2024年3月2日发(作者：拓跋元化)
一７４一 江苏农业科学２０１１年第３９卷第５期 邢延豪，周延清，楚素霞，等．ＣＡＰＳ标记技术及其应用进展［Ｊ］．江苏农业科学，２０１１，３９（５）：７４—７６ ＣＡＰＳ标记技术及其应用进展 邢延豪，周延清，楚素霞，郭静佩，周 鹏，范念斯 （河南师范大学生命科学学院，河南新乡４５３００７） 摘要：酶切扩增多态性序列（ＣＡＰＳ）标记技术是一种简单、经济、可靠和共显性的技术，适用于生物研究的许多方 面。本文综述了该标记技术的原理、过程、特点和在植物、动物和微生物的基因分型、分子标记辅助选择育种、品种鉴 定、分子标记的开发、基因鉴定、基因定位、遗传图谱构建、基因分离、体细胞杂合植株的遗传鉴定与分析诸方面应用的 新进展，并展望了其应用前景。 关键词：ＣＡＰＳ；ＤＮＡ分子标记；品种鉴定；遗传图谱；基因 中图分类号：Ｓ一１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１１）０５—００７４—０３ 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础 的遗传标记，是ＤＮＡ水平遗传多态性的直接反映 。广义的 分子标记是指可遗传的并可检测的ＤＮＡ序列或蛋白质。蛋 异性的ＰＣＲ引物（１９～２７ ｂｐ），然后用这些引物扩增该位点 上的某一ＤＮＡ片段，接着用专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行ＲＦＬＰ分析。 １．２ ＣＡＰＳ的步骤 白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶以及等位酶。狭义的分 子标记只是指ＤＮＡ分子标记，ＤＮＡ分子标记是指能反映生 物个体或种群间基因组中某种差异特征的ＤＮＡ片段。它能 够直接反映基因组ＤＮＡ间的差异。 随着分子生物学技术的发展，ＤＮＡ分子标记技术也迅速 发展，现已有数十种分子标记，如ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＴＳ、ＣＡＰＳ、 ＣＡＰＳ的基本步骤（以大豆的 ｄ２一Ｊ基因为例）：（１）选 择目标序列：在ＧｅｎＢａｎｋ上搜索大豆的 一Ｊ基因，其的登 录号为Ｌ４３９２０．１ ＧＩ：９０４１５１；（２）设计特异引物：依据大豆 ｄ２一ｊ基因的碱基序列，利用计算机软件，ＤＮＡＭＡＮ ４．０，设 计特定ＰＣＲ引物上游引物，５ 一ＡＴＧＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＧＴＣＧＴＧＴ 一ＳＣＡＲ、ＳＳＲ、ＳＮＰ、ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ、ＴＲＡＰ等，它们被广泛应用于遗 传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构 建、基因克隆等方面 。不同的分子标记有不同的优缺点， 其主要的应用也不尽相同。ＣＡＰＳ是酶切扩增多态性序列标 记技术，主要是对ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分 ３ ，下游弓Ｉ物５ 一ＡＴＡＣＡＣＧＣＣＣＴＩＴＣＴＣＧＧＡＴ一３ ；（３）ＰＣＲ 扩增：利用设计的引物从大豆基因组ＤＮＡ中扩增大豆的 ｆａｄ２一Ｊ基因；（４）酶切：利用ＤＮＡＭＡＮ ４．０软件分析，发现在 一Ｊ基因的４９９ ｂｐ和１ ０１５ ｂｐ处有２个限制性内切酶 （Ｓｃａ Ｉ）位点，利用该限制性内切酶（Ｓｃａ Ｉ）对ＰＣＲ扩增产物 进行酶切；（５）琼脂糖电泳分离与鉴定：用琼脂糖凝胶对酶切 产物分析，检测其多态性。 ２ ＣＡＰＳ的特点 析 ，具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低等优点， 广泛应用于植物基因分型、定位、克隆、分子鉴定 和动物的 遗传多样性、品种鉴定以及微生物的连锁图谱和品种鉴定 等方面。目前本实验室正在开展大豆油酸脱饱和酶基因的 ＣＡＰＳ标记及其多样性研究。本文对ＣＡＰＳ标记技术研究进 （１）引物与限制性内切酶组合非常多，增加了揭示多态 性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖电泳分析；（２）在真核 展进行综述，以期对科研工作者提供一些参考。 １ ＣＡＰＳ的原理及步骤 １．１ ＣＡＰＳ的原理 生物中，ＣＡＰＳ标记呈共显性，即可区分纯合基因型和杂合基 因型；（３）所需ＤＮＡ的量很少，且对ＤＮＡ的浓度要求不严 格；（４）使用的引物较长，扩增的结果比较稳定且避免了 ＲＦＬＰ分析中膜转印这一步骤，又能保持ＲＦＬＰ分析的精确 ＣＡＰＳ是酶切扩增多态性序列标记技术，又称为ＲＦＬＰ— ＰＣＲ，主要是对ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分析。 度；（５）操作简便、快捷和自动化程度高。虽然ＣＡＰＳ标记有 诸多优点，但由于它必须使用限制性内切酶，筛选合适的酶组 合工作量大，而且，已发现的突变酶切位点较少，限制了它的 大规模开发应用。 ３ ＣＡＰＳ的应用 ３ ．