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中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉小鼠免疫功能调节作用的比较

IT圈 admin 40浏览 0评论

2024年3月17日发(作者:越如风)

2012年9月 

中国比较医学杂志 

CHINESE J0URNAL OF COMPARATIVE MEDICINE 

September,2012 

第22卷第9期 

Vol_22 NO.9 

研究报告 

石\ 、 .

中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉小鼠免疫功能调节 

作用的比较 

傅惠英 ,张利棕 ,寿旗扬 ,周卫民 ,屠 珏 ,陈民利 

(1.浙江中医药大学第二临床医学院,杭州 310053;2.浙江中医药大学动物实验研究中心,杭州 310053) 

【摘要】 目的 观察中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠免疫功能的影响。方法 分别给予中国被毛孢和 

蝙蝠蛾拟青霉后,测定观察对小鼠碳粒廓清功能、迟发性变态反应、溶血素抗体、淋巴细胞增殖和NK细胞活性等的 

影响。结果3.0 s/kg中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉可显著提高小鼠吞噬指数和半数溶血值(P<0.O1)、显著提高 

T、B淋巴细胞增殖能力(P<0.01,P<0.05)、显著提高NK细胞活性(P<0.05),0.5~1.5 g/kg中国被毛孢都能显 

著抑制小鼠耳廓肿胀(P<0.O1,P<0.05),同时还能抑制脾脏和胸腺增大(P<0.01,P<0.05)。结论 中国被毛 

孢和蝙蝠蛾拟青霉均具有免疫调节作用,而中国被毛孢免疫抑制及增强天然免疫系统作用要优于蝙蝠蛾拟青霉, 

而对适应性免疫系统增强作用蝙蝠蛾拟青霉优于中国被毛孢。 

【关键词】 中国被毛孢;蝙蝠蛾拟青霉;小鼠;免疫功能调节 

【中图分类号】R285.5 R332 【文献标识码】A 【文章编号】1671—7856(2012)09-0016-05 

doi:10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.004 

Comparison and Characterization on Immunomodulatory Function of 

Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali in Mice 

FU Hui.ying ,ZHANG Li—zong ,SHOU Qi—yang ,ZHOU Wei—min ,TU Jue ,CHEN Min—li 

(1.The Second Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China; 

2.Laboratory Animal Research Center,Zhejiang Chinese Medical University.Hangzhou 310053,China) 

【Abstract】 0bjective Compare with the immunomodulatoy frunction by Hirsutella sinensis and Paecilomyces 

hepiali in vivo.Method After the mice were administrated by Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali.Observed 

carbon particle clearance function,delayed type hypersensitivity,hemolytic antibody,lymphocyte proliferation and N K cell 

activity in mice,and Cordyceps sinensis as a positive contro1.Result 3.0g/kg Hirsutella sinensis and Paecilomyces 

hepiali can significantly improve the phagocyte index and half of hemolysis value(P<0.叭).3.0 g/kg Hirsutella sinensis 

and Paecilomyces hepiali can significantly improve the T,B lymphocyte proliferation(P<0.01,P<0.05).3.0 g/kg 

Hirsutella sinensis can significantly enhance the activity of NK cells(JP<0.05).0.5~1.5 g/kg Hirsutella sinensis can 

significantly inhibit the ear edema in mice(P<0.01,P<0.05),at the same time 1.5 g/kg Hirsutella sinensis can 

inhibit the spleen and thymus increases(P<0.O1.P<0.05).Conclusion Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali 

have Immun0m0dulatory effects.Hirsutella sinensis.The Hirsutella sinensis were better than Paecilomyces hepiali in 

immunosuppressjon and enhance the ro]e of the innate immune system.Paecilomyces hepiali were better than the Hirsutella 

[基金项目]浙江省自然科学基金项目(Y2110727);浙江省中医药科学研究基金计划(2011ZA021)。 

[作者简介]傅惠英(1980一),女,研究方向:中药药理学,E-mail:fhyl31@126.corn。 

[通讯作者】寿旗扬(1979一),男,研究方向:中药药理与比较医学,E—mail:sqy133@126.com。 

中国比较医学杂志2012年9月第22卷第9期 Chin J Comp Med,September 2012,Vo1.22.No.9 17 

sinensis in enhanced adaptive immune system. 

