2024年3月11日发(作者：林天心)
第２８卷第６期 孝感学院学报
Ｖ０Ｌ．２８ Ｎ０．６
２００８年１１月
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＸＩＡＯＧＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｎ０Ｖ．２００８
海甘蓝硫甙合成关键酶Ｓ—ＧＴ基因克隆及
种子特异性ｈｐＲＮＡｉ载体构建
李长春 ，乔富兴
（１．孝感学院生命科学技术学院，湖北孝感４３２０００；２．湖北大学生命科学学院，湖北武汉４３００６２）
摘要：根据甘蓝型油菜Ｓ－ＧＴ（ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ Ｓ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）基因ｅＤＮＡ序列设计引物，以海甘
蓝总ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得孓ＧＴ基因全长。克隆的海甘蓝Ｓ—ＧＴ序列与甘蓝型油菜序列相比，除
７４ ｂｐ的内含予部分外有９２个碱基的差别，相似性高达９３．４％。分析显示该序列均有完整的开放阅读框，并
表明所克隆的海甘蓝Ｓ－ＧＴ序列编码４６５个氨基酸，在第１Ｏ个位点上比甘蓝型油菜序列少一个丙氨酸（Ａ），
总共有２３个氨基酸不同，相似性为９５．Ｏ６ 。根据获得的基因序列设计引物扩增出同一基因序列相同但是带
有不同酶切位点的两个片段，将两个片段反向插入到已构建的带有种子特异表达载体内含子的两端．成功构建
了海甘蓝Ｓ－ＧＴ基因的种子特异性ｈｐＲＮＡｉ载体，为特异性降低海甘蓝的种子硫甙奠定了基础。
关键词：海甘蓝；硫甙；ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ Ｓ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｈｐＲＮＡｉ载体
中图分类号：Ｑ７８５；Ｓ５６５．４０３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１—２５４４（２００８）０６—００１１～Ｏ５
海甘蓝（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）因含有很高的 基因全长，构建了该基因的种子特异性干扰载体，
芥酸作为一种新兴油料作物受到越来越多的关 期望只在种子中降低硫甙而不影响植株其他器官
注，其脱脂去壳的饼粕中蛋白质含量高达４８．８
的硫甙水平。
，
且含有较高的苯丙氨酸和含硫氨基酸，营养价
值高，是优质的植物蛋白源，但由于其种子中高含
１材料与方法
量的硫代葡萄糖甙（ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ，ＧＳ，简称硫甙）
１．１ 材料
（７Ｏ～１５０￣ｍｏｌ／ｇ），影响其应用价值［１］。硫甙是 海甘蓝由瑞典Ｎｏｒｄｉｃ ＧｅｎｅＢａｎｋ提供，大肠
广泛存在于十字花科植物的一类含硫次生代谢
杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ菌株，种子特异表
物，在芥子酶的作用下可生成异硫氰酸盐，嗯唑烷
达载体２３００一ｎａｐ由湖北大学黄邦全教授保存啪。
硫酮等有毒代谢物，影响其作为饲料的适口性和
克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ、限制性内切酶、Ｔ。ＤＮＡ连
动物生长［２。］。研究表明，硫甙是十字花科等植物
接酶、Ｅｘ－Ｔａｑ酶、４种ｄＮＴＰ和ＤＮＡ纯化试剂盒
中一类活跃的次生代谢物，维持正常硫甙水平是 等均购自ＴａＫａＲａ公司，ＤＮＡ分子量标准购自
植物的一种自我保护机制，其水解物可有效的提 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，其他常规试剂采用进口分装或
高植物的抗虫抗病能力，硫甙的另一重要生理功
国产分析纯。
能是在硫胁迫时作为一种硫的有效贮藏形式［４ ］。
１．２ 方法
Ｓ—ＧＴ（Ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｒｉｆａｔｅ Ｓ—ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）是
１．２．１植物ＤＮＡ的提取
催化硫甙核心结构合成的一个关键酶［６］。在本研 参照李佳等ＩＳ］修改后的ＳＤＳ法从幼嫩的油
究中我们克隆了海甘蓝中硫甙合成关键酶Ｓ－ＧＴ 菜叶片中提取ＤＮＡ。
收稿日期：２００８～Ｏ９—１８
基金项目：湖北省教育厅国际合作重点项目（２００５ＣＡ０２０；Ｇ２００５１０００１）；
Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｎｋｓ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（３４８—２０Ｏ６—６６８４）
作者简介：李长春（１９７６一），男，湖北广水人，孝感学院生命科学技术学院教师。
李长春，乔富兴
１．２．２海甘蓝Ｓ—ＧＴ基因全长的ＰＣＲ扩增
列（Ｙ１３６６９．１），设计引物Ｉｎｔｒｏｎ—Ｂａｍ：５ ＡＴＡＴ—
ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＣＣＧＧＣＡＴＴＡＣＣ ３ ：Ｉｎ—
ｔｒｏｎ—Ｘｂａ：５ ＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＣ
根据甘蓝型油菜Ｓ—ＧＴ ｃＤＮＡ全长序列
（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ３０４４３０），直接从该序列
的５ 端和３ 端设计引物ＢＦ：５ ＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡ—
ＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ ３ ；ＢＲ：５ ＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＴ—
ＧＣＣＡＣＣＡＣＴＡＧＴ ３ 。以核盘菌总ＤＮＡ为模
板，扩增出包含Ｐｇ５第４内含子（７３ｂｐ）的３３９
ｂｐ片段，同样将片段连克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ，筛选
ＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴ ＣＴＣＣＡ ３ ，以海甘蓝基因组
因ＣａＳＧＴ。
ＤＮＡ为模板扩增出Ｓ—ＧＴ全长基因，命名为基
后送交Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序，带内含子的重组子
命名为Ｔ—ｉｎｔｒｏｎ。以重组质粒Ｔ—ＣａＳＧＴ为模板，
设计如下带不同酶切位点的干扰引物。
（’－Ｓｍａ Ｉ：５ ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＣＣＴＴ
ＣＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧ ３ ：
