2024年3月15日发(作者：李又香)
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微生物学杂志 ２００８年１月第２８卷第１期ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ Ｊａｎ．２００８ Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．１
反向ＰＣＲ克隆黑根霉Ｒ３０６Ａ６－脂肪酸脱饱和酶基因
陆合 ，朱钰 ，黄尤田
（１．重庆医科大学微生物与免疫学教研室，重庆４０００７０；２．黔洲中学，重庆黔江４０９０００）
摘 要 利用简并引物扩增出Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基因的核心序列，设计与核心序列互补的反向引物，以５ 端
带磷酸基团的引物进行反转录ｃＤＮＡ，然后在ｌ２℃下环化ｃＤＮＡ，并以此作为模板进行反向ＰＣＲ，引物的延伸
方向自核心区向环化分子的未知序列进行，扩增出核心区的上下游序列。应用该方法扩增并测定了黑根霉
Ｒ３０６的Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基因全序列。并对酶的低温适应机制在氨基酸序列上进行了分析。
关键词 反向ＰＣＲ；基因；脂肪酸脱饱和酶；低温机制
中图分类号Ｑ９４９．３２３．３ 文献标识码Ａ 文章编号１００５—７０２１（２００８）Ｏ１—００２４一Ｏ４
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ａ６－Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ
Ｒ３０６ ｗｉｔｈ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ
ＬＵ Ｈｅ ．ＺＨＵ Ｙｕ ，ＨＵＡＮＧ Ｙｏｕ—ｔｉａｎ
（１．Ｔｅａｃｈ．＆Ｒｅｓ．Ｄｉｖ．ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．＆ｌｍｍｕｎｏ１．，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄ，Ｕｎｉｖ．Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００７０：
２．Ｑｉａｎｚｈｏｕ Ｍｉｄｄｌｅ Ｓｃｈ１．Ｑｉａｎｊｉａｎｇ ４０９０００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａ６一ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ，ａｎｄ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍ—
ｅｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ｗｉｔｈ
５ ｅｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｎ ｃｙｃｌｉｚｅｄ ｔｈｅ ｅＤＮＡ ｕｎｄｅｒ １２℃．ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｚｅｄ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｔａｋｅｎ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｔｏ ｃａｒｒｙ ｏｕｔ
ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｕｎｋｎｏｗｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙ—
ｅｌｉｚｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｔｈｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ．Ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈｅ
ｆｕｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａ６一ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｌｏｗ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ；ｇｅｎｅ；ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ；ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
脂肪酸脱饱和酶对维持生物体内脂肪酸的正
年Ｒｅｄｄｙ等人第一次从产ＧＬＡ的蓝细菌中克隆
常代谤十、生物膜的正确结构和生理上起着重要的
到△６一脂肪酸脱饱和酶基因，并在△６．脂肪酸脱饱
作用…。近年以研究脂肪酸脱饱和酶为主的植物
和酶缺陷的蓝细菌中获得功能表达 ，从而推动
油基因工程、植物抗寒育种和食品应用工程等正
了对Ａ６一脂肪酸脱饱和酶的分子水平研究。目
日益成为热点。Ａ６．脂肪酸脱饱和酶是产生 ．亚
前，国外一些实验室通过ＣＤＮＡ文库、ＣＤＮＡ末端
麻酸和其他一些重要生理物质的关键酶，是一类
扩增等方法已经从多种生物中克隆了△６一脂肪酸
引入双键靠羟基定向的脂肪酸脱饱和酶。早期对 脱饱和酶基因，并在烟草、油菜、大豆等生物中获
△６ 脂肪酸脱饱和酶的研究主要集中在动物体内。
得功能表达 ，有效增加了这些作物的抗寒性。
虽然较早从鼠肝中分离了△６一脂肪酸脱饱和 对已报道的△６一脂肪酸脱饱和酶氨基酸序列比较
酶 ，但由于对膜的结构缺乏了解，所以对△６．脂
发现，Ａ６．脂肪酸脱饱和酶具有３个保守的组氨酸
肪酸脱饱和酶的研究一直没有重要的进展。１９９３
区（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ—ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ），即ＨｉｓＩ、ＨｉｓＩＩ和ＨｉｓＩＩＩ．
收璃日期：２００７—０７—２６
作者简介：陆合男，硕士。从事分子微生物研究。
项目来源：国家高技术研究发展计’划（８６３项目．２００３ＡＡ２０７１５０）
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１期 陆合等：反向ＰＣＲ克隆黑根霉Ｒ３０６Ａ６．脂肪酸脱饱和酶基因
有２个疏水区 ，设计相应的简并引物，通过
ＰＣＲ扩增，克隆、测序得到黑根霉Ｒ３０６Ａ６．脂肪酸
