2024年3月16日发(作者：雪夏菡)
实验二 鸡新城疫弱毒疫苗的制备
新城疫又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒引起的鸡的一种高度接触
性传染病，其主要特征为呼吸困难、腹泻、神经紊乱及黏膜和浆膜出
血，一年四季均可发生，为我国养鸡业的头号疾病。预防和治疗所用
的新城疫疫苗种类很多，大致包括灭活疫苗和弱毒疫苗两类。下面以
新城疫弱毒疫苗为例讲述其制备过程。
一、目的与要求
1．掌握鸡新城疫弱毒疫苗的制备方法。
2．熟悉鸡新城疫弱毒疫苗制备的操作过程。
二、材料与试剂
材料：种蛋、鸡胚孵化箱、冰箱、无菌操作台、手术镊子、注射
器、蜡烛、酒精灯、酒精棉和碘酊等。
试剂：灭菌PBS液/生理盐水；青、链霉素溶液。
三、制备前准备
1、种毒的选择：种毒属于弱毒力毒株，包括HB1株、F株、LaSota
株、LaSota-Clone30和N79株。必须符合：①种毒对鸡胚的毒力。
以10倍稀释的种毒0.1ml尿囊腔接种10日龄鸡胚，鸡胚应于接种后
24-120h内死亡70%以上，胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上，
胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上。②种毒对1月龄雏鸡滴鼻
免疫的最小免疫量应不大于10
-3
/1滴。③种毒对10日龄鸡胚半数感
染量（EID
50
）应不大于10
-7
/0.1ml。④种毒对初生雏鸡不致病。
2、种毒的稀释：用灭菌PBS液或0.85%生理盐水10
-4
～10
-6
稀释种
毒，稀释时最好加入适当双抗溶液，并在4℃作用约4小时。
3、鸡胚的选择：最好选用SPF胚、其次选用非免疫胚，再次选用
普通胚。
四、操作过程
1、将购买的种蛋放于37℃温箱中孵育，加入适量水调节湿度。
2、孵育至9～11日龄时，将鸡胚置于黑暗的环境下，在照蛋器下，
可观察到明显的胚体运动、丰富的血管和气室，用铅笔划出接种部位
和气室部位。划线时要尽量避开胚头和血管（尤其是大血管）。
3、将划好的鸡胚置于经紫外线消毒过的超净台中，先用碘酊消毒，
再用酒精棉脱碘；
4、用手术镊子在标记部位打孔，打孔时要在接种部位和气室各打
一孔。
5、用灭菌注射器吸取0.1ml～0.2ml稀释病毒液，经接种孔注入鸡
胚尿囊腔中；
6、用石蜡先将接种孔封口后，在将气室孔封口；
7、做好标记（时间，名称），置37℃温箱中继续孵育，增殖病毒。
8、接种后24小时内死亡的鸡胚作细菌污染处理，弃去；96h～120h
内死亡胚或120h内仍活着的鸡胚置4℃冰箱4-24小时，使鸡胚血管
收缩。
9、将接种病毒鸡胚先用碘酊消毒，再用酒精棉脱碘，用镊子打破
气室部位蛋壳，再用灭菌过的吸管收取尿囊液于灭菌瓶中。尿囊液里
应含有大量的弱毒病毒。
10、加入5%蔗糖脱脂乳分装、冻干制备成冻干疫苗。
五、质量检验
1．安全检验：下列方法任选其一。
用鸡胚检验 将疫苗10倍稀释，尿囊腔接种0.1ml 10日龄鸡胚
10只，接种后24-72小时内鸡胚死亡率不超过20%为合格，若两次检
验结果均在接种后48h内全部死亡，并确定是由于接种物引起，则判
为不安全，不得用雏鸡再检，疫苗应予报废。
用鸡检验 用确无母源抗体的2-7日龄雏鸡20只 ，分成两组，
第1组10只，每只鼻孔内滴入10个使用剂量疫苗（约0.05ml ），
第2组10只作为对照。两组在同样条件下分开饲养观察10d ，应无
不良反应。每组死亡的鸡雏均须尸体剖检及细菌检查，任何一组非特
异性死亡鸡不得超过1只。
2．效力检验：下列方法任选其一。
用鸡检验 用1-2月龄健康鸡10只（不含母源抗体或无ND 血
