2024年3月7日发(作者：宇文欣笑)
实验前准备：
1.冰上预冷N3 Buffer
2.设定金属浴或水浴至42℃
3.如果质粒DNA大于10kb，70℃预热Elution Buffer
4.按要求准备DNA Wash Buffer、HBC Buffer 和Solution I
实验步骤：
1.挑取单克隆于1-5ml LB抗性培养基上，37℃×200rpm ～12-16h，至OD600于2.0-3.0之间。
2.室温10000g×1min，弃上清，收集菌体。
3.加入250ml Solution I/RNase A, 涡旋或上下颠倒混匀，重悬。（注意：Solution I使用前加入RNase）
4.加入250μL Solution II，轻轻上下颠倒数次，置2-3min至得到澄清裂解液。（注意：务必轻柔操作；裂解时间不超过5min；Solution
II 使用后及时盖紧，防止吸入CO2）
5.加入125μL 冰浴N3 Buffer。轻轻上下颠倒直至出现白色絮状沉淀，13000g×10min，分离沉淀。（注意：如果混合液出现黏稠、棕色和球状，需加入更多中和液，完全中和对高产率至关重要）
7.转移上清至另一1.5ml离心管并测定体积。
8.加入0.1上述体积的ETR Solution，上下颠倒10次完全混匀。
9.冰浴10min。过程中不时上下颠倒数次。（注意：加入ETR后变混浊，冰浴完成重新变澄清）
10.于42℃孵育裂解液5min，裂解液再次混浊。
11.25℃下12000g×3min，ETR Solution在管底形成蓝色层。
12.转移上层水相至新的1.5ml离心管，加入0.5倍体积的常温无水乙醇。轻轻上下颠倒5-6次。室温放置1-2min。
13.将HiBind DNA Mini Column 放入2ml收集管中。
（可选步骤：加入100μL 3M NaOH 至HiBind DNA Mini Column，
13000g×1min，弃废液）
14. 转移12步骤中液体至HiBind DNA Mini Column中，13000g×1min，弃废液。
16.加入500μL HBC Buffer，13000g×1min，弃废液。（注意：HBC
Buffer 在使用前需用异丙醇稀释）
18.加入700μL DNA Wash Buffer，13000g×1min，弃废液。（DNA Wash
Buffer使用前需用无水乙醇稀释）
20.重复18步骤
21.空管离心HiBind DNA Mini Column，13000g×2min。（注意：洗脱前，干燥HiBind DNA Mini Column非常重要，残留乙醇可能干扰质粒后续使用）
22.转移HiBind DNA Mini Column至新1.5ml离心管中。
23.加入30-100μL Elution Buffer或去离子水（ddH2O）至HiBind DNA
Mini Column正中膜上，室温静置1min，13000g×1min。（注意：a.洗脱效率与pH值相关，如果使用去离子水/ddH2O，请确保其pH值在约8.5； b. 为了提高产率，可重复洗脱）
26.-20℃保存DNA。
2024年3月7日发(作者：宇文欣笑)
实验前准备：
1.冰上预冷N3 Buffer
2.设定金属浴或水浴至42℃
3.如果质粒DNA大于10kb，70℃预热Elution Buffer
4.按要求准备DNA Wash Buffer、HBC Buffer 和Solution I
实验步骤：
1.挑取单克隆于1-5ml LB抗性培养基上，37℃×200rpm ～12-16h，至OD600于2.0-3.0之间。
2.室温10000g×1min，弃上清，收集菌体。
3.加入250ml Solution I/RNase A, 涡旋或上下颠倒混匀，重悬。（注意：Solution I使用前加入RNase）
4.加入250μL Solution II，轻轻上下颠倒数次，置2-3min至得到澄清裂解液。（注意：务必轻柔操作；裂解时间不超过5min；Solution
II 使用后及时盖紧，防止吸入CO2）
5.加入125μL 冰浴N3 Buffer。轻轻上下颠倒直至出现白色絮状沉淀，13000g×10min，分离沉淀。（注意：如果混合液出现黏稠、棕色和球状，需加入更多中和液，完全中和对高产率至关重要）
7.转移上清至另一1.5ml离心管并测定体积。
8.加入0.1上述体积的ETR Solution，上下颠倒10次完全混匀。
9.冰浴10min。过程中不时上下颠倒数次。（注意：加入ETR后变混浊，冰浴完成重新变澄清）
10.于42℃孵育裂解液5min，裂解液再次混浊。
11.25℃下12000g×3min，ETR Solution在管底形成蓝色层。
12.转移上层水相至新的1.5ml离心管，加入0.5倍体积的常温无水乙醇。轻轻上下颠倒5-6次。室温放置1-2min。
13.将HiBind DNA Mini Column 放入2ml收集管中。
（可选步骤：加入100μL 3M NaOH 至HiBind DNA Mini Column，
13000g×1min，弃废液）
14. 转移12步骤中液体至HiBind DNA Mini Column中，13000g×1min，弃废液。
16.加入500μL HBC Buffer，13000g×1min，弃废液。（注意：HBC
Buffer 在使用前需用异丙醇稀释）
18.加入700μL DNA Wash Buffer，13000g×1min，弃废液。（DNA Wash
Buffer使用前需用无水乙醇稀释）
20.重复18步骤
21.空管离心HiBind DNA Mini Column，13000g×2min。（注意：洗脱前，干燥HiBind DNA Mini Column非常重要，残留乙醇可能干扰质粒后续使用）
22.转移HiBind DNA Mini Column至新1.5ml离心管中。
23.加入30-100μL Elution Buffer或去离子水（ddH2O）至HiBind DNA
Mini Column正中膜上，室温静置1min，13000g×1min。（注意：a.洗脱效率与pH值相关，如果使用去离子水/ddH2O，请确保其pH值在约8.5； b. 为了提高产率，可重复洗脱）
26.-20℃保存DNA。