脱饱和酶基因的核心序列。如何从这段已知的序
列出发得到基因的上游和下游序列，是基因克隆
中的关键所在。经典的ＲＡＣＥ和Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司
等的新ＲＡＣＥ方法，虽然可得到未知的上下游序
列，但工作量较大，且易造成ＲＮＡ的降解。反向
ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ）是用适宜的限制性内切酶消化
ＤＮＡ后，再将ＤＮＡ环化作为模板，用与核心区两
侧互补的引物进行ＰＣＲ，引物从核心区出发，向
两侧的未知序列进行¨引。本实验在获得黑根霉
Ｒ３０６Ａ６－脂肪酸脱饱和酶基因核心序列的基础
上，以环化的ｃＤＮＡ作为模板进行反向ＰＣＲ，对反
向ＰＣＲ产物进行克隆和测序，得到了黑根霉Ａ６－
脂肪酸脱饱和酶的全基因序列。并对其氨基酸序
列进行了低温适应机制的研究。
１ 材料与方法
１．１材料
１．１．１ 实验所用菌株 是本实验室通过ＧＣ筛
选得到的产 －亚麻酸的黑根霉Ｒ３０６（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｎ ／ｃａｎｓ）。
１．１．２试剂 胶回收试剂盒从上海华舜公司购
买，ＡＭＶ反转录酶、Ｔ。连接酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶从
上海生工公司购买，ＰＣＲ引物和测序由上海博亚
完成，大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ为本室保存，其他化学药
剂均为分析纯。
１．２方法
１．２．１ ＲＮＡ的提取取新鲜菌丝体，液氮速冻
并研磨成粉末，快速将粉末移入５０ ｍＬ离心管
中，迅速加入１２ ｍＬ变性液（５ ｍｏｌ／Ｌ异硫氢酸
胍，３７．５ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸，０．７５ ｍｏＬ／Ｌ十二烷基肌
酸钠），充分涡旋后，参照ＲＮＡ抽提试剂盒说明
书进行ＲＮＡ提取。核酸测定仪测定总ＲＮＡ的量
与纯度，并取适量样品进行电泳。
１．２．２ ｃＤＮＡ合成 取总ＲＮＡ ４ Ｌ，利用５端
磷酸化的弓Ｉ物 ｐ５ 一ＴＧｃＴｃＧＡＴ Ｉ ＧＡＴＡＧＴ－
ＴＣＡＡＴＣＣＡＣＣ－３ 在５Ｏ ｃＩ＝下反转录６０ ｍｉｎ，将合
成好的单链ｃＤＮＡ利用巢式引物进行放大扩增，
电泳检测后，取单链ｃＤＮＡ ５ Ｌ在Ｔ 连接酶作
用下１２ ｃＩ＝下连接过夜。连接产物在６５ ｃＩ＝下水
浴１０ ｍｉｎ终止反应。
１．２．３反向ＰＣＲ克隆Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基因
取环化好的ｃＤＮＡ １ Ｌ进行反向ＰＣＲ。所用
引物为与核心区互补的Ｆ ５ ．ＧＣＴＴＴＧＡＡＣＣＡ．
ＣＡＡＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴ Ｇ－３ ，Ｒ ５ ．ＡＡＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡ．
ＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣ－３ 。ＰＣＲ扩增条件：９４℃预
变性５ ｒａｉｎ，３０个循环：９４ ｃＩ＝，３０ ｓ；４８ ｃＩ＝，
１ ｒａｉｎ；７２ ｃＩ＝，１ ｒａｉｎ；７２ ｃＩ＝延伸１５ ｒａｉｎ，电泳检测
ＰＣＲ产物。将其预测的条带切胶后用华舜的柱
式胶回收试剂盒回收。与Ｐｍｄｌ８．Ｔ载体连接后
转化大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ，通过蓝白斑和ＰＣＲ扩增筛／
选出阳性克隆。序列的测定由上海博亚完成。序
列的分析通过软件ＤＮＡｓｔａｒ进行。
１．２．４酶低温适应分析根据已报道的低温酶
冷适应机制，利用Ｅｘｐａｓｙ等生物信息软件对新克
隆黑根霉Ａ６－脂肪酸脱饱和酶基因的氨基酸序列
进行分析。
２ 结果与分析
２．１ ＲＮＡ的提取
提取总ＲＮＡ时采用加大裂解液浓度和取材
后不用磷酸缓冲液洗脱的方法，利用高浓度的异
硫氢酸胍迅速抑制ＲＮＡａｓｅ的活性，从而保证获
得最完整的ＲＮＡ。试验中发现新鲜材料经过洗
脱与不洗脱的效果不一样。用化学培养基培养的
真菌不经洗脱，直接抽提的效果好。洗脱后的均
发生程度不同的降解（见图１）。核酸测定仪测定
出ＲＮＡ的量为２．３４ ｇ／ Ｌ，纯度为９５．４％。
２．２ ｃＤＮＡ的合成
用５ 端带磷酸基团的引物进行反转录后，为
检测反转录质量，利用巢式引物对第一链ｃＤＮＡ
进行放大扩增。并对放大扩增后的双链ｃＤＮＡ进
行琼脂糖电泳检测，结果显示ｃＤＮＡ呈明显的拖
带，大小在１００—２００ ｂｐ到１Ｏ ｋｂ之间，其中亮度
最高的区域在１—３ ｋｂ间，这说明反转录完全，得
到了较高质量的ｃＤＮＡ（见图２）。
２．３反向ＰＣＲ克隆６－脂肪酸脱饱和酶基因
依据所得到的Ａ６－脂肪酸脱饱和酶基因的核
心序列，设计与序列特异的反向ＰＣＲ引物，以连
接过夜的ｃＤＮＡ环化产物为模板进行反向ＰＣＲ。
得到了预测大小的片段。对其进行亚克隆和测
序，测序和软件分析表明扩增正确。
２．４ Ａ６－脂肪酸脱饱和酶的低温适应分析
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微生物学杂志 ２８卷
黑根霉Ｒ３０６的最适培养温度为２０ ｏ【＝、最适
．
因中甘氨酸的量为２２个、天冬氨酸有２１个、精
氨酸有１２个、脯氨酸有１０个。肽链中甘氨酸和
Ｓ
亚麻酸生产温度为ｌ５℃，发酵试验发现较低的
孔４伯（
温度有利于黑根霉Ｒ３０６产生＾ｙ－亚麻酸。说明黑
天冬氨酸的增加能使酶分子的亲水性升高，增加
根霉Ｒ３０６的△６一脂肪酸脱饱和酶应该是一类适
了酶与溶剂的相互作用－ｔ 。而较少脯氨酸使酶
宜低温环境的低温酶。Ａｌｏｎｓｏ等人对与膜结合的
的非折叠多肽构象的自由度减少 ，它的减少有
脂肪酸脱饱和酶从结构和功能上进行了系统进化
利于提高酶的柔韧性，精氨酸中胍盐基团的共振
研究 ，但△６．脂肪酸脱饱和酶作为低温酶来研
一
方面为形成盐桥提供了可能，同时还成倍增加
究其分子作用机制还未见报道。低温酶主要的适
了与主链羧基氧之间的氢键，进而增强了酶的稳
应机制是通过氨基酸的变化降低酶的柔韧性 。
定性，所以低温酶中的精氨酸量较少¨ 。无论是
分析发现所克隆的真菌黑根霉Ｒ３０６Ａ６一脂肪酸脱
较长的肽链还是氨基酸的增减，这些都可以增加
饱和酶由４６０个氨基酸构成，较长的肽链能够为
酶分子的柔韧性。而酶分子柔韧性的增加使酶的
增加酶分子表面的环状结构、为增加酶的柔韧性
构象异构体数量升高 ，最终使△６．脂肪酸脱饱
提供了分子基础¨ 。Ｒ３０６ Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基