【Key words】Hirsutella sinensis;Paecilomyces hepiali;Mice;Immunomodulatory function 

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是我国传统滋补 

中药材,但由于价格的昂贵及野生资源的枯竭,人 

1.1.3仪器设备:半自动生化分析仪,荷兰Merck 

Vitalab Micro;FA1004型分析天平,上海天平仪器 

厂;TG.16型高速冷冻离心机,上海安亭科技仪器公 

司;725型一86℃低温冰箱,美国FORMA;128C.340 

型酶标仪:奥地利CliniBio;CB-150型CO:培养箱: 

德国Binder;ZEISS AXIOVERT 200倒置显微镜:德 

们逐渐使用人工虫草菌粉来替代天然冬虫夏草。 

从上个世纪80年代起,我国研究人员陆续从天然冬 

虫夏草中分离到多个菌种,文献报道已有22个学 

名,涉及13个属 。随着分子生物学手段发展,越 

来越多的证据显示中国被毛孢为冬虫夏草的无性 

型 -4]。但杨金玲等 发现冬虫夏草除了中国被毛 

孢菌寄生外,还存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌, 

进而认为冬虫夏草功效可能归因于中国被毛孢、蝙 

蝠蛾拟青霉及其它内寄生菌的不同代谢产物共同 

作用。因此,本文以天然冬虫夏草作对照,分别观 

察中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠免疫功能的 

影响,比较两者在调节免疫功能方面的差异,为临 

床使用提供依据。 

1 材料 

1.1药物和试剂 

1.1.1 药物:中国被毛孢(Hirsutella sinensis,HS), 

黄色粉末;蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali,PH), 

黄色粉末,均由杭州泰士生物科技有限公司提供。 

冬虫夏草(Cordyceps sinensis,CS):产地青海玉树,购 

自青海药材公司,打粉并60目过筛。以上三种药物 

避光干燥、常温(25℃以下)保存,临用前用生理盐 

水溶解至所需浓度。 

1.1.2印度墨汁(080321,北京中西远大);碳酸钠 

(051109,上海虹光化工厂);二硝基氟苯 

(20081011,上海化学试剂公司);都氏试剂 

(0311 14,宁波慈城生化);刀豆素(20071001, 

sigma);脂多糖(024K4067,sigma);噻唑蓝溶液 

(27196EJ,sigma);二甲基亚砜(20060607,无锡海硕 

生物);YAC-1细胞(中科院上海细胞所);绵羊红细 

胞悬液(绵羊外颈静脉取血,除去纤维蛋白,加入10 

倍量的保存液);补体(取5只豚鼠全血,分离出血 

清,将1 mL压积SRBC加入到5 mL豚鼠血清中,放 

4 ̄C冰箱30 min,离心取上清,一70 ̄C保存)。 

1.1.2动物:SPF级ICR小鼠,体重18 22 g,雄 

性,210只,SPF级BALB/c小鼠,体重18~22 g,雄 

性,36只,由中国科学院上海实验动物中心/上海斯 

莱克实验动物有限公司提供[生产许可证:SCXK 

(沪)2007—0005]。 

国ZEISS。 

1.2方法 。。 

1.2.1 对小鼠体内碳粒廓清功能影响:取体重为 

18~22 g的雄性ICR小鼠70只,按体重随机分为7 

组,即正常对照组、模型对照组、HS低剂组(1.0 g/ 

kgHS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH低剂组(1.0 

g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和CS组(1.0 

g/kg CS),每组10只,连续灌胃给药7 d,每日一次。 

末次给药24 h后,除正常对照组尾静脉注射生理盐 

水,其余各组小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁 

(0.1 mL/10g体重),注入墨汁后2、10 min,分别从 

内眦静脉丛取血10 uL,并立即将其加到1 mL 0.1% 

Na:CO 溶液中。在600 nm波长处测OD值。取小 

鼠肝脏和脾脏,吸干脏器表面血污后称重。计算吞 

噬指数=(体重/肝脾重)×[(1ogOD 一logOD 。)/ 

(T 。一f )] 。 

1.2.2对二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应影 

响:取体重为18~22 g的雄性ICR小鼠70只,按体 

重随机分为7组,即正常对照组、模型对照组、HS低 

剂组(0.5 g/kg HS)、HS高剂组(1.5 g/kg HS)、PH 

低剂组(0.5 g/kg PH)、PH高剂组(1.5 g/kg PH)和 

cs组(0.5 g/kg CS),每组10只,连续灌胃给药13 

d,每日一次,给药第7天时致敏,小鼠腹部皮肤用脱 

毛(3 cm×3 cm),用1%DNFB溶液5O L均匀涂抹 

致敏。致敏5 d后,用DNFB溶液10 L均匀涂抹 