１基因分型 它是根据ＥＳＴ或已发表的基因序列等设计特异引物，将特异 ＰＣＲ与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术 。它 的基本原理是利用己知位点的ＤＮＡ序列资源设计出一套特 收稿日期：２０１０—１１—２５ 基金项目：河南省基础与前沿技术研究（编号：０９２３００４１０００９）；河南 省教育厅自然科学基础研究（编号：２００８Ａ２０８０１８）。 谭亚玲等通过对位于Ｒｆ—ｔ位点的２个ＣＡＰＳ标记对水 稻滇Ｉ型、野败型、红莲型及ＢＴ型恢复系基因型分析，发现这 ４种不同胞质的恢复系在Ｒｆ一１位点具有相同的带型，滇Ｉ型 的２个保持系具有不同的带型。王彩霞 根据ＧＴ缺失开发 了１个ＣＡＰＳ标记ＣＡＰＳＲａ，而且用它对２个Ｆ：分离群体和 作者简介：邢延豪（１９８３一），男，河南汝州人，硕士研究生，研究方向 为植物分子遗传与育种。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｑＯ４０９１２ｙａｎｈａｏ＠１６３．ｔｏｍ。 通信作者：周延清，博士，教授，研究方向为植物分子遗传与育种。 Ｔｅｌ：（０３７３）３３２６３４０；Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｑｚｈｏｕ＠ｈｔｕ．ｃｎ。
邢延豪等：ＣＡＰＳ标记技术及其应用进展 １００余份水稻品种进行分析。结果发现，所有Ｆ２白米单株以 及所有白米（ｎ：６３）和红米（ｎ＝２３）品种的ＣＡＰＳＲａ基因型 一７５— 验中，２４４ ｂｐ片段为萝卜自交不亲合系特有标记，基本可以用 于萝卜自交不亲和基因乩Ｇ６的检测。王亮等分析了新疆小 麦ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ基因等位变异情况 。 ３．６构建遗传图谱 与培矮６４Ｓ相同，而所有紫米品种（ ＝２０）与豫南黑籼糯和 川黑糯相同 。根此推测，砌基因可能即为 基因，水稻紫 色种皮性状可能由Ｒａ基因的ＧＴ缺失引起。 ３．２辅助选择育种 赵雪构建了ｌ张包含４７个位点的分子标记连锁图，其中 包括１６个ＥＳＴ—ＣＡＰＳ位点，１１个ＥＳＴ—ＳＳＲ位点，ｌ０个ＥＳＴ —传统的育种主要依赖于植株的表现型选择。环境条件、 基因间互作、基因型等多种因素会影响表型选择效率。１个 优良品种的培育往往需花费７～８年甚至十几年时间，而借助 分子标记辅助育种可以大大提高育种的效率，还可以提高它 ＲＣＲ位点，１０个ＲＡＰＤ位点，９个标记表现出偏分离 ］。 李付振基于水稻粳稻和籼粳基因组序列设计４６对ＳＳＲ和 ＣＡＰＳ标记，利用Ｆ：代１ ６９１个突变个体和２ ００２个野生型单 株，构建了含有Ｐｓｅ（ｔ）位点的高密度遗传图谱 ］。 ’ 的准确率。刘之熙等用ＣＡＰＳ标记辅助选择水稻孕穗期耐冷 基因。他们利用的ＣＡＰＳ标记Ｓ 与孕穗期耐冷主效ＱＴＬ 之间的遗传距离为１ ｃＭ，选择的准确率达９９％ 。如果在 代选择２株，则２株均不含目的基因的可能性为万分之 一；如果择３株，则在３株中不含该基因的可能性将更小。夏 明元等利用 基因的ＣＡＰＳ标记开展水稻直链淀粉含量的 分子标记辅助育种，将优质性状导人高产品种，从而选育出优 质高产水稻品种 。刘之熙研究水稻耐冷性分子标记ＣＡＰＳ 辅助选择育种，从３个 群体中，分别选出携带纯合耐冷基 因的个体４株、２株和６株 。张照远等研究了ＥＳＴ—ＣＡＰＳ 标记在尾叶桉ｘ细叶桉Ｆ 中分离规律，发现符合孟德尔正 态分离的ＥＳＴ～ＣＡＰＳ标记比例达８５．７％，是稳定的遗传 标记 。 ３．３品种鉴定 Ｔａｎａｋａ等在１３本国内首次用ＣＡＰＳ标记研究日本甘薯分 类，他们以１１个品种的外显子序列为依据设计了１３对引物 来扩增内含子，然后用８个限制性内切酶酶切，结果得到了 ２７个多态性的分子标记片段 。他们用这些分子标记片段 有效地把日本的甘薯品种分开。李晓琪用ＣＡＰＳ标记快速、 准确地鉴别了萝卜的自交不亲和系和自交亲和系 。 ３．４分子标记的开发 余波澜等开发了大麦特异的ＡＳＡ标记 。于拴仓等根 据番茄叶霉病抗性基因ｃｆ一５的基因序列设计特异扩增引 物，以７个含有不同叶霉病抗病基因的品种为试材，扩增其单 拷贝片段，７个材料均获得了约０．９６ ｋｂ的特异扩增片段；用 限制性内切酶Ｔａｑ Ｉ对该片段进行酶切，含ｃｆ一５基因的材料 产生了一条２５６ ｂｐ的特异片段，而不含ｃ厂一 基因的材料产 生１条２２５ ｂｐ的特异片段。从而建立了ｃｆ一５基因的共显性 ＣＡＰＳ标记 。吴嫒嫒等建立了番茄抗晚疫病基因ｐｈ一３的 ＲＡＰＤ及ＣＡＰＳ标记 Ｊ。李君明利用近等基因系获得了与番 茄的来自ＬＡ２９５１抗病ＱＴＬｌｙｇｍ７—１紧密连锁的ＣＡＰＳ标 记 。朱莎等获得了番茄与雄性不育基因ｐｓ一２紧密连锁 的１个ＳＳＲ标记和１个ＣＡＰＳ标记，它们与ｐｓ一２基因的连锁 遗传距离分别是４．９ ｃＭ和ｌ１．６ ｃＭ，位于该基因两侧，均为 共显性标记 。 ３．５基因鉴定 李晓琪等在研究萝卜的自交不亲和基因ＳＬＧ６时，用限 制性内切酶Ｔａｑ Ｉ对特异扩增片段进行酶切后，电泳检测结 果表明，自交不亲和系和自交亲和系均含有ＳＬＧ基因基本框 架序列，但是自交亲和系相对于自交不亲和系而言，碱基序列 排列可能发生了变化，所以酶切片段呈现多态性 。在该实 ３．７基因定位 王孝宣获得了多毛番茄的ＣＡＰＳ标记，利用ＣＡＰＳ和 ＡＦＬＰ标记构建了番茄第４染色体底端长５０ ｃＭ片段的精密 分子遗传图谱，利用Ｍｕｔｉｐｌｅｘ—ＣＡＰＳ技术同时检测多个 ＣＡＰＳ标记的多态性 。