和酶有利于在低温下催化酶反应。
ａ ｂ
ｄ
图１ ＲＮＡ的电泳图
Ｆｉｇ．１ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｇｅｌ ｅｌｅｅｔｏｒｐｈｏｒｅｓｉｓ
ａ：裂解液浓度为４ ｍｏｌ／Ｌ；ｂ：裂解液浓度为５ ｍｏｌ／Ｌ，不洗脱；ｅ：洗脱１次；ｄ：洗脱３次
ａ：４ ｍｏｌ／Ｌ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｑｕｉｄ；ｂ：５ ｍｏｌ／Ｌ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｑｕｉｄ；ｅ：ｗａｓｈ ｏｎｅ；ｄ：ｗａｓｈ ｔｈｒｅｅ
物质的存在会严重影响到ＲＮＡ的抽提，所以提取
总ＲＮＡ时可以采用加大裂解液浓度和取材后不
用磷酸缓冲液洗脱的方法，利用高浓度的异硫氢
酸胍迅速抑制ＲＮＡａｓｅ的活性，保证获得最完整
的ＲＮＡ。通常的环化温度是１６℃，但试验发现
进一步降低连接温度能提高环化的质量，以在
１２ ｏ【＝环化为较好，将黑根霉Ｒ３０６Ａ６．脂肪酸脱饱
和酶同生产＾ｙ－亚麻酸常用的深黄被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒ－
图２反转录的ｃＤＮＡ电泳图
ａｌｉａ ｉｓａｂｅＵｉｎａ）进行比较，深黄被孢霉的△６．脂肪
Ｆｉｇ．２ ｅＤＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｇｅｌ ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
酸脱饱和酶基因仅有４００个氨基酸，而较长的肽
Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ
链能为酶的柔韧性提供分子基础ｎ 。氨基酸序
３ 讨 论
列中脯氨酸的总数或是在总氨基酸中所占的比
例，黑根霉的△６－脂肪酸脱氢酶所含有的脯氨酸
真菌中含有较多的糖和较高的ＲＮＡａｓｅ，这些
都是最低的。深黄被孢霉中天冬氨酸有１４个，
—、
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陆合等：反向ＰＣＲ克隆黑根霉Ｒ３０６Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基因
］
ｌ
２
］
３
］ ］
４
］
５
］
６
２７
］
７
而黑根霉的△６一脂肪酸脱氢酶中有２１个，天冬氨
酸的增加能使酶分子的亲水性升高，增加酶与溶
剂的相互作用，进一步保证酶在低温下的稳定。
这样的分子结构说明黑根霉在生产 。亚麻酸上
有着比深黄被孢霉更好的工业适用性。
［８］Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏ，Ｂｅａｕｄｏｉｎ Ｆ，Ｌｉｂｉｓｃｈ Ｂ。ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ
ｈｅｔｅｒｃｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｏｆ ａ ｐｌａｎｔ Ｄｅｌｔａ６．－ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅ．．
ｓａｔｕｒａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ，２００１。５２：１ ５８１．１ ５８５．
［９］ Ｓｈａｎｋｉｎ Ｊ，Ｗｈｉｔｔｌｅ Ｅ。Ｆｏｘ ＢＧ．Ｅｉｇｈｔ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ
ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｉｎ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｒｏｎ ｅｎｚｙｍｅ
，
虽然获得基因全长的方法较多，但反向ＰＣＲ
技术步骤简单，工作量小，有效减少了其他ＲＡＣＥ
ｓｔｅａｒｏｙｌ－ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ａｒｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ａｌｋａｎｅ ｈｙｄｒｏｃｙｌａｓｅ
ａｎｄ ｘｙｌｅｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３：
ｌ２ ７８７一ｌ２ ７９４．
过程中对ＲＮＡ的损失，而提高了获得基因全长的
机会，为已知中间基因序列进行全序列分析提供
了新的方便手段。
参考文献：
Ｌｏｓ ＤＡ，Ｍｕｒａｔａ Ｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅ－
［１０］Ｚｅｃｃｈｉｎｏｎ Ｌ，Ｃｌａｖｅｒｉｅ Ｐ，Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｄ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ
ｅｎｚｙｍｅｓ ｒｅａｌｌｙ ｗｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ？［Ｊ］Ｅｘｔｅｍｏｐｈｉｒｌｅｓ，２００１，
５：３ｌ３－３２１．
［１ １］Ａｌｏｎｓｏ ＤＬ，Ｍａｒｃｔｏ ＦＧ，Ｒｕｉｚ ＲＪ。ｅｔ ａ１．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍ—
ｂｒａｎｅｂｏｕｎｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００３，３１：１ １１１—１ １２４．
ｓａｔｕｒａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９９８，１ ３９４：３－１５．
Ｏｋａｙａｓｕ Ｔ，Ｎａｇａｏ Ｍ，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒ－
ｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ
［１２］Ｋｕｌａｋｏｖａ Ｌ，Ｇａｌｋｉｎ Ａ，ＫｕｒｉｈａｒａＴ。ｅｔ ａ１．ｃｏｌｄ—ａｃｔｉｖｅ ｓｅｒｉｎｅ ａｌ—
ｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｓｙｃｈｒｃｔｃｐｈｉｒｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ
ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９８１，２０６：２１－２８．