于小鼠右耳(两面)进行攻击,攻击后24 h颈椎脱臼 

处死小鼠,剪下左右耳廓。用打孑L器取下直径8 mm 

的耳片,用分析天平精密称重,并计算耳肿胀度,取 

脾脏和胸腺,称重计算脾脏和胸腺指数。 

1.2.3对SRBC致小鼠溶血素抗体生成影响:取体 

重为18~22 g的雄性ICR小鼠7O只,按体重随机 

分为7组,即正常对照组、模型对照组、HS低剂组 

(1.0 g/kg HS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH低剂 

组(1.0 g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和cs 

组(1.0 g/kg cs),每组1O只,各组分别给予相应浓 

18 中国比较医学杂志2012年9月第22卷第9期Chin J Comp Med,September 2012,Vo1.22.No.9 

度的相应药物,每日一次,连续给药7 d,腹腔注射 

20%SRBC0.2 mL免疫4 d后,小鼠眼眶取血,取血 

清用SA缓冲液稀释500倍。将稀释后的血清1 mL 

置试管内,依次加入10%(v/v)SRBC 0.5 mL,补体 

1 mL(用SA液按1:8稀释)。另设不加血清的对照 

管(以SA液代替)。置37cI二恒温水浴中保温30 min 

后,冰浴终止反应。2000 r/min离心10 min。取上 

清液1 mL,加都氏试剂3 mL,同时取10%(v/v) 

SRBC 0.25 mL加都氏试剂至4 mL,充分混匀,放置 

10 min,于540 nm处以对照管作空白,分别测定各 

管光密度值,计算样品管半数溶血值(HC 。),HC 。 

(样品的吸光度值/SRBC半数溶血时的吸光度 

值)x稀释倍数。 

1.2.4对小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活 

性影响:取体重为18~22 g的雄性BALB/c小鼠36 

只,按体重随机分为6组,即空白对照组、HS低剂组 

(1.0 g/kg HS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH低剂 

组(1.0 g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和CS 

组(1.0 g/kg CS),每组6只,连续给药7 d后,进行 

脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性测定。 

1.2.4.1 脾淋巴细胞增殖反应:小鼠无菌取脾于培 

养基中,捣碎,使细胞分散均匀,过滤,离心,去上 

清,培养液洗涤2次。脾细胞制成10 x 10。个/mL, 

布板:96孔板每孔加细胞200 L,每一样重复4孔, 

同时设立空白对照。样品孔加ConA2.5 Ixg/mL或 

LPS5.0 Ixg/mL,对照孔不加,37℃5%CO,培养箱中 

培养72 h。加入MTT 10 L,继续培养4 h,弃上清 

液,加入二甲基亚砜150 IxL,充分振荡,于570 nm 

测OD值。计算刺激指数:刺激指数=加ConA或 

LPS细胞孔的平均OD值÷对照孑L的平均OD值。 

1.2.4.2 NK细胞活性检测:取YAC一1靶细胞和效 

应细胞各100 L(效靶比50:1),加入96孔培养板 

中;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 

100 L,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各 

100 IxL;设三个复孔,于37℃、5%CO2培养箱中培 

养4 h,然后将96孔培养板以1500 r/min离心5 

min,每孔吸取上清100 IxL置平底96孔培养板中, 

同时加入LDH基质液100 IxL,反应3 min,每孔加入 

1 mol/L的HC1 30lxL,在酶标仪490 nm处测定光密 

度值(OD)。NK细胞活性(NK cell activity,%)= 

(OD 一(ODS-ODE))/ODT X 100%,ODT:靶细胞空 

白光密度值,OD :样品光密度值,OD :效应细胞空 

白光密度值。 

1.2.5 统计学分析:结果以x±s表示,使用 

SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析。 

2 结果 

2.1 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠体内碳粒 

廓清功能影响 

由表1可见,与模型对照组比较,给予3.0 g/kg 

中国被毛孢、3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉和1.0 g/kg冬 

虫夏草后,小鼠碳粒吞噬指数均显著升高(P< 

0.05);而1.0 g/kg中国被毛孢和1.0 g/kg蝙蝠蛾 

拟青霉有升高小鼠碳粒吞噬指数的趋势,但无显著 

差异(P>0.05)。 

表1 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠体内碳 

粒廓清功能影响(i± ,n=10) 