１．２．３基因ＣａＳＧＴ的克隆与测序
ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶纯化后，连接克隆载
体ｐＭＤ１８一Ｔ，连接物转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受
态细胞，重组子经鉴定后送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（上
Ｃ—ＢａｍＨ Ｉ：５ ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣ
ＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＣＡＧ ３ ：
海）测序。连接基因Ｃ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ－Ｓｇｔ的Ｔ载体
重组质粒命名为质粒Ｔ－ＣａＳＧＴ。
１．２．４ 内含子与干扰小片段的克隆
根据核盘菌Ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｏｒａｓｅ ５（Ｐｇ５）基因序
Ｃ Ｓａｌ Ｉ：５ ＡＴＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣＣＡＣＣＡ
ＣＣＡＣＣＴＡＣＡＣＡＧ ３ ：
Ｃ＿Ｐ Ｉ：５ ＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＧＣＣＴＴＣ
Ｓｍａ
№
３５Ｓ ｐｏｌｙＡ ｓｅｎｅ ｇｅｎｅｆ、
ｊｎｔｒｏ１３＝
ａｎｔｉ・ｓｅｎｅ ｏｅｎｅ
—
日ａＩＴ＝Ｈ
－
ＳａｌＩ
ＰｓＩＩ
ＰＢＲ３２２
Ｎ０Ｓ—、
ｎａ
Ｎ０Ｓ
ｇｅｎｅ
。
／
图１重组质粒ｐＣａｍｂｉａ２３００一ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ－ｉｎｔｒｏｎ的构建
一
１２一
海甘蓝硫甙合成关键酶Ｓ～ＧＴ基因克隆及种子特异性ｈｐＲＮＡｉ载体构建
ＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧ ３ 。
氨基酸不同，相似性为９５．Ｏ６ 。
２．２ Ｐｇ５内含子及干扰基因片段的扩增
油菜核盘菌Ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｏｒａｓｅ的第４个内含子
ＰＣＲ扩增得到相应的基因干扰片段，以引物
Ｃ－Ｓｍａ Ｉ和Ｃ－ＢａｍＨ Ｉ扩增产物命名为Ｃ—ｓｂ，Ｃ—
段仅两端的酶切位点不同。
１．２．５ 种子特异表达ＲＮＡｉ干扰载体的构建
Ｓａｌ Ｉ和Ｃ＿Ｐ盯Ｉ扩增产物命名为为Ｃ－ｓｐ，两个片 序列长７４ｂｐ，从其上游１７９ｂｐ处设计正向引物
Ｉｎｔｒｏｎ－Ｂａｍ，下游８６ｂｐ处设计反向引物Ｉｎｔｒｏｎ．
Ｘｂａ，ＰＣＲ扩增得到一个３３９ｂｐ的带内含子的序
第一步，用ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｂａ １分别酶切２３００一
列，Ｔ—Ａ克隆后测序验证所得序列完全正确。分
Ｉ，
ｎａｐ和Ｔ－ｉｎｔｒｏｎ，回收２３００－ｎａｐ载体骨架与Ｔ－ｉｎ—
别用引物Ｃ－Ｓｍａ Ｉ，Ｃ—ＢａｍＨ Ｉ和引物Ｃ—Ｓａｌ
ｔｒｏｎ的基因片段，将二者连接，构建成带内含子的
种子特异性表达载体２３００一ｎａｐ—ｉｎ；第二步，用
Ｓｍａ Ｉ和ＢａｍＨ工分步分别酶切２３００一ｎａｐ—ｉｎ和
Ｃ—ｓｂ，得到两端含有Ｓｍａ Ｉ和ＢａｍＨ Ｉ粘性末端
的载体骨架和Ｃ—ｓｂ基因片段，再将载体骨架和基
因片段分别连接，得到内含子左边含有目的基因
片段的质粒，命名为２３００－ｎａｐ—ｉｎ—ＣａＳＧＴ；第三
步，用Ｓａｌ Ｉ和Ｐｓｔ １分别双酶切质粒２３００一ｎａｐ—ｉｎ
—
ＣａＳＧＴ和Ｃ－ｓｐ，得到两端含有Ｓａｌ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ粘
性末端的载体骨架和Ｃ－ｓｐ基因片段，再将片段
２３００一ｎａｐ—ｉｎ－ＣａＳＧ丁与Ｃ－ｓｐ连接即得到内含子两
端带有反向互补目的基因片段的ＲＮＡｉ载体，命
名为２３００一ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ－ｉｎｔｒｏｎ（图１）。
２结果与分析
２．１海甘蓝硫甙合成酶Ｓ—ＧＴ基因的克隆与测序
根据甘蓝型油菜Ｓ—ＧＴ ｃＤＮＡ全长序列在设
计引物，以海甘蓝总ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，
得到１４７２ｂｐ的序列（图２）。
１ ２ ３ ４ ５ ６
２０００ｂｐ
１５００ｂｐ
１：ＤＬ－１００００ ＤＮＡ分子量标准；
２～６：ＣａＳＧＴ基因全长的ＰＣＲ扩增
图２ ＣａＳＧＴ基因的ＰＣＲ扩增
序列比较结果表明所克隆海甘蓝Ｓ—ＧＴ序
列，除７４ ｂｐ的内含子部分外有９２个碱基的差
别，相似性高达９３．４％，分析显示该序列具有完
整的开放阅读框。分析表明所克隆的海甘蓝Ｓ—
ＧＴ序列编码４６５个氨基酸，在第１Ｏ个位点上比
油菜发表序列少一个丙氨基酸（Ａ），总共有２３个
Ｃ－Ｐｓｔ Ｉ以质粒Ｔ：ＣａＳＧＴ为模板扩增得到海甘蓝
目的基因两个干扰片段，除两端的酶切位点外，序
列完全相同，大小为６３４ｂｐ（图３）。
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７
１０００ｂｐ
７５０ｂｐ
５００ｂｐ
１：ＤＬ－２０００ ＤＮＡ分子量标准；
２～４：ＣａＳＧＴ基因片断的ＰＣＲ扩增；
５～７：带内含子片断的ＰＣＲ扩增
图３内含子和干扰目的片段的ＰＣＲ扩增
２．３干扰载体的构建与验证
经过ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｂａ Ｉ酶切的质粒２３００一ｎａｐ
和Ｔ—ｉｎｔｒｏｎ，连接转化大肠杆菌以后，先通过ＰＣＲ
进行筛选，另外由于距内含子上游１１４７ｂｐ的ｎａｐ—
ｉｎ启动子上，距内含子下游３１０ｂｐ的ＮＯＳ终止子
末端和内含子中距５ 端４２ｂｐ处都有一个Ｈｉｎｄ［］］
酶切位点，用ＨｉｎｄⅢ酶切２３００一ｎａｐ—ｉｎ得到了预
期的６０７ｂｐ和１１８９ ｂｐ的两条小带，表明内含子
已成功插入。基因片段Ｃ—ｓｂ大小约为６３４ｂｐ，酶
切后连到质粒２３００－ｎａｐ－ｉｎ内含子上游的Ｓｍａｌｌ
和ＢａｍＨ Ｉ位点间，用引物Ｃ－ＳｍａｌＩ，Ｃ—ＢａｍＨ Ｉ
进行ＰＣＲ筛选后，经ＨｉｎｄｌｌＩ酶切，得到了预期的
１８３４ｂｐ，６０７ｂｐ的两条带，确定为重组质粒２３００一
ｎａｐ—ｉｎ—ＣａＳＧＴ；用Ｓａｌ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ双酶切质粒
２３００一ｎａｐ—ｉｎ—ＣａＳＧＴ，将用同样酶切过的Ｃ—ｓｐ则
插到２３００一ｎａｐ—ｉｎ—ＣａＳＧＴ内含子下游的Ｓａｌ Ｉ和
ＰｓｔＩ之间。利用Ｐｇ５内含子５ 端引物Ｉｎｔｒｏｎ－
Ｂａｍ和基因片段３ 端引物Ｃ—ＰｓｔＩ对连接转化子
进行ＰＣＲ筛选，再用ＨｉｎｄｌｌＩ酶切后得到了预期
的１８３４ｂｐ，１２４９ｂｐ的两条带，证明重组质粒２３００－
ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ—ｉｎｔｒｏｎ构建成功。将重组质粒
