为基准，随机抽取88326条序列，进行多样性 。本研究采用
Obseoed
OTUs,Chaol，ACE
和
Shannon
4
个指数
表征群落的#多样性。
唾
的#多样性指数
均低于成年人，有统计学差异（%<0.05）（图2）observed
OTUsChaol300*
300 -------—250 250
r~12OoJ
200::■
■50L
10TA0TAACE
Shannon注：#
:%<0.05；T：青少年组；A：成年组
图2样本#多样性分析#多样性
关注群落
样本包含的物数目，而0多样性
衡量样本间的相似度,通相似度抽
行比较。本研究采用Weighted
UniFrac距离，它
间的进化距离,也纳入了丰度信息。Weighted
UniFrac值越大，
表
群落中样本间的差异越大。
唾样本Weighted
UniFrac值比成年人小，有统计学差异（%
<0.05）o通
，利
降维的思想把样本映射到二维空间，进行
视化的直观表达，
看到， 和成
能较
地区
，且成样本
。
点代表
样本,X轴表示第一，
59.30%的差异;Y轴表示第
〕坐标，
14.62%的差异。（图3
））图3
基于Weighted
UniFroc距离的主坐标分析3. 差异OTU聚
及测序
等原因，可能会出现不同OTU被注释到同
的情况，也会OTU不能被注释到
的情况，本研究仅对注释到属和
平的OTU进行
和讨论。为了减测序
的影响，我们将序列数
所有29个样本总序列数的0.
01%的OTU去掉,认为剩余
OTU是测序准确的。
样本的
成不相同，但大多数OTU为所有样本共有。我们发
现，共7个OTU的相对丰
和成差异
著性，仅放线菌属OTU55
高
成年组，其余6个OTU（
jk单胞菌属OTU9,髓j
k单胞菌OTU51,普
菌属OTU315，中间普氏菌
OTU
28，密螺旋体属
OTU74,
FiltfactorOTU59）均为
成年组高（图4）。基于差异OTU丰度和Manhattan
,大 和成
样本
，从另一角
这些差异OTU的
（图5
）。OTU丰
对数转换及
化处理。
单格代表样本对应的OTU丰
，
-白-红逐渐增大。
北京
口
腔医学
2019
年第
27
卷第
5
期
Beijing
JournW
of
StomWo/gy
October
2019
,
Vol.
27
,
No.
5-259
-中半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路成
，差异有统计学
高于青少年（％
<0.05
）。
差异OTU和行Pearson相关
，
吓咻代谢通路的丰
单胞菌属OTU9,髓吓咻单胞菌OTU51，间普氏
菌OTU28,密螺旋
OTU74
胱
酸和甲硫酸代谢通路的丰
正相关（表2 ））讨 论口腔中包
700种细菌，但大部分细菌无培养。
很多实验条件
研究依
统的培养法，
结果不全面。变
图4青少年组和成年组的差异OTU电
检测出难以培养的细菌，同的多样性和群落结构，曾较 的应评估
4.功能预测本研究利用PICRUSt对物种进行功能预测。
PICRUSt的原理是：利用IMG及Greengencs数据库
共同建立
包
研究中。但该方法仅对优势
存
性，
结果较确，
定
研究，且实验步骤繁琐，实
群落结构研究的首选方对细菌丰
息和基因信息的进化树,的基因信息预测未知物）本研究使用的16S
rRNA基因高通量测序，同
通过未知
的序列信息寻找其
化树中的亲缘样不依赖培养，
行定量分析，突破,
据知亲缘
了传统方法的局限性,提供更多的信息，在口腔
的基因信息，与KEGG数据库［14］对，注
物研究中得到了
通量测序，阐
口腔菌群
的应用。Dzidic等［⑸建间段的演替
的代功能。本研究首先 无关的测到6*25*80条立6
到7岁的
列，利
16SRNA基因高
，以代谢通路，在第、二、级
平均相对丰度大于0.
5%的代谢通路。其中第三级及
方式、
养、
素使用等因素的关）Chen等［16］利共聚
孑分
，探健康和牙周炎的特异性模
放线菌属OTU55
，同
手术
后
菌线
看吓咻单胞菌属OTU9
牙髓n卜I#单胞菌OTU51普氏菌属OTU315的组成
变化。本研究采用同的增加，获得的样的实验方法，
,随着测序
OTU数目最终趋
的测序
定，
当前样本中间普氏菌OTU28密螺旋体属OTU74Filifactor
OTU59eo
ooo9
r-■寸寸69seooiies9i>
CTj
Lp
i—H
h
，
大
所包含的细菌
，为后续的
列
提供了依据。口腔中包
境
同的生境，每个寸H其各自的
成特图5青少年组和成年组差异0TU热图及基于Manhattan距离矩阵的聚类图点。唾采集方
单、无创，易于表2差异OTU与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢的相关性数据分析r%放线菌属OTU55吓咻单胞菌属OTU90.540髓jk单胞菌OTU510.4040.030
#普菌属OTU315间普菌OTU28螺旋OTU740.5440.002
#Fila'actorOTU590.5950.4580.6080.3700.
1730.3430.5790.003#0.001#注：#
:%<0.05
-260
-北京口
腔医学
2019
年第
27
卷第
5
期
Beijing
Jourai
of
S/maO/gy
October
2019
,
Vol.
27
,
No. 5被受试者接受，是口腔
研究最
的样本来
源。本研究中，检的高丰
平为:厚壁菌门、放线菌门、拟菌门、放线菌门；
平:链球
菌属、
菌、普菌属、
菌、纤菌属、菌属。这与国内外一些学者的研究结果基本一
"叫
之,高丰
，即势
的
i
同年龄的人群
相似的。但势
序可同，这就
着唾液菌群的组成和结
同龄存在差异，随着年龄
，唾液菌群也
变化并逐渐趋
定[19-21]o本研究选取
成
.(27.2±4.9)岁作为对照组，更能
较小年龄区间内唾液菌群的变化。结果表明，成
的#多样性和0多样性均
高，
唾的
，
成
相似，
成
的唾
菌群结
多样
，这差异
原因
龄增带来的菌群变化成熟，但也与口腔卫生、饮、生
活
及环境因素相关[22
,
23])通过相对丰度的比较
，吓咻单胞菌属
OTU9,牙髓jk单胞菌OTU51，普
菌属OTU315，中间普氏菌OTU
28,密螺旋体属OTU74,
Filifactor
OTU59等6个OTU在成
唾液菌群中升高，这些细菌均
菌或机会
菌,与口腔感染性
-相关，特
周炎。虽然研究对象无
周，
但成
检
的这些高丰
差异
，提示他们
周炎的风
高。另外,jk单胞菌属、普菌
的某些
能够利用胱氨酸和甲硫氨酸代谢产生硫化氢及二甲基
硫+24
,
25]
,
KEGG第三级半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路与差异OTU丰度的正相关关系。本研究的研究对
正畸前的患者，有错畸,加了菌斑控制的难度，不能代表所
，这是本研究的不足。 和成
的口腔况无
差异，
了部
。本研究
断
面研究，样本
小,如果观测同
同年龄段口腔
的演替，形成
列，并大样本量，
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Magoe
T,
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SL.
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fast length
adjustment
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short reads
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