Tab.1 The effects in carbon clearance function by HS 

and PH in mice(i± ,n=10) 

组 ̄/Groups给药剂量/Drugs吞噬指数/Phagocytic index 

注:与正常对照组比较, P<0.05,“P<0.01;与模型对照组 

比较, P<0.05, P<0.01 

Note:compared withnormal control group, P<0.05, P< 

0.01;compared with model control group, P<0.05,” P 

<0.O1 

2.2 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对二硝基氟苯诱 

导小鼠迟发型变态反应影响 

由表2可见,与正常对照组比较,模型对照组小 

鼠经二硝基氟苯(DNFB)诱导后,耳廓明显肿胀和 

脾脏显著增大(P<0.01),胸腺略有增大,但无显著 

性差异(P>0.05)。给予不同剂量的中国被毛孢 

和蝙蝠蛾拟青霉后均具有不同程度的抑制小鼠耳 

廓肿胀、脾脏增大,与模型对照组比较,1.5 g/kg中 

国被毛孢的小鼠耳廓肿胀显著降低(P<0.01),0.5 

g/kg中国被毛孢、0.5—1.5 g/kg蝙蝠蛾拟青霉和 

0.5 g/kg冬虫夏草对小鼠耳廓肿胀度均明显降低 

(P<0.05);1.5 g/kg中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和 

0.5 g/kg冬虫夏草能明显抑制脾脏增大的作用(P 

<0.05),1.5 g/kg中国被毛孢高和0.5 g/kg冬虫 

夏草能显著抑制胸腺增大的作用(P<0.01,P< 

0.05)。 

中国比较医学杂志2012年9月第22卷第9期 Chin J Comp Med,September 2012,Vo1.22.No.9 19 

表2 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对DNFB诱导小鼠迟发型变态反应影响(i 4-s,/7,=10) 

Tab.2 The effects in DNFB—induced delayed type hypersensitivity by HS and PH in mice( ±s,n=10) 

注:与正常对照组比较, P<0.05,“P<0.01;与模型对照组比较, P<0.05,”P<0.O1 

Note:compared with normal control group,△P<005,AAP<0

01;compared with model control group, P<0.05, .P<0.01 

..

2.3 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对SRBC致小鼠 

2.4 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠脾淋巴细 

胞增殖反应和NK细胞活性影响 

溶血素抗体生成影响 

由表3可见,与正常对照组比较,模型对照组的 

由表4可见,与空白对照组比较,中国被毛孢、 

小鼠半数溶血值明显升高(P<0.01);与模型对照 

组比较,3.0 g/kg中国被毛孢、1~3.0 g/kg蝙蝠蛾 

拟青霉和1.0 g/kg冬虫夏草均能显著升高小鼠的 

蝙蝠蛾拟青霉高剂量(3.0 g/kg)组和拟青霉低(1.0 

g/kg)剂量、冬虫夏草组均能显著提高T淋巴细胞 

增殖作用(P<0.01),中国被毛孢低剂量组也能显 

著提高T淋巴细胞增殖作用(P<0.05),但作用明 

显低于拟青霉低剂组(P<0.05);中国被毛孢、拟青 

半数溶血值(P<0.01),1.0 g/kg中国被毛孢对 

SRBC免疫小鼠的半数溶血值有明显升高作用(P< 

0.05)。 

表3 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对SRBC致 

小鼠溶血素抗体生成影响(露4-s,t=10)I 

Tab.3 The effects in SRBC-induced hemolysin antibody by 

霉、冬虫夏草低剂量组还能促进B淋巴细胞增殖作 

用,而中国被毛孢低剂量组无显著作用。与正常对 

照组比较,被毛孢高剂量组(3.0 g/kg)和低剂量 

(1.0 g/kg)以及冬虫夏草组均能显著性提高NK细 

胞活性(P<0.05),被毛孢低剂量(1.0 g/kg)提高 

HS and PH in mice( ±s,n=10) 

NK细胞活性的作用明显强于蝙蝠蛾拟青霉低剂量 

(1.0 g/kg),蝙蝠蛾拟青霉无论高、低剂量组对NK 

细胞活性均无显著性差异。 

3 讨论 

中国被毛孢菌粉和蝙蝠蛾拟青酶已有很多文 

注:与正常对照组比较, P<0.05,“P<0.O1;与模型对照组 

比较, P<0.05,”P<0.01. 