Ｒｅｄｄｙ ＡＳ，Ｎｕｃｃｉｏ ＭＬ，Ｇｒｏｓｓ ＬＭ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ａ６＿ｄｅ—
ｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ
ＰＣＣ ６８０３ ｂｙ ｇａｉｎ—ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｎａｂａｅｎａ ８ｐ．ｓｔｒａｉｎ
ｓｔｒａｉｎ Ａｃｌｏ：Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ－
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，６５：６１１－６１７．
［１ ３］Ｉｒｗｉｎ ＪＡ，Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ ＨＭ，Ｍａｒｔｅｉｎｓｓｏｎ ＶＴ．ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃ—
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌａｎｉｎｅ ａｎｄ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ
ＰＣＣ ７１２０［Ｊ］．ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏ，１９９３，２７：２９３－３００．
Ｈｕａｎｇ ＹＳ，Ｃｈａｕｄｈａｒｙ Ｓ，Ｔｈｕｒｍｏｎｄ ＪＭ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ
△ｎ—ａｎｄ△‘一ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｈ ｓｔｒａｉｎ ｐａ－４３［Ｊ］．Ｅｘｔｅｍｏｐｈｉｒｌｅｓ，２００１，５：１９９－
２ｌ１．
［１４］Ｎａｒｉｎｘ Ｅ，Ｂａｉｓｅ Ｅ，Ｇｅｒｄａｙ Ｃ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｆｒｏｍ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ
Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｔｅ ｄｉｅｃｔｒｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅ－
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ￣＂／－ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｓ．ｃｅｒｅｖ￣ｉａｅ［Ｊ］．Ｌｉｐｉｄｓ，
１９９９，３４：６４９－６５９．
ｓｉｓ ｏｆ ｅｂｉｒｄｕｅｓ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｌｄ［Ｊ］．
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９７，１０：１ ２７１－１ ２７９．
Ｍｕｒｐｈｙ ＤＪ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｉｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｐｅｓｅｅｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ
ｏｉｌ ｃｒｏｐｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６，１４：２０６－２１３．
Ｎａｐｉｅｒ ＪＡ，Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ＬＶ，Ｓｔｏｂａｒｔ ＡＫ．Ｐｌａｎｔ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ：
［１５］Ｆｅｌｌｅｒ Ｇ，Ｐａｙａｎ Ｆ，Ｔｈｅｙ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｕｃｔｒｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｏｔ—ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏ—
ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｎｄ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ１．，
１９９９，２：１２３—１２７．
Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏ，Ｓｍｉｔｈ Ｍ Ａ，Ｌａｐｉｎｓｋｅｓ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ
ｂｏｒａｇｅ ｄｅｓａｔｕｒｅｓｅ ｃＤＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ Ｎ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｃｍｅ
ｐｌａｎｃｔｉｓ Ａ２３［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４，２２２：４４１ ７．
［１６］Ｆｅｌｌｅｒ Ｇ，Ａｒｐｉｇｎｙ ＪＬ，Ｎａｒｉｎｘ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｓｙｃｈｒｃｐｈｉｌｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７，１１８Ａ：４９５－４９９．
ｂ５ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ａ６・－ｄｅ－
［１７］Ｇａｎｅｓｅ Ｇ，Ａｒｇｏｓ Ｐ，Ｐａｓｃａｒｅｌｌａ Ｓ．Ｓｔｕｃｔｒｕｒａｌ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎ—
ｚｙｍｅｓ ｔｏ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，１４：
ｌ４１．１４８．
ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｄ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４：４ ２１１－４ ２１６．
四阿围＜＜锄鳍锄学国总））
2024年3月15日发(作者：李又香)
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微生物学杂志 ２００８年１月第２８卷第１期ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ Ｊａｎ．２００８ Ｖｏ１．２８ Ｎｏ．１
反向ＰＣＲ克隆黑根霉Ｒ３０６Ａ６－脂肪酸脱饱和酶基因
陆合 ，朱钰 ，黄尤田
（１．重庆医科大学微生物与免疫学教研室，重庆４０００７０；２．黔洲中学，重庆黔江４０９０００）
摘 要 利用简并引物扩增出Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基因的核心序列，设计与核心序列互补的反向引物，以５ 端
带磷酸基团的引物进行反转录ｃＤＮＡ，然后在ｌ２℃下环化ｃＤＮＡ，并以此作为模板进行反向ＰＣＲ，引物的延伸
方向自核心区向环化分子的未知序列进行，扩增出核心区的上下游序列。应用该方法扩增并测定了黑根霉
Ｒ３０６的Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基因全序列。并对酶的低温适应机制在氨基酸序列上进行了分析。
关键词 反向ＰＣＲ；基因；脂肪酸脱饱和酶；低温机制
中图分类号Ｑ９４９．３２３．３ 文献标识码Ａ 文章编号１００５—７０２１（２００８）Ｏ１—００２４一Ｏ４
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ａ６－Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ
Ｒ３０６ ｗｉｔｈ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ
ＬＵ Ｈｅ ．ＺＨＵ Ｙｕ ，ＨＵＡＮＧ Ｙｏｕ—ｔｉａｎ
（１．Ｔｅａｃｈ．＆Ｒｅｓ．Ｄｉｖ．ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．＆ｌｍｍｕｎｏ１．，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄ，Ｕｎｉｖ．Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００７０：
２．Ｑｉａｎｚｈｏｕ Ｍｉｄｄｌｅ Ｓｃｈ１．Ｑｉａｎｊｉａｎｇ ４０９０００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａ６一ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ，ａｎｄ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍ—
ｅｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ｗｉｔｈ
５ ｅｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｎ ｃｙｃｌｉｚｅｄ ｔｈｅ ｅＤＮＡ ｕｎｄｅｒ １２℃．ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｚｅｄ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｔａｋｅｎ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｔｏ ｃａｒｒｙ ｏｕｔ
ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｕｎｋｎｏｗｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙ—
ｅｌｉｚｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｔｈｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ．Ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈｅ
ｆｕｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａ６一ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｌｏｗ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ；ｇｅｎｅ；ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ；ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
脂肪酸脱饱和酶对维持生物体内脂肪酸的正
年Ｒｅｄｄｙ等人第一次从产ＧＬＡ的蓝细菌中克隆
常代谤十、生物膜的正确结构和生理上起着重要的
到△６一脂肪酸脱饱和酶基因，并在△６．脂肪酸脱饱
作用…。近年以研究脂肪酸脱饱和酶为主的植物
和酶缺陷的蓝细菌中获得功能表达 ，从而推动
油基因工程、植物抗寒育种和食品应用工程等正
了对Ａ６一脂肪酸脱饱和酶的分子水平研究。目
日益成为热点。Ａ６．脂肪酸脱饱和酶是产生 ．亚
前，国外一些实验室通过ＣＤＮＡ文库、ＣＤＮＡ末端
麻酸和其他一些重要生理物质的关键酶，是一类
扩增等方法已经从多种生物中克隆了△６一脂肪酸
引入双键靠羟基定向的脂肪酸脱饱和酶。早期对 脱饱和酶基因，并在烟草、油菜、大豆等生物中获
△６ 脂肪酸脱饱和酶的研究主要集中在动物体内。
得功能表达 ，有效增加了这些作物的抗寒性。
虽然较早从鼠肝中分离了△６一脂肪酸脱饱和 对已报道的△６一脂肪酸脱饱和酶氨基酸序列比较
酶 ，但由于对膜的结构缺乏了解，所以对△６．脂
发现，Ａ６．脂肪酸脱饱和酶具有３个保守的组氨酸
肪酸脱饱和酶的研究一直没有重要的进展。１９９３
区（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ—ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ），即ＨｉｓＩ、ＨｉｓＩＩ和ＨｉｓＩＩＩ．
收璃日期：２００７—０７—２６
作者简介：陆合男，硕士。从事分子微生物研究。
项目来源：国家高技术研究发展计’划（８６３项目．２００３ＡＡ２０７１５０）
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１期 陆合等：反向ＰＣＲ克隆黑根霉Ｒ３０６Ａ６．脂肪酸脱饱和酶基因