２３００一ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ—ｉｎｔｒｏｎ送交Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司
一
】３一
李长春，乔富兴
测序，测序结果表明Ｐｇ５内含子两端带有预期的 子硫甙水平提供一种新的探索。
反向重复序列，进一步验证了载体的正确性。
ｌ ２ ３
２０００ｂｐ
１５００ｂｐ
１０００ｂｐ
５００ｂｐ
１：ＤＬＩＯ０００ ＤＮＡ分子量标准；
２：ｐＣａｍｂｉａ２３００一ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ－ｉｎｔｒｏｎ；
３：ｐＣａｍｂｉａ２３００一ｎａｐ。ｉｎ－ＣａＳＧＴ
图４重组质粒ｐＣａｍｂｉａ２３００一ｎａｐ－ｈｐＣａＳＧＴ－
ｉｎｔｒｏｎ的Ｈｉｎｄｍ酶切检测图
３ 讨 论
硫代葡萄糖甙（ＧＳ）是一类广泛存在于十字
花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）植物根、茎、果实中的糖甙混合
物，特别是芸薹属（Ｂ．ｒａｓｓｉｃａ）植物中这类含硫次
生代谢产物含量较高。维持一定的硫甙水平对植
物的生态适应性具有重要意义，硫甙在内源芥子
酶的作用下水解产生多种生物活性物质，尤其是
异硫氰酸酯（ＩＴＣｓ）对线虫、细菌、真菌和昆虫都
具有很强的杀生作用［９ 。］。有鉴于此，国内李云
昌等提出种子低硫甙、植株营养器官高硫甙的抗
病育种战略［１ 。海甘蓝（Ｃ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）因其极高
的芥酸含量，以及种子外壳与油菜的明显不同，在
大规模生产工业用油和转基因产品的安全应用与
鉴别方面引起国内外许多科学家的兴趣，由于较
高的硫甙含量影响其开发价值。
硫甙由０２硫代葡萄糖基、磺酸肟和支链Ｒ组
成，Ｃ＝Ｎ位上的立体异构体为Ｚ式，众多硫甙在
组成上都有一个相同的核心结构，区别只在于支
链Ｒ的结构［６３。Ｓ—ＧＴ在硫甙合成后期催化尿苷
二磷酸葡萄糖与Ｃ－－Ｎ位上的巯基反应生成硫代
葡萄糖基。该酶已从组织中分离纯化得到，不论
侧链Ｒ基如何，其催化的反应没有特异性，是硫
甙生物合成途径的一个关键酶［６ 引。本实验设计
的干扰载体选用Ｓ—ＧＴ基因为靶标，利用种子特
异性ｎａｐｉｎ启动子，构建成种子特异性Ｓ—ＧＴ基因
发夹干扰载体，有可能定向干扰海甘蓝种子硫甙
的合成，可为通过代谢阻断的方式特异性降低种
一
１ ４一
研究表明，ｈｐＲＮＡ能高效地诱导靶基因的沉
默或降低其表达，其诱导的基因沉默功能能在转
基因植物后代中稳定遗传，ＲＮＡｉ通过特定序列
的干扰可以使多倍体中带有该序列的多基因家族
或同源基因拷贝沉默［１引。本文首先克隆了海甘
蓝硫甙合成关键酶Ｓ—ＧＴ基因全长序列，构建了
带内含子的发夹结构载体，考虑到组织器官硫甙
水平对植物抗性的意义，所选用的是含有种子特
异性表达ｎａｐｉｎ启动子的植物双元表达载体，在
种子形成前的营养生长阶段应不会对其他器官的
硫甙形成造成影响，可望协调降低硫甙而影响了
抗性的矛盾。为通过转基因技术降低种子硫甙水
平提供可行的理论探索和技术支持，关于Ｓ－ＧＴ
基因对海甘蓝的遗传转化及其表达调控还在进一
［ ［ ［
１ ２ ３
］ ］ ］
步研究之中。
致谢：本研究的实验过程得到了湖北大学黄
邦全教授，中国农科院油料作物研究所汪承刚博
士的大力帮助。
［参考文 献］
Ｌｅｏｎｉ Ｏ，Ｃｉｎｔｉｌ Ｓ，Ａｌｉａｎｏ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ａ ｒａｐｉｄ ｃｈｒｏｍａ—
ｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｃｒａｍｂｅ ｓｅｅｄ［Ｊ３．Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００３，
１２２：５１７—５２０．
陈刚，彭健．菜籽饼粕抗营养因子研究进展ＥＪ］．畜
禽业，２００１（１）：１４一ｌ６．
中国农业科学院油料作物研究所．中国油菜栽培学
［Ｍ］．北京：农业出版社，１９９０．
Ｋｌｉｅｂｅｎｓｔｅｉｎ Ｄ Ｊ，Ｋｒｏｙｍａｎｎ Ｊ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ—Ｏｌｄｓ Ｔ．
Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ－ｍｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａｎ ｅｃｏｌｏｇｉ—
ｃａｌ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｔｅｘｔ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ。２００５，８：２６４—２７１．
Ｍｉｔｈｅｎ Ｒ Ｆ．Ｌｅａｆ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔＯ ｐｅｓｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｏｉｌｓｅｅｄ
ｒａｐｅ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｅａ，１９９２，６３：７１—８３．
Ａａｒｏｎ Ｊ．Ｗｉｎｄｓｏｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｅｉｃｈｅｈ，Ａｎｔｉｃ Ｆｉｇｕｔｈ，
ａｔ ａ１．Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｖｅｒｓｉ？ｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅｓ ａｍｏｎｇ ｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉ—
ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２００５，６６：１３２１—１３３３．
汪承刚，谢好，李长春，等．甘蓝型油菜三种种子储
藏蛋白质和丙酮酸羧化酶基因片段的克隆及ｈｐＲＮＡ
表达栽体的构建［Ｊ］．中国油料作物学报，２００６，２８
（３）：２４５—２５０．
李佳，沈斌章，韩继祥，等．一种有效提取油菜叶片
［
４
］
海甘蓝硫甙合成关键酶Ｓ—ＧＴ基因克隆及种子特异性ｈｐＲＮＡｉ载体构建
总ＤＮＡ的方法［Ｊ］．华中农业大学学报，１９９４，１３
一
５１４．
（５）：５２１—５２３．
［１２］
Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉ，Ａｎｄｒｅａｓ Ｓｃｈｅｍｅｎｅｗｉｔｚ，Ａｎｎａ
［９］
李培武，赵永国，丁小霞，等．甘蓝型油菜叶片与种
Ｌｏｐｕｋｈｉｎａ．ｅｔ ａ１．Ｄｅｓｕｌｆｏｇｌｕｅｏｓｉｎｏｌａｔｅ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓ－
子硫甙相关性研究［ｊ］．中国农业科学，２００６，３９
ｆｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃａｔａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ
（３）：５８７—５９２．
ｓｔｅｐ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ ｃｏｒｅ
［１０３
黄界颖。马友华．油菜硫甙特征功能及其测定方法
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ－］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
［Ｊ］．植物生理通讯，２００３。３９（５）：４９６－－５００．
２００４，２７９：５０ ７１７—５０ ７２５．
［１１］
Ｌｉ ＹＣ，Ｈｕａｎｇ ＹＪ，Ｃｈｅｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅｓ
［１３］
Ｔｒａｖｅｌｌａ Ｓ，Ｋｌｉｍｍ Ｔ Ｅ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｂ．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎ－
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ ｌｉｎｅｓ ｔＯ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｏ—
ｃｅ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｆｕｎｅ－
ｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｅｘａｐｌｏｉｄ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｈｕａｚｈｏｎｇ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９９，１８（６）：５０９
ＰｈｙｓｉｏｌｏｇＹ，２００６，１４２：６—２Ｏ．
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｈｐＲＮＡｉ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ
Ｓ—ｇｌｕｃｏｓｙｉｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ
Ｌｉ Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ ，Ｑｉａｏ Ｆｕｘｉｎｇ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉａｏｇａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ・Ｘｉａｏｇａｎ，Ｈｕｂｅｉ ４３２０００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ ４３００６２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ Ｓ—ｇｌｕｃ０ｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｓ－ＧＴ）ｐｌａｙｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏ—
ｌａｔｅ（ＧＳ）ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ Ｓ—ＧＴ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ａｎｄ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｓ－ＧＴ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ
ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ＣａＳＧＴ ｇｅｎｅ ｗｅ
ｃｌｏｎｅｄ ｈａｄ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ ７４ ｂｐ ａｎｄ ｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ４６５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｓｈａｒｅｄ ａ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ９３．４％
ａｔ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ａ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ９５．０６ ａｔ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂ．ｎａｐｕ￥Ｓ—ＧＴ
ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ（ＡＦ３０４４３０）．Ｔｗｏ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｕｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅ—
ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ Ｓ—ＧＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｏ
ｔｈｅ ｓｅｅｄ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ２３ＯＯ—ｎａＤ—ｉｎｔｒｏｎ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｐＲＮＡｉ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｓｉｌｅｎｃｅ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓ—ＧＴ ａｃｔｉｖｉ—
ｔｉｅｓ ｉｎ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｃ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ Ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ；ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ；ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ Ｓ—ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｈｐＲＮＡｉ ｖｅｃｔｏｒ