Note:compared with normal control group, P<0.05, P< 

0.01;compared with model control group, 

<0.01. 

献报道均有免疫调节功能,其增强或抑制作用取决 

于机体的生理状态,即炎症迹象的程度,在无炎症 

迹象时,冬虫夏草促进DCs向Thl型免疫,反过来, 

P<0.05,”P 

表4 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性影响( 4-s, =6) 

Tab.4 The effects in Splenocyte proliferation and NK cell activity by HS and PH in mice(面4-s,n=6) 

注:与空白对照组比较, P<0.05,”P<0.01;与HS低剂组比较, P<0.05 

Note:compared withblank control group, P<0.05,”P<0.O1;compared with model control group, P<0.05 

20 中国比较医学杂志2012年9月第22卷第9期Chin J Comp Med,September 2012,Vo1.22.No.9 

就抑制Thl型超敏反应,在一定程度上体现了中医 

药对机体调控作用的特色 。本文通过免疫药效 

强作用蝙蝠蛾拟青霉略强于中国被毛孢。 

参考文献: 

蒋毅,姚一建.冬虫夏草无性型研究概况[J].菌物系统, 

2003,22(1)161—176. 

功能评价体系对中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉一同 

进行免疫调节作用研究,观察两者是否具有差异。 

实验结果显示,中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和 

冬虫夏草均具有免疫调节作用,但两者在作用程强 

和作用靶向性各有倾向。在免疫增强方面,中国被 

赵锦,王宁,陈月琴等.冬虫夏草无性型的分子鉴别.中山大 

学学报(自然科学版)1999.38(1):121. 

王宁,陈月琴,章卫民等.虫草属多元起源的分子生物学证 

据.中山大学学报(自然科学版).2000,39(14):70. 

魏鑫丽,印象初,郭英兰等.冬虫夏草及其相关类群的分子系 

统学分析.菌物学报.2006,25(2):192. 

毛孢和蝙蝠蛾拟青霉均可显著提高小鼠吞噬指数 

和半数溶血值;同时也均能促进T、B淋巴细胞增殖 

能力,但蝙蝠蛾拟青霉作用要强于中国被毛孢;中 

国被毛孢还能显著提高NK细胞活性,而蝙蝠蛾拟 

青霉在本研究中未发现。在免疫抑制方面,中国被 

杨金玲,肖薇,何惠霞,等.蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草关系的 

分子系统学研究[J].药学学报,2008,43(4):421—426. 

徐孝平,王辉,陈民利,等.盐酸奥芬米洛对二硝基氟苯诱导 

小鼠迟发型变态反应的影响[J].浙江中医药大学学报, 

2006,30(6):617. 

毛孢除能抑制小鼠耳廓肿胀程度外,还能抑制小鼠 

脾脏和胸腺增大,而蝙蝠蛾拟青酶对胸腺增大无作 

用,中国被毛孢免疫抑制作用要强于蝙蝠蛾拟青霉。 

因此,通过检测中国被毛孢菌粉和蝙蝠蛾拟青霉 

菌粉对先天性免疫系统NK活性、吞噬指数的影响及 

i i i 

王辉,林琳,陈民利,等.盐酸奥芬米洛对小鼠细胞免疫功能 

的影响[J].实验动物与比较医学,2008,28(3):177. 

寿旗扬,傅惠英,陈方明,等.中国被毛孢发酵物对NOD小鼠1型 

糖尿病的预防作用[J].中草药.2010,41(8):1311—1315. 

Li CY,Chiang CS,Tsai mL,et a1.Two—sided effect of Cordyceps 

9 

 

对适应性免疫系统细胞免疫、体液免疫的影响,结果 

i j i

l 2 3 4 5 6 7 8 

表明中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉均具有免疫调节作 

sinensis on dendritic cells in different physiological stages[J]. 

Journal of Leukocyte Biology.2009,85(6):987—995. 