有２个疏水区 ，设计相应的简并引物，通过
ＰＣＲ扩增，克隆、测序得到黑根霉Ｒ３０６Ａ６．脂肪酸
脱饱和酶基因的核心序列。如何从这段已知的序
列出发得到基因的上游和下游序列，是基因克隆
中的关键所在。经典的ＲＡＣＥ和Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司
等的新ＲＡＣＥ方法，虽然可得到未知的上下游序
列，但工作量较大，且易造成ＲＮＡ的降解。反向
ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ）是用适宜的限制性内切酶消化
ＤＮＡ后，再将ＤＮＡ环化作为模板，用与核心区两
侧互补的引物进行ＰＣＲ，引物从核心区出发，向
两侧的未知序列进行¨引。本实验在获得黑根霉
Ｒ３０６Ａ６－脂肪酸脱饱和酶基因核心序列的基础
上，以环化的ｃＤＮＡ作为模板进行反向ＰＣＲ，对反
向ＰＣＲ产物进行克隆和测序，得到了黑根霉Ａ６－
脂肪酸脱饱和酶的全基因序列。并对其氨基酸序
列进行了低温适应机制的研究。
１ 材料与方法
１．１材料
１．１．１ 实验所用菌株 是本实验室通过ＧＣ筛
选得到的产 －亚麻酸的黑根霉Ｒ３０６（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｎ ／ｃａｎｓ）。
１．１．２试剂 胶回收试剂盒从上海华舜公司购
买，ＡＭＶ反转录酶、Ｔ。连接酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶从
上海生工公司购买，ＰＣＲ引物和测序由上海博亚
完成，大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ为本室保存，其他化学药
剂均为分析纯。
１．２方法
１．２．１ ＲＮＡ的提取取新鲜菌丝体，液氮速冻
并研磨成粉末，快速将粉末移入５０ ｍＬ离心管
中，迅速加入１２ ｍＬ变性液（５ ｍｏｌ／Ｌ异硫氢酸
胍，３７．５ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸，０．７５ ｍｏＬ／Ｌ十二烷基肌
酸钠），充分涡旋后，参照ＲＮＡ抽提试剂盒说明
书进行ＲＮＡ提取。核酸测定仪测定总ＲＮＡ的量
与纯度，并取适量样品进行电泳。
１．２．２ ｃＤＮＡ合成 取总ＲＮＡ ４ Ｌ，利用５端
磷酸化的弓Ｉ物 ｐ５ 一ＴＧｃＴｃＧＡＴ Ｉ ＧＡＴＡＧＴ－
ＴＣＡＡＴＣＣＡＣＣ－３ 在５Ｏ ｃＩ＝下反转录６０ ｍｉｎ，将合
成好的单链ｃＤＮＡ利用巢式引物进行放大扩增，
电泳检测后，取单链ｃＤＮＡ ５ Ｌ在Ｔ 连接酶作
用下１２ ｃＩ＝下连接过夜。连接产物在６５ ｃＩ＝下水
浴１０ ｍｉｎ终止反应。
１．２．３反向ＰＣＲ克隆Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基因
取环化好的ｃＤＮＡ １ Ｌ进行反向ＰＣＲ。所用
引物为与核心区互补的Ｆ ５ ．ＧＣＴＴＴＧＡＡＣＣＡ．
ＣＡＡＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴ Ｇ－３ ，Ｒ ５ ．ＡＡＧＣＡＴＡＣＡＡＡＡ．
ＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣ－３ 。ＰＣＲ扩增条件：９４℃预
变性５ ｒａｉｎ，３０个循环：９４ ｃＩ＝，３０ ｓ；４８ ｃＩ＝，
１ ｒａｉｎ；７２ ｃＩ＝，１ ｒａｉｎ；７２ ｃＩ＝延伸１５ ｒａｉｎ，电泳检测
ＰＣＲ产物。将其预测的条带切胶后用华舜的柱
式胶回收试剂盒回收。与Ｐｍｄｌ８．Ｔ载体连接后
转化大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ，通过蓝白斑和ＰＣＲ扩增筛／
选出阳性克隆。序列的测定由上海博亚完成。序
列的分析通过软件ＤＮＡｓｔａｒ进行。
１．２．４酶低温适应分析根据已报道的低温酶
冷适应机制，利用Ｅｘｐａｓｙ等生物信息软件对新克
隆黑根霉Ａ６－脂肪酸脱饱和酶基因的氨基酸序列
进行分析。
２ 结果与分析
２．１ ＲＮＡ的提取
提取总ＲＮＡ时采用加大裂解液浓度和取材
后不用磷酸缓冲液洗脱的方法，利用高浓度的异
硫氢酸胍迅速抑制ＲＮＡａｓｅ的活性，从而保证获
得最完整的ＲＮＡ。试验中发现新鲜材料经过洗
脱与不洗脱的效果不一样。用化学培养基培养的
真菌不经洗脱，直接抽提的效果好。洗脱后的均
发生程度不同的降解（见图１）。核酸测定仪测定
出ＲＮＡ的量为２．３４ ｇ／ Ｌ，纯度为９５．４％。
２．２ ｃＤＮＡ的合成
用５ 端带磷酸基团的引物进行反转录后，为
检测反转录质量，利用巢式引物对第一链ｃＤＮＡ
进行放大扩增。并对放大扩增后的双链ｃＤＮＡ进
行琼脂糖电泳检测，结果显示ｃＤＮＡ呈明显的拖
带，大小在１００—２００ ｂｐ到１Ｏ ｋｂ之间，其中亮度
最高的区域在１—３ ｋｂ间，这说明反转录完全，得
到了较高质量的ｃＤＮＡ（见图２）。
２．３反向ＰＣＲ克隆６－脂肪酸脱饱和酶基因
依据所得到的Ａ６－脂肪酸脱饱和酶基因的核
心序列，设计与序列特异的反向ＰＣＲ引物，以连
接过夜的ｃＤＮＡ环化产物为模板进行反向ＰＣＲ。
得到了预测大小的片段。对其进行亚克隆和测
序，测序和软件分析表明扩增正确。
２．４ Ａ６－脂肪酸脱饱和酶的低温适应分析
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微生物学杂志 ２８卷
黑根霉Ｒ３０６的最适培养温度为２０ ｏ【＝、最适
．
因中甘氨酸的量为２２个、天冬氨酸有２１个、精
氨酸有１２个、脯氨酸有１０个。肽链中甘氨酸和
Ｓ
亚麻酸生产温度为ｌ５℃，发酵试验发现较低的
孔４伯（
温度有利于黑根霉Ｒ３０６产生＾ｙ－亚麻酸。说明黑
天冬氨酸的增加能使酶分子的亲水性升高，增加
根霉Ｒ３０６的△６一脂肪酸脱饱和酶应该是一类适
了酶与溶剂的相互作用－ｔ 。而较少脯氨酸使酶
宜低温环境的低温酶。Ａｌｏｎｓｏ等人对与膜结合的
的非折叠多肽构象的自由度减少 ，它的减少有
脂肪酸脱饱和酶从结构和功能上进行了系统进化
利于提高酶的柔韧性，精氨酸中胍盐基团的共振
研究 ，但△６．脂肪酸脱饱和酶作为低温酶来研
一
方面为形成盐桥提供了可能，同时还成倍增加
究其分子作用机制还未见报道。低温酶主要的适
了与主链羧基氧之间的氢键，进而增强了酶的稳
应机制是通过氨基酸的变化降低酶的柔韧性 。
定性，所以低温酶中的精氨酸量较少¨ 。无论是
分析发现所克隆的真菌黑根霉Ｒ３０６Ａ６一脂肪酸脱
较长的肽链还是氨基酸的增减，这些都可以增加
饱和酶由４６０个氨基酸构成，较长的肽链能够为
酶分子的柔韧性。而酶分子柔韧性的增加使酶的
增加酶分子表面的环状结构、为增加酶的柔韧性
构象异构体数量升高 ，最终使△６．脂肪酸脱饱
提供了分子基础¨ 。Ｒ３０６ Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基