（责任编辑：陈锦华Ｊ
一
１５
2024年3月11日发(作者：林天心)
第２８卷第６期 孝感学院学报
Ｖ０Ｌ．２８ Ｎ０．６
２００８年１１月
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＸＩＡＯＧＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｎ０Ｖ．２００８
海甘蓝硫甙合成关键酶Ｓ—ＧＴ基因克隆及
种子特异性ｈｐＲＮＡｉ载体构建
李长春 ，乔富兴
（１．孝感学院生命科学技术学院，湖北孝感４３２０００；２．湖北大学生命科学学院，湖北武汉４３００６２）
摘要：根据甘蓝型油菜Ｓ－ＧＴ（ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ Ｓ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）基因ｅＤＮＡ序列设计引物，以海甘
蓝总ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得孓ＧＴ基因全长。克隆的海甘蓝Ｓ—ＧＴ序列与甘蓝型油菜序列相比，除
７４ ｂｐ的内含予部分外有９２个碱基的差别，相似性高达９３．４％。分析显示该序列均有完整的开放阅读框，并
表明所克隆的海甘蓝Ｓ－ＧＴ序列编码４６５个氨基酸，在第１Ｏ个位点上比甘蓝型油菜序列少一个丙氨酸（Ａ），
总共有２３个氨基酸不同，相似性为９５．Ｏ６ 。根据获得的基因序列设计引物扩增出同一基因序列相同但是带
有不同酶切位点的两个片段，将两个片段反向插入到已构建的带有种子特异表达载体内含子的两端．成功构建
了海甘蓝Ｓ－ＧＴ基因的种子特异性ｈｐＲＮＡｉ载体，为特异性降低海甘蓝的种子硫甙奠定了基础。
关键词：海甘蓝；硫甙；ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ Ｓ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｈｐＲＮＡｉ载体
中图分类号：Ｑ７８５；Ｓ５６５．４０３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１—２５４４（２００８）０６—００１１～Ｏ５
海甘蓝（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）因含有很高的 基因全长，构建了该基因的种子特异性干扰载体，
芥酸作为一种新兴油料作物受到越来越多的关 期望只在种子中降低硫甙而不影响植株其他器官
注，其脱脂去壳的饼粕中蛋白质含量高达４８．８
的硫甙水平。
，
且含有较高的苯丙氨酸和含硫氨基酸，营养价
值高，是优质的植物蛋白源，但由于其种子中高含
１材料与方法
量的硫代葡萄糖甙（ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ，ＧＳ，简称硫甙）
１．１ 材料
（７Ｏ～１５０￣ｍｏｌ／ｇ），影响其应用价值［１］。硫甙是 海甘蓝由瑞典Ｎｏｒｄｉｃ ＧｅｎｅＢａｎｋ提供，大肠
广泛存在于十字花科植物的一类含硫次生代谢
杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ菌株，种子特异表
物，在芥子酶的作用下可生成异硫氰酸盐，嗯唑烷
达载体２３００一ｎａｐ由湖北大学黄邦全教授保存啪。
硫酮等有毒代谢物，影响其作为饲料的适口性和
克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ、限制性内切酶、Ｔ。ＤＮＡ连
动物生长［２。］。研究表明，硫甙是十字花科等植物
接酶、Ｅｘ－Ｔａｑ酶、４种ｄＮＴＰ和ＤＮＡ纯化试剂盒
中一类活跃的次生代谢物，维持正常硫甙水平是 等均购自ＴａＫａＲａ公司，ＤＮＡ分子量标准购自
植物的一种自我保护机制，其水解物可有效的提 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，其他常规试剂采用进口分装或
高植物的抗虫抗病能力，硫甙的另一重要生理功
国产分析纯。
能是在硫胁迫时作为一种硫的有效贮藏形式［４ ］。
１．２ 方法
Ｓ—ＧＴ（Ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｒｉｆａｔｅ Ｓ—ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）是
１．２．１植物ＤＮＡ的提取
催化硫甙核心结构合成的一个关键酶［６］。在本研 参照李佳等ＩＳ］修改后的ＳＤＳ法从幼嫩的油
究中我们克隆了海甘蓝中硫甙合成关键酶Ｓ－ＧＴ 菜叶片中提取ＤＮＡ。
收稿日期：２００８～Ｏ９—１８
基金项目：湖北省教育厅国际合作重点项目（２００５ＣＡ０２０；Ｇ２００５１０００１）；
Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｎｋｓ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（３４８—２０Ｏ６—６６８４）
作者简介：李长春（１９７６一），男，湖北广水人，孝感学院生命科学技术学院教师。
李长春，乔富兴
１．２．２海甘蓝Ｓ—ＧＴ基因全长的ＰＣＲ扩增
列（Ｙ１３６６９．１），设计引物Ｉｎｔｒｏｎ—Ｂａｍ：５ ＡＴＡＴ—
ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＣＣＧＧＣＡＴＴＡＣＣ ３ ：Ｉｎ—
ｔｒｏｎ—Ｘｂａ：５ ＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＣ
根据甘蓝型油菜Ｓ—ＧＴ ｃＤＮＡ全长序列
（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ３０４４３０），直接从该序列
的５ 端和３ 端设计引物ＢＦ：５ ＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡ—
ＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ ３ ；ＢＲ：５ ＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＴ—
ＧＣＣＡＣＣＡＣＴＡＧＴ ３ 。以核盘菌总ＤＮＡ为模
板，扩增出包含Ｐｇ５第４内含子（７３ｂｐ）的３３９
ｂｐ片段，同样将片段连克隆载体ｐＭＤ１８一Ｔ，筛选
ＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴ ＣＴＣＣＡ ３ ，以海甘蓝基因组
因ＣａＳＧＴ。
ＤＮＡ为模板扩增出Ｓ—ＧＴ全长基因，命名为基
后送交Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序，带内含子的重组子
命名为Ｔ—ｉｎｔｒｏｎ。以重组质粒Ｔ—ＣａＳＧＴ为模板，
设计如下带不同酶切位点的干扰引物。
（’－Ｓｍａ Ｉ：５ ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＣＣＴＴ
ＣＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧ ３ ：
１．２．３基因ＣａＳＧＴ的克隆与测序
ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶纯化后，连接克隆载
体ｐＭＤ１８一Ｔ，连接物转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受
态细胞，重组子经鉴定后送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（上
Ｃ—ＢａｍＨ Ｉ：５ ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣ
ＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＣＡＧ ３ ：
海）测序。连接基因Ｃ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ－Ｓｇｔ的Ｔ载体
重组质粒命名为质粒Ｔ－ＣａＳＧＴ。
１．２．４ 内含子与干扰小片段的克隆
根据核盘菌Ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｏｒａｓｅ ５（Ｐｇ５）基因序
Ｃ Ｓａｌ Ｉ：５ ＡＴＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣＣＡＣＣＡ
ＣＣＡＣＣＴＡＣＡＣＡＧ ３ ：
Ｃ＿Ｐ Ｉ：５ ＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＧＣＣＴＴＣ
Ｓｍａ
№
３５Ｓ ｐｏｌｙＡ ｓｅｎｅ ｇｅｎｅｆ、
ｊｎｔｒｏ１３＝
ａｎｔｉ・ｓｅｎｅ ｏｅｎｅ
—
日ａＩＴ＝Ｈ
－
ＳａｌＩ
ＰｓＩＩ
ＰＢＲ３２２
Ｎ０Ｓ—、
ｎａ
Ｎ０Ｓ
ｇｅｎｅ
。
／
图１重组质粒ｐＣａｍｂｉａ２３００一ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ－ｉｎｔｒｏｎ的构建
一
１２一
海甘蓝硫甙合成关键酶Ｓ～ＧＴ基因克隆及种子特异性ｈｐＲＮＡｉ载体构建
ＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧ ３ 。
氨基酸不同，相似性为９５．Ｏ６ 。
２．２ Ｐｇ５内含子及干扰基因片段的扩增
油菜核盘菌Ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｏｒａｓｅ的第４个内含子
ＰＣＲ扩增得到相应的基因干扰片段，以引物
Ｃ－Ｓｍａ Ｉ和Ｃ－ＢａｍＨ Ｉ扩增产物命名为Ｃ—ｓｂ，Ｃ—
段仅两端的酶切位点不同。
１．２．５ 种子特异表达ＲＮＡｉ干扰载体的构建
Ｓａｌ Ｉ和Ｃ＿Ｐ盯Ｉ扩增产物命名为为Ｃ－ｓｐ，两个片 序列长７４ｂｐ，从其上游１７９ｂｐ处设计正向引物
Ｉｎｔｒｏｎ－Ｂａｍ，下游８６ｂｐ处设计反向引物Ｉｎｔｒｏｎ．
Ｘｂａ，ＰＣＲ扩增得到一个３３９ｂｐ的带内含子的序
第一步，用ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｂａ １分别酶切２３００一
列，Ｔ—Ａ克隆后测序验证所得序列完全正确。分
Ｉ，
ｎａｐ和Ｔ－ｉｎｔｒｏｎ，回收２３００－ｎａｐ载体骨架与Ｔ－ｉｎ—
别用引物Ｃ－Ｓｍａ Ｉ，Ｃ—ＢａｍＨ Ｉ和引物Ｃ—Ｓａｌ
ｔｒｏｎ的基因片段，将二者连接，构建成带内含子的
种子特异性表达载体２３００一ｎａｐ—ｉｎ；第二步，用
Ｓｍａ Ｉ和ＢａｍＨ工分步分别酶切２３００一ｎａｐ—ｉｎ和
Ｃ—ｓｂ，得到两端含有Ｓｍａ Ｉ和ＢａｍＨ Ｉ粘性末端
的载体骨架和Ｃ—ｓｂ基因片段，再将载体骨架和基
因片段分别连接，得到内含子左边含有目的基因
片段的质粒，命名为２３００－ｎａｐ—ｉｎ—ＣａＳＧＴ；第三
步，用Ｓａｌ Ｉ和Ｐｓｔ １分别双酶切质粒２３００一ｎａｐ—ｉｎ
—
ＣａＳＧＴ和Ｃ－ｓｐ，得到两端含有Ｓａｌ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ粘
性末端的载体骨架和Ｃ－ｓｐ基因片段，再将片段
２３００一ｎａｐ—ｉｎ－ＣａＳＧ丁与Ｃ－ｓｐ连接即得到内含子两
端带有反向互补目的基因片段的ＲＮＡｉ载体，命
名为２３００一ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ－ｉｎｔｒｏｎ（图１）。
２结果与分析
２．１海甘蓝硫甙合成酶Ｓ—ＧＴ基因的克隆与测序
根据甘蓝型油菜Ｓ—ＧＴ ｃＤＮＡ全长序列在设
计引物，以海甘蓝总ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，
得到１４７２ｂｐ的序列（图２）。
１ ２ ３ ４ ５ ６
２０００ｂｐ
１５００ｂｐ
１：ＤＬ－１００００ ＤＮＡ分子量标准；
２～６：ＣａＳＧＴ基因全长的ＰＣＲ扩增
图２ ＣａＳＧＴ基因的ＰＣＲ扩增
序列比较结果表明所克隆海甘蓝Ｓ—ＧＴ序
列，除７４ ｂｐ的内含子部分外有９２个碱基的差
别，相似性高达９３．４％，分析显示该序列具有完
整的开放阅读框。分析表明所克隆的海甘蓝Ｓ—
ＧＴ序列编码４６５个氨基酸，在第１Ｏ个位点上比
油菜发表序列少一个丙氨基酸（Ａ），总共有２３个
Ｃ－Ｐｓｔ Ｉ以质粒Ｔ：ＣａＳＧＴ为模板扩增得到海甘蓝
目的基因两个干扰片段，除两端的酶切位点外，序
列完全相同，大小为６３４ｂｐ（图３）。
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７
１０００ｂｐ
７５０ｂｐ
５００ｂｐ
１：ＤＬ－２０００ ＤＮＡ分子量标准；
２～４：ＣａＳＧＴ基因片断的ＰＣＲ扩增；
５～７：带内含子片断的ＰＣＲ扩增
图３内含子和干扰目的片段的ＰＣＲ扩增
２．３干扰载体的构建与验证
经过ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｂａ Ｉ酶切的质粒２３００一ｎａｐ
和Ｔ—ｉｎｔｒｏｎ，连接转化大肠杆菌以后，先通过ＰＣＲ
进行筛选，另外由于距内含子上游１１４７ｂｐ的ｎａｐ—
ｉｎ启动子上，距内含子下游３１０ｂｐ的ＮＯＳ终止子
末端和内含子中距５ 端４２ｂｐ处都有一个Ｈｉｎｄ［］］
酶切位点，用ＨｉｎｄⅢ酶切２３００一ｎａｐ—ｉｎ得到了预
期的６０７ｂｐ和１１８９ ｂｐ的两条小带，表明内含子
已成功插入。基因片段Ｃ—ｓｂ大小约为６３４ｂｐ，酶
切后连到质粒２３００－ｎａｐ－ｉｎ内含子上游的Ｓｍａｌｌ
和ＢａｍＨ Ｉ位点间，用引物Ｃ－ＳｍａｌＩ，Ｃ—ＢａｍＨ Ｉ
进行ＰＣＲ筛选后，经ＨｉｎｄｌｌＩ酶切，得到了预期的
１８３４ｂｐ，６０７ｂｐ的两条带，确定为重组质粒２３００一
ｎａｐ—ｉｎ—ＣａＳＧＴ；用Ｓａｌ Ｉ和Ｐｓｔ Ｉ双酶切质粒
２３００一ｎａｐ—ｉｎ—ＣａＳＧＴ，将用同样酶切过的Ｃ—ｓｐ则
插到２３００一ｎａｐ—ｉｎ—ＣａＳＧＴ内含子下游的Ｓａｌ Ｉ和
ＰｓｔＩ之间。利用Ｐｇ５内含子５ 端引物Ｉｎｔｒｏｎ－
Ｂａｍ和基因片段３ 端引物Ｃ—ＰｓｔＩ对连接转化子
进行ＰＣＲ筛选，再用ＨｉｎｄｌｌＩ酶切后得到了预期
的１８３４ｂｐ，１２４９ｂｐ的两条带，证明重组质粒２３００－
ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ—ｉｎｔｒｏｎ构建成功。将重组质粒