用,但中国被毛孢免疫抑制作用及增强天然免疫系统 

作用要强于蝙蝠蛾拟青霉,而对适应性性免疫系统增 

(上接第16页) 

][一4 一 一~][~一5 ~一~一~一 一][一6 一~ 一][~一7 ~一

[修回日期]2012-08 25 

提高,仅使造血干细胞数量增加,而不能增强其干 

细胞功能,生成淋巴细胞的能力降低,所以,老龄小 

鼠B淋巴细胞及T减少 ’ 。本研究发现随年龄增 

长,Cramp基因敲除后,骨髓长期造血干细胞(LT— 

HSC)减少,而骨髓多潜能造血祖细胞(MPP—HSC) 

增多;同时,骨髓中前体B淋巴细胞和未成熟B淋 

巴细胞减少,而成熟B淋巴细胞增多。这说明 

Cramp基因在骨髓造血干细胞及B淋巴细胞发育及 

衰老中具有重要作用,其作用机制有待进一步深入 

研究。 

参考文献 

[1] 

[2] 

[3] 

[修回日期]2012-08—25 

2024年3月17日发(作者:越如风)

2012年9月 

中国比较医学杂志 

CHINESE J0URNAL OF COMPARATIVE MEDICINE 

September,2012 

第22卷第9期 

Vol_22 NO.9 

研究报告 

石\ 、 .

中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉小鼠免疫功能调节 

作用的比较 

傅惠英 ,张利棕 ,寿旗扬 ,周卫民 ,屠 珏 ,陈民利 

(1.浙江中医药大学第二临床医学院,杭州 310053;2.浙江中医药大学动物实验研究中心,杭州 310053) 

【摘要】 目的 观察中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠免疫功能的影响。方法 分别给予中国被毛孢和 

蝙蝠蛾拟青霉后,测定观察对小鼠碳粒廓清功能、迟发性变态反应、溶血素抗体、淋巴细胞增殖和NK细胞活性等的 

影响。结果3.0 s/kg中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉可显著提高小鼠吞噬指数和半数溶血值(P<0.O1)、显著提高 

T、B淋巴细胞增殖能力(P<0.01,P<0.05)、显著提高NK细胞活性(P<0.05),0.5~1.5 g/kg中国被毛孢都能显 

著抑制小鼠耳廓肿胀(P<0.O1,P<0.05),同时还能抑制脾脏和胸腺增大(P<0.01,P<0.05)。结论 中国被毛 

孢和蝙蝠蛾拟青霉均具有免疫调节作用,而中国被毛孢免疫抑制及增强天然免疫系统作用要优于蝙蝠蛾拟青霉, 

而对适应性免疫系统增强作用蝙蝠蛾拟青霉优于中国被毛孢。 

【关键词】 中国被毛孢;蝙蝠蛾拟青霉;小鼠;免疫功能调节 

【中图分类号】R285.5 R332 【文献标识码】A 【文章编号】1671—7856(2012)09-0016-05 

doi:10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.004 

Comparison and Characterization on Immunomodulatory Function of 

Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali in Mice 

FU Hui.ying ,ZHANG Li—zong ,SHOU Qi—yang ,ZHOU Wei—min ,TU Jue ,CHEN Min—li 

(1.The Second Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China; 

2.Laboratory Animal Research Center,Zhejiang Chinese Medical University.Hangzhou 310053,China) 

【Abstract】 0bjective Compare with the immunomodulatoy frunction by Hirsutella sinensis and Paecilomyces 

hepiali in vivo.Method After the mice were administrated by Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali.Observed 

carbon particle clearance function,delayed type hypersensitivity,hemolytic antibody,lymphocyte proliferation and N K cell 

activity in mice,and Cordyceps sinensis as a positive contro1.Result 3.0g/kg Hirsutella sinensis and Paecilomyces 

hepiali can significantly improve the phagocyte index and half of hemolysis value(P<0.叭).3.0 g/kg Hirsutella sinensis 

and Paecilomyces hepiali can significantly improve the T,B lymphocyte proliferation(P<0.01,P<0.05).3.0 g/kg 

Hirsutella sinensis can significantly enhance the activity of NK cells(JP<0.05).0.5~1.5 g/kg Hirsutella sinensis can 

significantly inhibit the ear edema in mice(P<0.01,P<0.05),at the same time 1.5 g/kg Hirsutella sinensis can 

inhibit the spleen and thymus increases(P<0.O1.P<0.05).Conclusion Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali 

have Immun0m0dulatory effects.Hirsutella sinensis.The Hirsutella sinensis were better than Paecilomyces hepiali in 

immunosuppressjon and enhance the ro]e of the innate immune system.Paecilomyces hepiali were better than the Hirsutella 