凝抑制抗体），每只鼻孔滴入1/100使用剂量，10-14d 后与另3只对
照鸡同时肌肉注射ND 强毒10
4
ELD
50
，观察10-14d ，对照鸡应全部
发病死亡，免疫鸡至少9只全部健活，疫苗判为合格，否则重检1次。
用鸡胚检验 将10
-6
、10
-7
、10
-8
稀释的疫苗分3组接种10日龄
非免疫鸡胚，，每组接种鸡胚5只，每胚0.1ml ，48h 前死亡的鸡胚
不计，随时取出48-120h 死亡的鸡胚收获胚液，同组等量混合；至
120h 取出活胚逐个收获胚液，分别测定血凝价，1：160以上判为感
染，计算EID
50，
，EID
50
>=10
-7
/0.1ml ，判为合格。否则可重检1次
（或用鸡重检1次）。
3.保存与使用 对各种日龄鸡均可使用，但一般用于7日龄以上的雏
鸡较好。主要用于滴鼻和饮水免疫，免疫后7-9d 产生免疫力，该疫
苗在我国已广泛使用，证明效果良好。
收毒操作程序：
进入无菌室后，在操净工作台前坐下，用少量的酒精棉球将手消
毒，然后将手上的酒精拍干，将冷却后的鸡胚卵取出，气窒朝上，用
酒精棉球将鸡胚的气室部位消毒，再用碘酊棉球脱碘，然后用镊子敲
破气窒部位的卵壳，并剔除卵壳，揭去壳膜和羊膜，用无菌滴管吸取
尿囊液和羊水，装入灭菌瓶内，加入双抗500IU/ml，放入冰箱保存，
经检验合格后即成疫苗。
鸡胚观察：在收毒后，要对胚体进行观察（胚体全身充血，头、胸、
背。趐、趾部有小出血点）尿囊液和羊水是否清朗，若胚体无变化或
胎儿腐败，胚液混浊者应予以废弃。
接种操作程序：
进入无菌室—→酒精棉球消毒手—→将手拍干—→酒精棉球消毒
气室部位—→碘酊棉球脱碘—→用镊子敲破气窒部位的卵壳—→剔
除卵壳—→揭去壳膜和羊膜—→用滴管吸取尿囊液和羊水—→装入
灭菌瓶内—→对胚体进行观察—→放入废弃缸中
2024年3月16日发(作者：雪夏菡)
实验二 鸡新城疫弱毒疫苗的制备
新城疫又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒引起的鸡的一种高度接触
性传染病，其主要特征为呼吸困难、腹泻、神经紊乱及黏膜和浆膜出
血，一年四季均可发生，为我国养鸡业的头号疾病。预防和治疗所用
的新城疫疫苗种类很多，大致包括灭活疫苗和弱毒疫苗两类。下面以
新城疫弱毒疫苗为例讲述其制备过程。
一、目的与要求
1．掌握鸡新城疫弱毒疫苗的制备方法。
2．熟悉鸡新城疫弱毒疫苗制备的操作过程。
二、材料与试剂
材料：种蛋、鸡胚孵化箱、冰箱、无菌操作台、手术镊子、注射
器、蜡烛、酒精灯、酒精棉和碘酊等。
试剂：灭菌PBS液/生理盐水；青、链霉素溶液。
三、制备前准备
1、种毒的选择：种毒属于弱毒力毒株，包括HB1株、F株、LaSota
株、LaSota-Clone30和N79株。必须符合：①种毒对鸡胚的毒力。
以10倍稀释的种毒0.1ml尿囊腔接种10日龄鸡胚，鸡胚应于接种后
24-120h内死亡70%以上，胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上，
胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上。②种毒对1月龄雏鸡滴鼻
免疫的最小免疫量应不大于10
-3
/1滴。③种毒对10日龄鸡胚半数感
染量（EID
50
）应不大于10
-7
/0.1ml。④种毒对初生雏鸡不致病。
2、种毒的稀释：用灭菌PBS液或0.85%生理盐水10
-4
～10
-6
稀释种
毒，稀释时最好加入适当双抗溶液，并在4℃作用约4小时。
3、鸡胚的选择：最好选用SPF胚、其次选用非免疫胚，再次选用
普通胚。
四、操作过程