王立静基于ＳＳＲ标记开发了ＣＡＰＳ 标记Ｃ１，把玉米显性矮秆基因Ｄ￡基因定位在ＣＡＰＳ标记Ｃ１ 和￥７６之间，遗传距离分别是３．０、３．５ ｃＭ 。原玉香定位了 白菜类作物６个重要的开花时间相关基因，包括３个 ＢｒＦＬＣｓ、２个ＭＡＦ和１个ｎ 。赵仲华利用简单序列长度 多态性标记（ＳＳＬＰ）和ＣＡＰＳ将拟南芥开花时间调控基因ＦＬＸ 定位于拟南芥第５条染色体上端标记ＭＯＰＩＯ一２８５５１和 Ｋ１８ｊ１７—１２８３６之间，大约１３０ ｋｂ的范围之内 Ｊ。陈郁基于 现有玉米防御相关的ＥＳＴ序列发展ＳＴＳ标记和ＣＡＰＳ标记， 用豫玉２２号第１Ｏ代重组自交系群体定位了其中的１３个防 御反应相关基因 。 ３．８基因分离与图位克隆 于春霞通过ＣＡＰＳ标记的筛选，分别获得不育系和保持 系的ａｔｐ６基因片段，分析了二者的差异以及对瓣化型胡萝卜 雄性不育发生的影响［２８ Ｊ。Ｌｉｓａ等用ＣＡＰＳ和ｄＣＡＰＳ标记技 术图位克隆了水稻半矮化基因ｓｄ—ｊ 。Ｓｔ￣ｃｋｄ等使用ｓｓ． ＬＰ和ＣＡＰＳ标记图位克隆基因ｐｙｇ７ 。 ３．９体细胞杂合植株的遗传鉴定与分析 龚庆利用ＣＡＰＳ标记技术对香蕉融合再生植株进行检 测。结果表明，在２０株香蕉融合再生植株中没有筛选到胞质 杂种，它们的ＣＡＰＳ图谱与受体亲本一致，无供体亲本的条 带，也没有出现重组条带 。吴初超采用ＳＳＲ、ｃｐＳＳＲ和 ＣＡＰＳ标记对１０个柑橘属间、种间体细胞杂种进行核质遗传 鉴定和分析，在红橘＋枳橙、丹西红橘＋枸头橙、朋娜＋粗柠 檬的ＣＡＰＳ分析中，线粒体ＤＮＡ均表现倾向来源于悬浮系亲 本；而朋娜＋粗柠檬组合再生植株的ｍｔＤＮＡ发生了重组 。 徐小勇采用ＦＣＭ、ＳＳＲ、ＳＲＡＰ和ＣＡＰＳ对４个融合组合的再 生植株的倍性、核和胞质ＤＮＡ来源进行了鉴定 。 ４展望 ＣＡＰＳ标记技术自建立以来，因具有共显性、位点特异 性、操作简单、成本低、所需ＤＮＡ样品量少和对ＤＮＡ的纯度 要求不高等优点而受到了广大科研工作者的重视和兴趣，目 前已成为现代生物学研究的一个非常重要的分子标记技术， 在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到相当 广泛的应用。但是，ＣＡＰＳ标记技术的仍存在它的局限性： （１）必须使用限制性内切酶，筛选合适的酶组合工作量大；
一７６一 江苏农业科学２０１１年第３９卷第５期 ｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｃｕｈｉｖａｒｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｅｕｈｕｒａｅ，２０１０， １２３（４）：４３６—４４２． （２）各种突变会引起限制性内切酶识别位点增加或消失，这 在一定程度上限制了它的应用。然而，科技工作者在使用 ＣＡＰＳ标记技术的过程中，针对其不足，进行了富有成效的优 化和改进工作。譬如，在限制性内切酶识别位点内引入ＳＮＰ， ［１４］李晓琪．自交不亲和基因在萝 种质资源中的分布及其分子鉴 别［Ｄ］．海口：海南大学，２００８：２１—２４． ［１５］余波澜，黄朝锋，周文娟，等．大麦１Ｈ特异的ＣＡＰｓ标记和ＡＳＡ 建立ｄＣＡＰＳ方法；建立ｇｓｐＣＡＰＳ方法，采用生物信息学方法， 分析突变位点（ＳＮＰ）的序列信息，寻找合适的内切酶，避免优 化内切酶种类的工作，减少ＣＡＰＳ标记开发的工作量与内切 酶用量，显著节省了标记的开发时间和成本；利用新的ＥＳＴ， 建立ＥＳＴ—ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＡＰＳ，可对具有基因功能的ＥＳＴ片段进行 标记的创制［Ｊ］．遗传学报，２００１，２８（６）：５０—５５． ［１６］于拴仓，柴 敏，郑晓鹰，等．番茄叶霉病抗性基因 一５的 ＣＡＰＳ标记建立［Ｊ］．分子植物育种，２００５，３（１）：５７—６０． ［１７］吴媛媛，李海涛，张子君，等．番茄抗晚疫病基因 一３的ＲＡＰＤ 及ＣＡＰＳ标记［Ｊ］．沈阳农业大学学报，２００９，４０（６）：７１６—７１９． 分析；建立多重ＰＣＲ—ＣＡＰＳ标记识别体系，提高其检测基因 的效率；ＣＡＰＳ和ＳＳＣＰ、ＡＦＬＰ、ＳＣＡＲ、ＥＳＴ等ＤＮＡ分子标记一 起使用，提高遗传图谱的精度和多态性，等等。随着科学技术 的不断发展、科技工作者对ＣＡＰＳ技术体系的不断改进和优 化以及更多生物新ＤＮＡ标记的开发，我们有理由相信ＣＡＰＳ 分子标记技术将成为一种简单、经济、可靠和共显性的技术， 更加广泛有效地应用在生物学的各个研究领域，也希望能将 其与常规生物育种更好的结合起来，培育出更多生物品种。 参考文献： ［１］周延清．ＤＮＡ分子标记技术在植物研究中的应用［Ｍ］．北京：化 学工业出版社，２００５：１—３． ［２］周延清，杨清香，张改娜．生物遗传标记与应用［Ｍ］．北京：化学 工业出版社，２００８：１１—１３． ［３］卢圣栋．现代分子生物学实验技术［Ｍ］．北京：高等教育出版 社。１９９３：９８—１０３． ［４］束永俊，李勇，朱振雷，等．大豆ＣＡＰＳ标记快速开发方法的建 立于优化［Ｊ］．东北农业大学学报，２００９，４０（１２）：６２—６５． ［５］黄健华，苗雪霞，李木旺，等．家蚕基因特异性ＣＡＰＳ标记获得及 其分子系统学应用［Ｊ］．