[基金项目]浙江省自然科学基金项目(Y2110727);浙江省中医药科学研究基金计划(2011ZA021)。 

[作者简介]傅惠英(1980一),女,研究方向:中药药理学,E-mail:fhyl31@126.corn。 

[通讯作者】寿旗扬(1979一),男,研究方向:中药药理与比较医学,E—mail:sqy133@126.com。 

中国比较医学杂志2012年9月第22卷第9期 Chin J Comp Med,September 2012,Vo1.22.No.9 17 

sinensis in enhanced adaptive immune system. 

【Key words】Hirsutella sinensis;Paecilomyces hepiali;Mice;Immunomodulatory function 

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是我国传统滋补 

中药材,但由于价格的昂贵及野生资源的枯竭,人 

1.1.3仪器设备:半自动生化分析仪,荷兰Merck 

Vitalab Micro;FA1004型分析天平,上海天平仪器 

厂;TG.16型高速冷冻离心机,上海安亭科技仪器公 

司;725型一86℃低温冰箱,美国FORMA;128C.340 

型酶标仪:奥地利CliniBio;CB-150型CO:培养箱: 

德国Binder;ZEISS AXIOVERT 200倒置显微镜:德 

们逐渐使用人工虫草菌粉来替代天然冬虫夏草。 

从上个世纪80年代起,我国研究人员陆续从天然冬 

虫夏草中分离到多个菌种,文献报道已有22个学 

名,涉及13个属 。随着分子生物学手段发展,越 

来越多的证据显示中国被毛孢为冬虫夏草的无性 

型 -4]。但杨金玲等 发现冬虫夏草除了中国被毛 

孢菌寄生外,还存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌, 

进而认为冬虫夏草功效可能归因于中国被毛孢、蝙 

蝠蛾拟青霉及其它内寄生菌的不同代谢产物共同 

作用。因此,本文以天然冬虫夏草作对照,分别观 

察中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠免疫功能的 

影响,比较两者在调节免疫功能方面的差异,为临 

床使用提供依据。 

1 材料 

1.1药物和试剂 

1.1.1 药物:中国被毛孢(Hirsutella sinensis,HS), 

黄色粉末;蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali,PH), 

黄色粉末,均由杭州泰士生物科技有限公司提供。 

冬虫夏草(Cordyceps sinensis,CS):产地青海玉树,购 

自青海药材公司,打粉并60目过筛。以上三种药物 

避光干燥、常温(25℃以下)保存,临用前用生理盐 

水溶解至所需浓度。 

1.1.2印度墨汁(080321,北京中西远大);碳酸钠 

(051109,上海虹光化工厂);二硝基氟苯 

(20081011,上海化学试剂公司);都氏试剂 

(0311 14,宁波慈城生化);刀豆素(20071001, 

sigma);脂多糖(024K4067,sigma);噻唑蓝溶液 

(27196EJ,sigma);二甲基亚砜(20060607,无锡海硕 

生物);YAC-1细胞(中科院上海细胞所);绵羊红细 

胞悬液(绵羊外颈静脉取血,除去纤维蛋白,加入10 

倍量的保存液);补体(取5只豚鼠全血,分离出血 

清,将1 mL压积SRBC加入到5 mL豚鼠血清中,放 

4 ̄C冰箱30 min,离心取上清,一70 ̄C保存)。 

1.1.2动物:SPF级ICR小鼠,体重18 22 g,雄 

性,210只,SPF级BALB/c小鼠,体重18~22 g,雄 

性,36只,由中国科学院上海实验动物中心/上海斯 

莱克实验动物有限公司提供[生产许可证:SCXK 

(沪)2007—0005]。 

国ZEISS。 

1.2方法 。。 

1.2.1 对小鼠体内碳粒廓清功能影响:取体重为 

18~22 g的雄性ICR小鼠70只,按体重随机分为7 

组,即正常对照组、模型对照组、HS低剂组(1.0 g/ 

kgHS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH低剂组(1.0 

g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和CS组(1.0 

g/kg CS),每组10只,连续灌胃给药7 d,每日一次。 

末次给药24 h后,除正常对照组尾静脉注射生理盐 

水,其余各组小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁 

(0.1 mL/10g体重),注入墨汁后2、10 min,分别从 