和酶有利于在低温下催化酶反应。
ａ ｂ
ｄ
图１ ＲＮＡ的电泳图
Ｆｉｇ．１ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｇｅｌ ｅｌｅｅｔｏｒｐｈｏｒｅｓｉｓ
ａ：裂解液浓度为４ ｍｏｌ／Ｌ；ｂ：裂解液浓度为５ ｍｏｌ／Ｌ，不洗脱；ｅ：洗脱１次；ｄ：洗脱３次
ａ：４ ｍｏｌ／Ｌ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｑｕｉｄ；ｂ：５ ｍｏｌ／Ｌ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｑｕｉｄ；ｅ：ｗａｓｈ ｏｎｅ；ｄ：ｗａｓｈ ｔｈｒｅｅ
物质的存在会严重影响到ＲＮＡ的抽提，所以提取
总ＲＮＡ时可以采用加大裂解液浓度和取材后不
用磷酸缓冲液洗脱的方法，利用高浓度的异硫氢
酸胍迅速抑制ＲＮＡａｓｅ的活性，保证获得最完整
的ＲＮＡ。通常的环化温度是１６℃，但试验发现
进一步降低连接温度能提高环化的质量，以在
１２ ｏ【＝环化为较好，将黑根霉Ｒ３０６Ａ６．脂肪酸脱饱
和酶同生产＾ｙ－亚麻酸常用的深黄被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒ－
图２反转录的ｃＤＮＡ电泳图
ａｌｉａ ｉｓａｂｅＵｉｎａ）进行比较，深黄被孢霉的△６．脂肪
Ｆｉｇ．２ ｅＤＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｇｅｌ ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
酸脱饱和酶基因仅有４００个氨基酸，而较长的肽
Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ
链能为酶的柔韧性提供分子基础ｎ 。氨基酸序
３ 讨 论
列中脯氨酸的总数或是在总氨基酸中所占的比
例，黑根霉的△６－脂肪酸脱氢酶所含有的脯氨酸
真菌中含有较多的糖和较高的ＲＮＡａｓｅ，这些
都是最低的。深黄被孢霉中天冬氨酸有１４个，
—、
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陆合等：反向ＰＣＲ克隆黑根霉Ｒ３０６Ａ６一脂肪酸脱饱和酶基因
］
ｌ
２
］
３
］ ］
４
］
５
］
６
２７
］
７
而黑根霉的△６一脂肪酸脱氢酶中有２１个，天冬氨
酸的增加能使酶分子的亲水性升高，增加酶与溶
剂的相互作用，进一步保证酶在低温下的稳定。
这样的分子结构说明黑根霉在生产 。亚麻酸上
有着比深黄被孢霉更好的工业适用性。
［８］Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏ，Ｂｅａｕｄｏｉｎ Ｆ，Ｌｉｂｉｓｃｈ Ｂ。ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ
ｈｅｔｅｒｃｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｏｆ ａ ｐｌａｎｔ Ｄｅｌｔａ６．－ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅ．．
ｓａｔｕｒａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ，２００１。５２：１ ５８１．１ ５８５．
［９］ Ｓｈａｎｋｉｎ Ｊ，Ｗｈｉｔｔｌｅ Ｅ。Ｆｏｘ ＢＧ．Ｅｉｇｈｔ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ
ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｉｎ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｒｏｎ ｅｎｚｙｍｅ
，
虽然获得基因全长的方法较多，但反向ＰＣＲ
技术步骤简单，工作量小，有效减少了其他ＲＡＣＥ
ｓｔｅａｒｏｙｌ－ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ａｒｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ａｌｋａｎｅ ｈｙｄｒｏｃｙｌａｓｅ
ａｎｄ ｘｙｌｅｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３：
ｌ２ ７８７一ｌ２ ７９４．
过程中对ＲＮＡ的损失，而提高了获得基因全长的
机会，为已知中间基因序列进行全序列分析提供
了新的方便手段。
参考文献：
Ｌｏｓ ＤＡ，Ｍｕｒａｔａ Ｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅ－
［１０］Ｚｅｃｃｈｉｎｏｎ Ｌ，Ｃｌａｖｅｒｉｅ Ｐ，Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｄ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ
ｅｎｚｙｍｅｓ ｒｅａｌｌｙ ｗｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ？［Ｊ］Ｅｘｔｅｍｏｐｈｉｒｌｅｓ，２００１，
５：３ｌ３－３２１．
［１ １］Ａｌｏｎｓｏ ＤＬ，Ｍａｒｃｔｏ ＦＧ，Ｒｕｉｚ ＲＪ。ｅｔ ａ１．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍ—
ｂｒａｎｅｂｏｕｎｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００３，３１：１ １１１—１ １２４．
ｓａｔｕｒａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９９８，１ ３９４：３－１５．
Ｏｋａｙａｓｕ Ｔ，Ｎａｇａｏ Ｍ，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒ－
ｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ
［１２］Ｋｕｌａｋｏｖａ Ｌ，Ｇａｌｋｉｎ Ａ，ＫｕｒｉｈａｒａＴ。ｅｔ ａ１．ｃｏｌｄ—ａｃｔｉｖｅ ｓｅｒｉｎｅ ａｌ—
ｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｓｙｃｈｒｃｔｃｐｈｉｒｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ
ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９８１，２０６：２１－２８．