遗传，２００５，２７（４）：５８４—５８８． ［６］赵雪，谢华，马荣才．植物功能基因组研究中出现的新型分 子标记［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００７，２７（８）：１０４—１１０． ［７］谭亚玲，王石华，文建成，等．Ｒｆ一１位点ＣＡＰＳ标记对水稻不同 胞质雄性不育育性恢复系的关系分析［Ｊ］．分子植物育种，２００９， ７（３）：４６１—４６４． ［８］王彩霞．有色米的品质特性与种皮颜色性状的分子遗传学研究 ［Ｄ］．杭州：浙江大学，２００７：１６—２０． ・ ［９］刘之熙，刘云开，詹庆材．水稻孕穗期耐冷基因的ＣＡＰＳ标记辅助 选择［Ｊ】．湖南农业大学学报：自然科学版，２００８，３４（２）：１２７— １３１． ［１Ｏ］夏明元，李进波，张建华，等．利用分子标记辅助选择技术选育 具有中等直链淀粉含量的早稻品种［Ｊ］．华中农业大学学报， ２００４，２３（２）：１８３—１８． ［１ １］刘之熙．水稻耐冷性ＱＴＬｓ定位和耐冷性分子标记辅助选择育 种的研究［Ｄ］．长沙：中南大学，２００８：６６—７１． ［１２］张照远，甘四明，李发根，等．ＥＳＴ—ＣＡＰＳ标记在尾叶桉ｘ细叶 桉Ｆ。中分离的研究［Ｊ］．广西植物，２００７，２７（３）：４９３—４９６． ［１３］Ｔａｎａｋａ Ｍ，Ｔａｋａｈａｔａ Ｙ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＡＰＳ）一ｂａｓｅｄ ｍａｒｋｅ￣ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉ— ［１８］李君明．番茄抗灰霉病和晚疫病基因定位及分子标记多基因辅 助选育技术研究［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２００５：２９—３３． ［１９］朱莎，宋燕，刘磊，等．番茄ｐｓ一２基因的ＳＳＲ及ＣＡＰＳ标 记开发［Ｊ］．园艺学报，２０１０，３７（２）：２３５—２４０． ［２０］李晓琪，李锡香，罗越华，等．萝ｂ自交不亲和基因ｓＬ 的 ＣＡＰＳ标记的开发［Ｊ］．植物遗传资源学报，２００９，１０（１）：１１８— １２０． ［２１］王 亮，穆培源，桑 伟，等．新疆小麦品种籽粒硬度及 ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ基因等位变异的分子检测［Ｊ］．麦类作物学报， ２０１０，３０（１）：１７—２２． ［２２］李付振．一个水稻早衰突变体ｐｓｅ（ｔ）的遗传分析／定位及生理 学研究［Ｄ］．杭州：浙江大学，２００５：８８—９１． ［２３］王孝宣．增强番茄果实颜色基因的精细定位及相关基因的差异 表达［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２００４：８８—１０１． ［２４］王立静．玉米显性矮秆基因Ｄｆ的鉴定与精细定位［Ｄ］．济南： 山东农业大学，２００９：１８—２５． ［２５］原玉香．白菜类作物抽薹开花的分子遗传分析［Ｄ］．北京：中国 农业科学院，２００８：２６—３１． ［２６］赵仲华．拟南芥开花时间调控基因ＦＬＸ的精细定位及遗传途径 的鉴定［Ｄ］．太原：山西大学，２００６：３１—３３． ［２７］陈郁．玉米防御反应相关基因的克隆和定位［Ｄ］．北京：中国 农业大学，２００６：３３—３６． ［２８］于春霞．ｃＤＮＡ—ＡＦＬＰ和ＣＡＰＳ技术分离瓣化型胡萝 雄性不 育相关基因［Ｄ］．哈尔滨：东北农业大学，２００６：２２—２６． ［２９］Ｍｏｎｎａ Ｌ，Ｋｉｔａｚａｗａ Ｘ，Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｅｍｉｄｗａｒｆｉｎｇ ｇｅｎｅ，ｓｄ—Ｊ：Ｒｉｃｅ“Ｇｒｅｅｎ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｖｏｌｖｅ ｉｎ ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００２，９：１１—１７． ［３０］Ｓｔ０ｃｋｅｌ Ｊ，Ｂｅｒｍｅｗｉｔｚ Ｓ，Ｈｅｉｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｌＮｅｄ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ ｇｒｅｅｎ７’ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ｉ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｃｌＤｐ 犯 ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，１４１：８７０—８７８． ［３１］龚庆．香蕉不对称体细胞融合再生植株的鉴定［Ｄ］．广州：中 山大学，２００９：２２—２５． ［３２］吴扔超．柑橘体细胞杂种的核质遗传研究［Ｄ］．武汉：华中农业 大学，２００６：３１—３３． ［３３］徐小勇．柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究［Ｄ］． 武汉：华中农业大学，２００６：２８—３０． ．