1、将购买的种蛋放于37℃温箱中孵育，加入适量水调节湿度。
2、孵育至9～11日龄时，将鸡胚置于黑暗的环境下，在照蛋器下，
可观察到明显的胚体运动、丰富的血管和气室，用铅笔划出接种部位
和气室部位。划线时要尽量避开胚头和血管（尤其是大血管）。
3、将划好的鸡胚置于经紫外线消毒过的超净台中，先用碘酊消毒，
再用酒精棉脱碘；
4、用手术镊子在标记部位打孔，打孔时要在接种部位和气室各打
一孔。
5、用灭菌注射器吸取0.1ml～0.2ml稀释病毒液，经接种孔注入鸡
胚尿囊腔中；
6、用石蜡先将接种孔封口后，在将气室孔封口；
7、做好标记（时间，名称），置37℃温箱中继续孵育，增殖病毒。
8、接种后24小时内死亡的鸡胚作细菌污染处理，弃去；96h～120h
内死亡胚或120h内仍活着的鸡胚置4℃冰箱4-24小时，使鸡胚血管
收缩。
9、将接种病毒鸡胚先用碘酊消毒，再用酒精棉脱碘，用镊子打破
气室部位蛋壳，再用灭菌过的吸管收取尿囊液于灭菌瓶中。尿囊液里
应含有大量的弱毒病毒。
10、加入5%蔗糖脱脂乳分装、冻干制备成冻干疫苗。
五、质量检验
1．安全检验：下列方法任选其一。
用鸡胚检验 将疫苗10倍稀释，尿囊腔接种0.1ml 10日龄鸡胚
10只，接种后24-72小时内鸡胚死亡率不超过20%为合格，若两次检
验结果均在接种后48h内全部死亡，并确定是由于接种物引起，则判
为不安全，不得用雏鸡再检，疫苗应予报废。
用鸡检验 用确无母源抗体的2-7日龄雏鸡20只 ，分成两组，
第1组10只，每只鼻孔内滴入10个使用剂量疫苗（约0.05ml ），
第2组10只作为对照。两组在同样条件下分开饲养观察10d ，应无
不良反应。每组死亡的鸡雏均须尸体剖检及细菌检查，任何一组非特
异性死亡鸡不得超过1只。
2．效力检验：下列方法任选其一。
用鸡检验 用1-2月龄健康鸡10只（不含母源抗体或无ND 血
凝抑制抗体），每只鼻孔滴入1/100使用剂量，10-14d 后与另3只对
照鸡同时肌肉注射ND 强毒10
4
ELD
50
，观察10-14d ，对照鸡应全部
发病死亡，免疫鸡至少9只全部健活，疫苗判为合格，否则重检1次。
用鸡胚检验 将10
-6
、10
-7
、10
-8
稀释的疫苗分3组接种10日龄
非免疫鸡胚，，每组接种鸡胚5只，每胚0.1ml ，48h 前死亡的鸡胚
不计，随时取出48-120h 死亡的鸡胚收获胚液，同组等量混合；至
120h 取出活胚逐个收获胚液，分别测定血凝价，1：160以上判为感
染，计算EID
50，
，EID
50
>=10
-7
/0.1ml ，判为合格。否则可重检1次
（或用鸡重检1次）。
3.保存与使用 对各种日龄鸡均可使用，但一般用于7日龄以上的雏
鸡较好。主要用于滴鼻和饮水免疫，免疫后7-9d 产生免疫力，该疫
苗在我国已广泛使用，证明效果良好。
收毒操作程序：
进入无菌室后，在操净工作台前坐下，用少量的酒精棉球将手消
毒，然后将手上的酒精拍干，将冷却后的鸡胚卵取出，气窒朝上，用
酒精棉球将鸡胚的气室部位消毒，再用碘酊棉球脱碘，然后用镊子敲
破气窒部位的卵壳，并剔除卵壳，揭去壳膜和羊膜，用无菌滴管吸取
尿囊液和羊水，装入灭菌瓶内，加入双抗500IU/ml，放入冰箱保存，
经检验合格后即成疫苗。
鸡胚观察：在收毒后，要对胚体进行观察（胚体全身充血，头、胸、
背。趐、趾部有小出血点）尿囊液和羊水是否清朗，若胚体无变化或
胎儿腐败，胚液混浊者应予以废弃。
接种操作程序：
进入无菌室—→酒精棉球消毒手—→将手拍干—→酒精棉球消毒
气室部位—→碘酊棉球脱碘—→用镊子敲破气窒部位的卵壳—→剔
除卵壳—→揭去壳膜和羊膜—→用滴管吸取尿囊液和羊水—→装入
灭菌瓶内—→对胚体进行观察—→放入废弃缸中