Ｒｅｄｄｙ ＡＳ，Ｎｕｃｃｉｏ ＭＬ，Ｇｒｏｓｓ ＬＭ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ａ６＿ｄｅ—
ｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ
ＰＣＣ ６８０３ ｂｙ ｇａｉｎ—ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｎａｂａｅｎａ ８ｐ．ｓｔｒａｉｎ
ｓｔｒａｉｎ Ａｃｌｏ：Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ－
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，６５：６１１－６１７．
［１ ３］Ｉｒｗｉｎ ＪＡ，Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ ＨＭ，Ｍａｒｔｅｉｎｓｓｏｎ ＶＴ．ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃ—
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌａｎｉｎｅ ａｎｄ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ
ＰＣＣ ７１２０［Ｊ］．ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏ，１９９３，２７：２９３－３００．
Ｈｕａｎｇ ＹＳ，Ｃｈａｕｄｈａｒｙ Ｓ，Ｔｈｕｒｍｏｎｄ ＪＭ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ
△ｎ—ａｎｄ△‘一ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｈ ｓｔｒａｉｎ ｐａ－４３［Ｊ］．Ｅｘｔｅｍｏｐｈｉｒｌｅｓ，２００１，５：１９９－
２ｌ１．
［１４］Ｎａｒｉｎｘ Ｅ，Ｂａｉｓｅ Ｅ，Ｇｅｒｄａｙ Ｃ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｆｒｏｍ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ
Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｔｅ ｄｉｅｃｔｒｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅ－
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ￣＂／－ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｓ．ｃｅｒｅｖ￣ｉａｅ［Ｊ］．Ｌｉｐｉｄｓ，
１９９９，３４：６４９－６５９．
ｓｉｓ ｏｆ ｅｂｉｒｄｕｅｓ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｌｄ［Ｊ］．
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９７，１０：１ ２７１－１ ２７９．
Ｍｕｒｐｈｙ ＤＪ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｉｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｐｅｓｅｅｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ
ｏｉｌ ｃｒｏｐｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６，１４：２０６－２１３．
Ｎａｐｉｅｒ ＪＡ，Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ＬＶ，Ｓｔｏｂａｒｔ ＡＫ．Ｐｌａｎｔ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ：
［１５］Ｆｅｌｌｅｒ Ｇ，Ｐａｙａｎ Ｆ，Ｔｈｅｙ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｕｃｔｒｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｏｔ—ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏ—
ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｎｄ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ１．，
１９９９，２：１２３—１２７．
Ｓａｙａｎｏｖａ Ｏ，Ｓｍｉｔｈ Ｍ Ａ，Ｌａｐｉｎｓｋｅｓ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ
ｂｏｒａｇｅ ｄｅｓａｔｕｒｅｓｅ ｃＤＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ Ｎ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｃｍｅ
ｐｌａｎｃｔｉｓ Ａ２３［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４，２２２：４４１ ７．
［１６］Ｆｅｌｌｅｒ Ｇ，Ａｒｐｉｇｎｙ ＪＬ，Ｎａｒｉｎｘ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｓｙｃｈｒｃｐｈｉｌｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７，１１８Ａ：４９５－４９９．
ｂ５ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ａ６・－ｄｅ－
［１７］Ｇａｎｅｓｅ Ｇ，Ａｒｇｏｓ Ｐ，Ｐａｓｃａｒｅｌｌａ Ｓ．Ｓｔｕｃｔｒｕｒａｌ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎ—
ｚｙｍｅｓ ｔｏ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，１４：
ｌ４１．１４８．
ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｄ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４：４ ２１１－４ ２１６．
四阿围＜＜锄鳍锄学国总））