2024年3月2日发(作者：拓跋元化)
一７４一 江苏农业科学２０１１年第３９卷第５期 邢延豪，周延清，楚素霞，等．ＣＡＰＳ标记技术及其应用进展［Ｊ］．江苏农业科学，２０１１，３９（５）：７４—７６ ＣＡＰＳ标记技术及其应用进展 邢延豪，周延清，楚素霞，郭静佩，周 鹏，范念斯 （河南师范大学生命科学学院，河南新乡４５３００７） 摘要：酶切扩增多态性序列（ＣＡＰＳ）标记技术是一种简单、经济、可靠和共显性的技术，适用于生物研究的许多方 面。本文综述了该标记技术的原理、过程、特点和在植物、动物和微生物的基因分型、分子标记辅助选择育种、品种鉴 定、分子标记的开发、基因鉴定、基因定位、遗传图谱构建、基因分离、体细胞杂合植株的遗传鉴定与分析诸方面应用的 新进展，并展望了其应用前景。 关键词：ＣＡＰＳ；ＤＮＡ分子标记；品种鉴定；遗传图谱；基因 中图分类号：Ｓ一１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１１）０５—００７４—０３ 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础 的遗传标记，是ＤＮＡ水平遗传多态性的直接反映 。广义的 分子标记是指可遗传的并可检测的ＤＮＡ序列或蛋白质。蛋 异性的ＰＣＲ引物（１９～２７ ｂｐ），然后用这些引物扩增该位点 上的某一ＤＮＡ片段，接着用专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行ＲＦＬＰ分析。 １．２ ＣＡＰＳ的步骤 白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶以及等位酶。狭义的分 子标记只是指ＤＮＡ分子标记，ＤＮＡ分子标记是指能反映生 物个体或种群间基因组中某种差异特征的ＤＮＡ片段。它能 够直接反映基因组ＤＮＡ间的差异。 随着分子生物学技术的发展，ＤＮＡ分子标记技术也迅速 发展，现已有数十种分子标记，如ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＴＳ、ＣＡＰＳ、 ＣＡＰＳ的基本步骤（以大豆的 ｄ２一Ｊ基因为例）：（１）选 择目标序列：在ＧｅｎＢａｎｋ上搜索大豆的 一Ｊ基因，其的登 录号为Ｌ４３９２０．１ ＧＩ：９０４１５１；（２）设计特异引物：依据大豆 ｄ２一ｊ基因的碱基序列，利用计算机软件，ＤＮＡＭＡＮ ４．０，设 计特定ＰＣＲ引物上游引物，５ 一ＡＴＧＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＧＴＣＧＴＧＴ 一ＳＣＡＲ、ＳＳＲ、ＳＮＰ、ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ、ＴＲＡＰ等，它们被广泛应用于遗 传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构 建、基因克隆等方面 。不同的分子标记有不同的优缺点， 其主要的应用也不尽相同。ＣＡＰＳ是酶切扩增多态性序列标 记技术，主要是对ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分 ３ ，下游弓Ｉ物５ 一ＡＴＡＣＡＣＧＣＣＣＴＩＴＣＴＣＧＧＡＴ一３ ；（３）ＰＣＲ 扩增：利用设计的引物从大豆基因组ＤＮＡ中扩增大豆的 ｆａｄ２一Ｊ基因；（４）酶切：利用ＤＮＡＭＡＮ ４．０软件分析，发现在 一Ｊ基因的４９９ ｂｐ和１ ０１５ ｂｐ处有２个限制性内切酶 （Ｓｃａ Ｉ）位点，利用该限制性内切酶（Ｓｃａ Ｉ）对ＰＣＲ扩增产物 进行酶切；（５）琼脂糖电泳分离与鉴定：用琼脂糖凝胶对酶切 产物分析，检测其多态性。 ２ ＣＡＰＳ的特点 析 ，具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低等优点， 广泛应用于植物基因分型、定位、克隆、分子鉴定 和动物的 遗传多样性、品种鉴定以及微生物的连锁图谱和品种鉴定 等方面。目前本实验室正在开展大豆油酸脱饱和酶基因的 ＣＡＰＳ标记及其多样性研究。本文对ＣＡＰＳ标记技术研究进 （１）引物与限制性内切酶组合非常多，增加了揭示多态 性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖电泳分析；（２）在真核 展进行综述，以期对科研工作者提供一些参考。 １ ＣＡＰＳ的原理及步骤 １．１ ＣＡＰＳ的原理 生物中，ＣＡＰＳ标记呈共显性，即可区分纯合基因型和杂合基 因型；（３）所需ＤＮＡ的量很少，且对ＤＮＡ的浓度要求不严 格；（４）使用的引物较长，扩增的结果比较稳定且避免了 ＲＦＬＰ分析中膜转印这一步骤，又能保持ＲＦＬＰ分析的精确 ＣＡＰＳ是酶切扩增多态性序列标记技术，又称为ＲＦＬＰ— ＰＣＲ，主要是对ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分析。 度；（５）操作简便、快捷和自动化程度高。虽然ＣＡＰＳ标记有 诸多优点，但由于它必须使用限制性内切酶，筛选合适的酶组 合工作量大，而且，已发现的突变酶切位点较少，限制了它的 大规模开发应用。 ３ ＣＡＰＳ的应用 ３ ．