２３００一ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ—ｉｎｔｒｏｎ送交Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司
一
】３一
李长春，乔富兴
测序，测序结果表明Ｐｇ５内含子两端带有预期的 子硫甙水平提供一种新的探索。
反向重复序列，进一步验证了载体的正确性。
ｌ ２ ３
２０００ｂｐ
１５００ｂｐ
１０００ｂｐ
５００ｂｐ
１：ＤＬＩＯ０００ ＤＮＡ分子量标准；
２：ｐＣａｍｂｉａ２３００一ｎａｐ—ｈｐＣａＳＧＴ－ｉｎｔｒｏｎ；
３：ｐＣａｍｂｉａ２３００一ｎａｐ。ｉｎ－ＣａＳＧＴ
图４重组质粒ｐＣａｍｂｉａ２３００一ｎａｐ－ｈｐＣａＳＧＴ－
ｉｎｔｒｏｎ的Ｈｉｎｄｍ酶切检测图
３ 讨 论
硫代葡萄糖甙（ＧＳ）是一类广泛存在于十字
花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）植物根、茎、果实中的糖甙混合
物，特别是芸薹属（Ｂ．ｒａｓｓｉｃａ）植物中这类含硫次
生代谢产物含量较高。维持一定的硫甙水平对植
物的生态适应性具有重要意义，硫甙在内源芥子
酶的作用下水解产生多种生物活性物质，尤其是
异硫氰酸酯（ＩＴＣｓ）对线虫、细菌、真菌和昆虫都
具有很强的杀生作用［９ 。］。有鉴于此，国内李云
昌等提出种子低硫甙、植株营养器官高硫甙的抗
病育种战略［１ 。海甘蓝（Ｃ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）因其极高
的芥酸含量，以及种子外壳与油菜的明显不同，在
大规模生产工业用油和转基因产品的安全应用与
鉴别方面引起国内外许多科学家的兴趣，由于较
高的硫甙含量影响其开发价值。
硫甙由０２硫代葡萄糖基、磺酸肟和支链Ｒ组
成，Ｃ＝Ｎ位上的立体异构体为Ｚ式，众多硫甙在
组成上都有一个相同的核心结构，区别只在于支
链Ｒ的结构［６３。Ｓ—ＧＴ在硫甙合成后期催化尿苷
二磷酸葡萄糖与Ｃ－－Ｎ位上的巯基反应生成硫代
葡萄糖基。该酶已从组织中分离纯化得到，不论
侧链Ｒ基如何，其催化的反应没有特异性，是硫
甙生物合成途径的一个关键酶［６ 引。本实验设计
的干扰载体选用Ｓ—ＧＴ基因为靶标，利用种子特
异性ｎａｐｉｎ启动子，构建成种子特异性Ｓ—ＧＴ基因
发夹干扰载体，有可能定向干扰海甘蓝种子硫甙
的合成，可为通过代谢阻断的方式特异性降低种
一
１ ４一
研究表明，ｈｐＲＮＡ能高效地诱导靶基因的沉
默或降低其表达，其诱导的基因沉默功能能在转
基因植物后代中稳定遗传，ＲＮＡｉ通过特定序列
的干扰可以使多倍体中带有该序列的多基因家族
或同源基因拷贝沉默［１引。本文首先克隆了海甘
蓝硫甙合成关键酶Ｓ—ＧＴ基因全长序列，构建了
带内含子的发夹结构载体，考虑到组织器官硫甙
水平对植物抗性的意义，所选用的是含有种子特
异性表达ｎａｐｉｎ启动子的植物双元表达载体，在
种子形成前的营养生长阶段应不会对其他器官的
硫甙形成造成影响，可望协调降低硫甙而影响了
抗性的矛盾。为通过转基因技术降低种子硫甙水
平提供可行的理论探索和技术支持，关于Ｓ－ＧＴ
基因对海甘蓝的遗传转化及其表达调控还在进一
［ ［ ［
１ ２ ３
］ ］ ］
步研究之中。
致谢：本研究的实验过程得到了湖北大学黄
邦全教授，中国农科院油料作物研究所汪承刚博
士的大力帮助。
［参考文 献］
Ｌｅｏｎｉ Ｏ，Ｃｉｎｔｉｌ Ｓ，Ａｌｉａｎｏ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ａ ｒａｐｉｄ ｃｈｒｏｍａ—
ｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｃｒａｍｂｅ ｓｅｅｄ［Ｊ３．Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００３，
１２２：５１７—５２０．
陈刚，彭健．菜籽饼粕抗营养因子研究进展ＥＪ］．畜
禽业，２００１（１）：１４一ｌ６．
中国农业科学院油料作物研究所．中国油菜栽培学
［Ｍ］．北京：农业出版社，１９９０．
Ｋｌｉｅｂｅｎｓｔｅｉｎ Ｄ Ｊ，Ｋｒｏｙｍａｎｎ Ｊ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ—Ｏｌｄｓ Ｔ．
Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ－ｍｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａｎ ｅｃｏｌｏｇｉ—
ｃａｌ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｔｅｘｔ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ。２００５，８：２６４—２７１．
Ｍｉｔｈｅｎ Ｒ Ｆ．Ｌｅａｆ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔＯ ｐｅｓｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｏｉｌｓｅｅｄ
ｒａｐｅ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｅａ，１９９２，６３：７１—８３．
Ａａｒｏｎ Ｊ．Ｗｉｎｄｓｏｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｅｉｃｈｅｈ，Ａｎｔｉｃ Ｆｉｇｕｔｈ，
ａｔ ａ１．Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｖｅｒｓｉ？ｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅｓ ａｍｏｎｇ ｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉ—
ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２００５，６６：１３２１—１３３３．
汪承刚，谢好，李长春，等．甘蓝型油菜三种种子储
藏蛋白质和丙酮酸羧化酶基因片段的克隆及ｈｐＲＮＡ
表达栽体的构建［Ｊ］．中国油料作物学报，２００６，２８
（３）：２４５—２５０．
李佳，沈斌章，韩继祥，等．一种有效提取油菜叶片
［
４
］
海甘蓝硫甙合成关键酶Ｓ—ＧＴ基因克隆及种子特异性ｈｐＲＮＡｉ载体构建
总ＤＮＡ的方法［Ｊ］．华中农业大学学报，１９９４，１３
一
５１４．
（５）：５２１—５２３．
［１２］
Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉ，Ａｎｄｒｅａｓ Ｓｃｈｅｍｅｎｅｗｉｔｚ，Ａｎｎａ
［９］
李培武，赵永国，丁小霞，等．甘蓝型油菜叶片与种
Ｌｏｐｕｋｈｉｎａ．ｅｔ ａ１．Ｄｅｓｕｌｆｏｇｌｕｅｏｓｉｎｏｌａｔｅ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓ－
子硫甙相关性研究［ｊ］．中国农业科学，２００６，３９
ｆｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃａｔａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ
（３）：５８７—５９２．
ｓｔｅｐ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ ｃｏｒｅ
［１０３
黄界颖。马友华．油菜硫甙特征功能及其测定方法
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ－］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
［Ｊ］．植物生理通讯，２００３。３９（５）：４９６－－５００．
２００４，２７９：５０ ７１７—５０ ７２５．
［１１］
Ｌｉ ＹＣ，Ｈｕａｎｇ ＹＪ，Ｃｈｅｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅｓ
［１３］
Ｔｒａｖｅｌｌａ Ｓ，Ｋｌｉｍｍ Ｔ Ｅ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｂ．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎ－
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ ｌｉｎｅｓ ｔＯ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｏ—
ｃｅ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｆｕｎｅ－
ｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｅｘａｐｌｏｉｄ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｈｕａｚｈｏｎｇ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９９，１８（６）：５０９
ＰｈｙｓｉｏｌｏｇＹ，２００６，１４２：６—２Ｏ．
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｈｐＲＮＡｉ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ
Ｓ—ｇｌｕｃｏｓｙｉｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ
Ｌｉ Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ ，Ｑｉａｏ Ｆｕｘｉｎｇ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉａｏｇａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ・Ｘｉａｏｇａｎ，Ｈｕｂｅｉ ４３２０００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ ４３００６２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ Ｓ—ｇｌｕｃ０ｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｓ－ＧＴ）ｐｌａｙｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏ—
ｌａｔｅ（ＧＳ）ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ Ｓ—ＧＴ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ａｎｄ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｓ－ＧＴ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ
ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ＣａＳＧＴ ｇｅｎｅ ｗｅ
ｃｌｏｎｅｄ ｈａｄ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ ７４ ｂｐ ａｎｄ ｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ４６５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｓｈａｒｅｄ ａ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ９３．４％
ａｔ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ａ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ９５．０６ ａｔ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂ．ｎａｐｕ￥Ｓ—ＧＴ
ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ（ＡＦ３０４４３０）．Ｔｗｏ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｕｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅ—
ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ Ｓ—ＧＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｏ
ｔｈｅ ｓｅｅｄ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ２３ＯＯ—ｎａＤ—ｉｎｔｒｏｎ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｐＲＮＡｉ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｓｉｌｅｎｃｅ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓ—ＧＴ ａｃｔｉｖｉ—
ｔｉｅｓ ｉｎ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｃ．ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ Ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ；ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ；ｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ Ｓ—ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｈｐＲＮＡｉ ｖｅｃｔｏｒ
（责任编辑：陈锦华Ｊ
一
１５