１基因分型 它是根据ＥＳＴ或已发表的基因序列等设计特异引物，将特异 ＰＣＲ与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术 。它 的基本原理是利用己知位点的ＤＮＡ序列资源设计出一套特 收稿日期：２０１０—１１—２５ 基金项目：河南省基础与前沿技术研究（编号：０９２３００４１０００９）；河南 省教育厅自然科学基础研究（编号：２００８Ａ２０８０１８）。 谭亚玲等通过对位于Ｒｆ—ｔ位点的２个ＣＡＰＳ标记对水 稻滇Ｉ型、野败型、红莲型及ＢＴ型恢复系基因型分析，发现这 ４种不同胞质的恢复系在Ｒｆ一１位点具有相同的带型，滇Ｉ型 的２个保持系具有不同的带型。王彩霞 根据ＧＴ缺失开发 了１个ＣＡＰＳ标记ＣＡＰＳＲａ，而且用它对２个Ｆ：分离群体和 作者简介：邢延豪（１９８３一），男，河南汝州人，硕士研究生，研究方向 为植物分子遗传与育种。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｑＯ４０９１２ｙａｎｈａｏ＠１６３．ｔｏｍ。 通信作者：周延清，博士，教授，研究方向为植物分子遗传与育种。 Ｔｅｌ：（０３７３）３３２６３４０；Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｑｚｈｏｕ＠ｈｔｕ．ｃｎ。
邢延豪等：ＣＡＰＳ标记技术及其应用进展 １００余份水稻品种进行分析。结果发现，所有Ｆ２白米单株以 及所有白米（ｎ：６３）和红米（ｎ＝２３）品种的ＣＡＰＳＲａ基因型 一７５— 验中，２４４ ｂｐ片段为萝卜自交不亲合系特有标记，基本可以用 于萝卜自交不亲和基因乩Ｇ６的检测。王亮等分析了新疆小 麦ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ基因等位变异情况 。 ３．６构建遗传图谱 与培矮６４Ｓ相同，而所有紫米品种（ ＝２０）与豫南黑籼糯和 川黑糯相同 。根此推测，砌基因可能即为 基因，水稻紫 色种皮性状可能由Ｒａ基因的ＧＴ缺失引起。 ３．２辅助选择育种 赵雪构建了ｌ张包含４７个位点的分子标记连锁图，其中 包括１６个ＥＳＴ—ＣＡＰＳ位点，１１个ＥＳＴ—ＳＳＲ位点，ｌ０个ＥＳＴ —传统的育种主要依赖于植株的表现型选择。环境条件、 基因间互作、基因型等多种因素会影响表型选择效率。１个 优良品种的培育往往需花费７～８年甚至十几年时间，而借助 分子标记辅助育种可以大大提高育种的效率，还可以提高它 ＲＣＲ位点，１０个ＲＡＰＤ位点，９个标记表现出偏分离 ］。 李付振基于水稻粳稻和籼粳基因组序列设计４６对ＳＳＲ和 ＣＡＰＳ标记，利用Ｆ：代１ ６９１个突变个体和２ ００２个野生型单 株，构建了含有Ｐｓｅ（ｔ）位点的高密度遗传图谱 ］。 ’ 的准确率。刘之熙等用ＣＡＰＳ标记辅助选择水稻孕穗期耐冷 基因。他们利用的ＣＡＰＳ标记Ｓ 与孕穗期耐冷主效ＱＴＬ 之间的遗传距离为１ ｃＭ，选择的准确率达９９％ 。如果在 代选择２株，则２株均不含目的基因的可能性为万分之 一；如果择３株，则在３株中不含该基因的可能性将更小。夏 明元等利用 基因的ＣＡＰＳ标记开展水稻直链淀粉含量的 分子标记辅助育种，将优质性状导人高产品种，从而选育出优 质高产水稻品种 。刘之熙研究水稻耐冷性分子标记ＣＡＰＳ 辅助选择育种，从３个 群体中，分别选出携带纯合耐冷基 因的个体４株、２株和６株 。张照远等研究了ＥＳＴ—ＣＡＰＳ 标记在尾叶桉ｘ细叶桉Ｆ 中分离规律，发现符合孟德尔正 态分离的ＥＳＴ～ＣＡＰＳ标记比例达８５．７％，是稳定的遗传 标记 。 ３．３品种鉴定 Ｔａｎａｋａ等在１３本国内首次用ＣＡＰＳ标记研究日本甘薯分 类，他们以１１个品种的外显子序列为依据设计了１３对引物 来扩增内含子，然后用８个限制性内切酶酶切，结果得到了 ２７个多态性的分子标记片段 。他们用这些分子标记片段 有效地把日本的甘薯品种分开。李晓琪用ＣＡＰＳ标记快速、 准确地鉴别了萝卜的自交不亲和系和自交亲和系 。 ３．４分子标记的开发 余波澜等开发了大麦特异的ＡＳＡ标记 。于拴仓等根 据番茄叶霉病抗性基因ｃｆ一５的基因序列设计特异扩增引 物，以７个含有不同叶霉病抗病基因的品种为试材，扩增其单 拷贝片段，７个材料均获得了约０．９６ ｋｂ的特异扩增片段；用 限制性内切酶Ｔａｑ Ｉ对该片段进行酶切，含ｃｆ一５基因的材料 产生了一条２５６ ｂｐ的特异片段，而不含ｃ厂一 基因的材料产 生１条２２５ ｂｐ的特异片段。从而建立了ｃｆ一５基因的共显性 ＣＡＰＳ标记 。吴嫒嫒等建立了番茄抗晚疫病基因ｐｈ一３的 ＲＡＰＤ及ＣＡＰＳ标记 Ｊ。李君明利用近等基因系获得了与番 茄的来自ＬＡ２９５１抗病ＱＴＬｌｙｇｍ７—１紧密连锁的ＣＡＰＳ标 记 。朱莎等获得了番茄与雄性不育基因ｐｓ一２紧密连锁 的１个ＳＳＲ标记和１个ＣＡＰＳ标记，它们与ｐｓ一２基因的连锁 遗传距离分别是４．９ ｃＭ和ｌ１．６ ｃＭ，位于该基因两侧，均为 共显性标记 。 ３．５基因鉴定 李晓琪等在研究萝卜的自交不亲和基因ＳＬＧ６时，用限 制性内切酶Ｔａｑ Ｉ对特异扩增片段进行酶切后，电泳检测结 果表明，自交不亲和系和自交亲和系均含有ＳＬＧ基因基本框 架序列，但是自交亲和系相对于自交不亲和系而言，碱基序列 排列可能发生了变化，所以酶切片段呈现多态性 。在该实 ３．７基因定位 王孝宣获得了多毛番茄的ＣＡＰＳ标记，利用ＣＡＰＳ和 ＡＦＬＰ标记构建了番茄第４染色体底端长５０ ｃＭ片段的精密 分子遗传图谱，利用Ｍｕｔｉｐｌｅｘ—ＣＡＰＳ技术同时检测多个 ＣＡＰＳ标记的多态性 。王立静基于ＳＳＲ标记开发了ＣＡＰＳ 标记Ｃ１，把玉米显性矮秆基因Ｄ￡基因定位在ＣＡＰＳ标记Ｃ１ 和￥７６之间，遗传距离分别是３．０、３．５ ｃＭ 。原玉香定位了 白菜类作物６个重要的开花时间相关基因，包括３个 ＢｒＦＬＣｓ、２个ＭＡＦ和１个ｎ 。赵仲华利用简单序列长度 多态性标记（ＳＳＬＰ）和ＣＡＰＳ将拟南芥开花时间调控基因ＦＬＸ 定位于拟南芥第５条染色体上端标记ＭＯＰＩＯ一２８５５１和 Ｋ１８ｊ１７—１２８３６之间，大约１３０ ｋｂ的范围之内 Ｊ。陈郁基于 现有玉米防御相关的ＥＳＴ序列发展ＳＴＳ标记和ＣＡＰＳ标记， 用豫玉２２号第１Ｏ代重组自交系群体定位了其中的１３个防 御反应相关基因 。 ３．８基因分离与图位克隆 于春霞通过ＣＡＰＳ标记的筛选，分别获得不育系和保持 系的ａｔｐ６基因片段，分析了二者的差异以及对瓣化型胡萝卜 雄性不育发生的影响［２８ Ｊ。Ｌｉｓａ等用ＣＡＰＳ和ｄＣＡＰＳ标记技 术图位克隆了水稻半矮化基因ｓｄ—ｊ 。Ｓｔ￣ｃｋｄ等使用ｓｓ． ＬＰ和ＣＡＰＳ标记图位克隆基因ｐｙｇ７ 。 ３．９体细胞杂合植株的遗传鉴定与分析 龚庆利用ＣＡＰＳ标记技术对香蕉融合再生植株进行检 测。结果表明，在２０株香蕉融合再生植株中没有筛选到胞质 杂种，它们的ＣＡＰＳ图谱与受体亲本一致，无供体亲本的条 带，也没有出现重组条带 。吴初超采用ＳＳＲ、ｃｐＳＳＲ和 ＣＡＰＳ标记对１０个柑橘属间、种间体细胞杂种进行核质遗传 鉴定和分析，在红橘＋枳橙、丹西红橘＋枸头橙、朋娜＋粗柠 檬的ＣＡＰＳ分析中，线粒体ＤＮＡ均表现倾向来源于悬浮系亲 本；而朋娜＋粗柠檬组合再生植株的ｍｔＤＮＡ发生了重组 。 徐小勇采用ＦＣＭ、ＳＳＲ、ＳＲＡＰ和ＣＡＰＳ对４个融合组合的再 生植株的倍性、核和胞质ＤＮＡ来源进行了鉴定 。 ４展望 ＣＡＰＳ标记技术自建立以来，因具有共显性、位点特异 性、操作简单、成本低、所需ＤＮＡ样品量少和对ＤＮＡ的纯度 要求不高等优点而受到了广大科研工作者的重视和兴趣，目 前已成为现代生物学研究的一个非常重要的分子标记技术， 在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到相当 广泛的应用。但是，ＣＡＰＳ标记技术的仍存在它的局限性： （１）必须使用限制性内切酶，筛选合适的酶组合工作量大；
一７６一 江苏农业科学２０１１年第３９卷第５期 ｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｃｕｈｉｖａｒｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｅｕｈｕｒａｅ，２０１０， １２３（４）：４３６—４４２． （２）各种突变会引起限制性内切酶识别位点增加或消失，这 在一定程度上限制了它的应用。然而，科技工作者在使用 ＣＡＰＳ标记技术的过程中，针对其不足，进行了富有成效的优 化和改进工作。譬如，在限制性内切酶识别位点内引入ＳＮＰ， ［１４］李晓琪．自交不亲和基因在萝 种质资源中的分布及其分子鉴 别［Ｄ］．海口：海南大学，２００８：２１—２４． ［１５］余波澜，黄朝锋，周文娟，等．大麦１Ｈ特异的ＣＡＰｓ标记和ＡＳＡ 建立ｄＣＡＰＳ方法；建立ｇｓｐＣＡＰＳ方法，采用生物信息学方法， 分析突变位点（ＳＮＰ）的序列信息，寻找合适的内切酶，避免优 化内切酶种类的工作，减少ＣＡＰＳ标记开发的工作量与内切 酶用量，显著节省了标记的开发时间和成本；利用新的ＥＳＴ， 建立ＥＳＴ—ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＡＰＳ，可对具有基因功能的ＥＳＴ片段进行 标记的创制［Ｊ］．遗传学报，２００１，２８（６）：５０—５５． ［１６］于拴仓，柴 敏，郑晓鹰，等．番茄叶霉病抗性基因 一５的 ＣＡＰＳ标记建立［Ｊ］．分子植物育种，２００５，３（１）：５７—６０． ［１７］吴媛媛，李海涛，张子君，等．番茄抗晚疫病基因 一３的ＲＡＰＤ 及ＣＡＰＳ标记［Ｊ］．沈阳农业大学学报，２００９，４０（６）：７１６—７１９． 分析；建立多重ＰＣＲ—ＣＡＰＳ标记识别体系，提高其检测基因 的效率；ＣＡＰＳ和ＳＳＣＰ、ＡＦＬＰ、ＳＣＡＲ、ＥＳＴ等ＤＮＡ分子标记一 起使用，提高遗传图谱的精度和多态性，等等。随着科学技术 的不断发展、科技工作者对ＣＡＰＳ技术体系的不断改进和优 化以及更多生物新ＤＮＡ标记的开发，我们有理由相信ＣＡＰＳ 分子标记技术将成为一种简单、经济、可靠和共显性的技术， 更加广泛有效地应用在生物学的各个研究领域，也希望能将 其与常规生物育种更好的结合起来，培育出更多生物品种。 参考文献： ［１］周延清．ＤＮＡ分子标记技术在植物研究中的应用［Ｍ］．北京：化 学工业出版社，２００５：１—３． ［２］周延清，杨清香，张改娜．生物遗传标记与应用［Ｍ］．北京：化学 工业出版社，２００８：１１—１３． ［３］卢圣栋．现代分子生物学实验技术［Ｍ］．北京：高等教育出版 社。１９９３：９８—１０３． ［４］束永俊，李勇，朱振雷，等．大豆ＣＡＰＳ标记快速开发方法的建 立于优化［Ｊ］．东北农业大学学报，２００９，４０（１２）：６２—６５． ［５］黄健华，苗雪霞，李木旺，等．家蚕基因特异性ＣＡＰＳ标记获得及 其分子系统学应用［Ｊ］．遗传，２００５，２７（４）：５８４—５８８． ［６］赵雪，谢华，马荣才．植物功能基因组研究中出现的新型分 子标记［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００７，２７（８）：１０４—１１０． ［７］谭亚玲，王石华，文建成，等．Ｒｆ一１位点ＣＡＰＳ标记对水稻不同 胞质雄性不育育性恢复系的关系分析［Ｊ］．分子植物育种，２００９， ７（３）：４６１—４６４． ［８］王彩霞．有色米的品质特性与种皮颜色性状的分子遗传学研究 ［Ｄ］．杭州：浙江大学，２００７：１６—２０． ・ ［９］刘之熙，刘云开，詹庆材．水稻孕穗期耐冷基因的ＣＡＰＳ标记辅助 选择［Ｊ】．湖南农业大学学报：自然科学版，２００８，３４（２）：１２７— １３１． ［１Ｏ］夏明元，李进波，张建华，等．利用分子标记辅助选择技术选育 具有中等直链淀粉含量的早稻品种［Ｊ］．华中农业大学学报， ２００４，２３（２）：１８３—１８． ［１ １］刘之熙．水稻耐冷性ＱＴＬｓ定位和耐冷性分子标记辅助选择育 种的研究［Ｄ］．长沙：中南大学，２００８：６６—７１． ［１２］张照远，甘四明，李发根，等．ＥＳＴ—ＣＡＰＳ标记在尾叶桉ｘ细叶 桉Ｆ。中分离的研究［Ｊ］．广西植物，２００７，２７（３）：４９３—４９６． ［１３］Ｔａｎａｋａ Ｍ，Ｔａｋａｈａｔａ Ｙ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＡＰＳ）一ｂａｓｅｄ ｍａｒｋｅ￣ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉ— ［１８］李君明．番茄抗灰霉病和晚疫病基因定位及分子标记多基因辅 助选育技术研究［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２００５：２９—３３． ［１９］朱莎，宋燕，刘磊，等．番茄ｐｓ一２基因的ＳＳＲ及ＣＡＰＳ标 记开发［Ｊ］．园艺学报，２０１０，３７（２）：２３５—２４０． ［２０］李晓琪，李锡香，罗越华，等．萝ｂ自交不亲和基因ｓＬ 的 ＣＡＰＳ标记的开发［Ｊ］．植物遗传资源学报，２００９，１０（１）：１１８— １２０． ［２１］王 亮，穆培源，桑 伟，等．新疆小麦品种籽粒硬度及 ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ基因等位变异的分子检测［Ｊ］．麦类作物学报， ２０１０，３０（１）：１７—２２． ［２２］李付振．一个水稻早衰突变体ｐｓｅ（ｔ）的遗传分析／定位及生理 学研究［Ｄ］．杭州：浙江大学，２００５：８８—９１． ［２３］王孝宣．增强番茄果实颜色基因的精细定位及相关基因的差异 表达［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２００４：８８—１０１． ［２４］王立静．玉米显性矮秆基因Ｄｆ的鉴定与精细定位［Ｄ］．济南： 山东农业大学，２００９：１８—２５． ［２５］原玉香．白菜类作物抽薹开花的分子遗传分析［Ｄ］．北京：中国 农业科学院，２００８：２６—３１． ［２６］赵仲华．拟南芥开花时间调控基因ＦＬＸ的精细定位及遗传途径 的鉴定［Ｄ］．太原：山西大学，２００６：３１—３３． ［２７］陈郁．玉米防御反应相关基因的克隆和定位［Ｄ］．北京：中国 农业大学，２００６：３３—３６． ［２８］于春霞．ｃＤＮＡ—ＡＦＬＰ和ＣＡＰＳ技术分离瓣化型胡萝 雄性不 育相关基因［Ｄ］．哈尔滨：东北农业大学，２００６：２２—２６． ［２９］Ｍｏｎｎａ Ｌ，Ｋｉｔａｚａｗａ Ｘ，Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｅｍｉｄｗａｒｆｉｎｇ ｇｅｎｅ，ｓｄ—Ｊ：Ｒｉｃｅ“Ｇｒｅｅｎ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｖｏｌｖｅ ｉｎ ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００２，９：１１—１７． ［３０］Ｓｔ０ｃｋｅｌ Ｊ，Ｂｅｒｍｅｗｉｔｚ Ｓ，Ｈｅｉｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｌＮｅｄ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ ｇｒｅｅｎ７’ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ｉ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｃｌＤｐ 犯 ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，１４１：８７０—８７８． ［３１］龚庆．香蕉不对称体细胞融合再生植株的鉴定［Ｄ］．广州：中 山大学，２００９：２２—２５． ［３２］吴扔超．柑橘体细胞杂种的核质遗传研究［Ｄ］．武汉：华中农业 大学，２００６：３１—３３． ［３３］徐小勇．柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究［Ｄ］． 武汉：华中农业大学，２００６：２８—３０． ．