内眦静脉丛取血10 uL,并立即将其加到1 mL 0.1% 

Na:CO 溶液中。在600 nm波长处测OD值。取小 

鼠肝脏和脾脏,吸干脏器表面血污后称重。计算吞 

噬指数=(体重/肝脾重)×[(1ogOD 一logOD 。)/ 

(T 。一f )] 。 

1.2.2对二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应影 

响:取体重为18~22 g的雄性ICR小鼠70只,按体 

重随机分为7组,即正常对照组、模型对照组、HS低 

剂组(0.5 g/kg HS)、HS高剂组(1.5 g/kg HS)、PH 

低剂组(0.5 g/kg PH)、PH高剂组(1.5 g/kg PH)和 

cs组(0.5 g/kg CS),每组10只,连续灌胃给药13 

d,每日一次,给药第7天时致敏,小鼠腹部皮肤用脱 

毛(3 cm×3 cm),用1%DNFB溶液5O L均匀涂抹 

致敏。致敏5 d后,用DNFB溶液10 L均匀涂抹 

于小鼠右耳(两面)进行攻击,攻击后24 h颈椎脱臼 

处死小鼠,剪下左右耳廓。用打孑L器取下直径8 mm 

的耳片,用分析天平精密称重,并计算耳肿胀度,取 

脾脏和胸腺,称重计算脾脏和胸腺指数。 

1.2.3对SRBC致小鼠溶血素抗体生成影响:取体 

重为18~22 g的雄性ICR小鼠7O只,按体重随机 

分为7组,即正常对照组、模型对照组、HS低剂组 

(1.0 g/kg HS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH低剂 

组(1.0 g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和cs 

组(1.0 g/kg cs),每组1O只,各组分别给予相应浓 

18 中国比较医学杂志2012年9月第22卷第9期Chin J Comp Med,September 2012,Vo1.22.No.9 

度的相应药物,每日一次,连续给药7 d,腹腔注射 

20%SRBC0.2 mL免疫4 d后,小鼠眼眶取血,取血 

清用SA缓冲液稀释500倍。将稀释后的血清1 mL 

置试管内,依次加入10%(v/v)SRBC 0.5 mL,补体 

1 mL(用SA液按1:8稀释)。另设不加血清的对照 

管(以SA液代替)。置37cI二恒温水浴中保温30 min 

后,冰浴终止反应。2000 r/min离心10 min。取上 

清液1 mL,加都氏试剂3 mL,同时取10%(v/v) 

SRBC 0.25 mL加都氏试剂至4 mL,充分混匀,放置 

10 min,于540 nm处以对照管作空白,分别测定各 

管光密度值,计算样品管半数溶血值(HC 。),HC 。 

(样品的吸光度值/SRBC半数溶血时的吸光度 

值)x稀释倍数。 

1.2.4对小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活 

性影响:取体重为18~22 g的雄性BALB/c小鼠36 

只,按体重随机分为6组,即空白对照组、HS低剂组 

(1.0 g/kg HS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH低剂 

组(1.0 g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和CS 

组(1.0 g/kg CS),每组6只,连续给药7 d后,进行 

脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性测定。 

1.2.4.1 脾淋巴细胞增殖反应:小鼠无菌取脾于培 

养基中,捣碎,使细胞分散均匀,过滤,离心,去上 

清,培养液洗涤2次。脾细胞制成10 x 10。个/mL, 

布板:96孔板每孔加细胞200 L,每一样重复4孔, 

同时设立空白对照。样品孔加ConA2.5 Ixg/mL或 

LPS5.0 Ixg/mL,对照孔不加,37℃5%CO,培养箱中 

培养72 h。加入MTT 10 L,继续培养4 h,弃上清 

液,加入二甲基亚砜150 IxL,充分振荡,于570 nm 

测OD值。计算刺激指数:刺激指数=加ConA或 

LPS细胞孔的平均OD值÷对照孑L的平均OD值。 

1.2.4.2 NK细胞活性检测:取YAC一1靶细胞和效 

应细胞各100 L(效靶比50:1),加入96孔培养板 

中;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 

100 L,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各 

100 IxL;设三个复孔,于37℃、5%CO2培养箱中培 

养4 h,然后将96孔培养板以1500 r/min离心5 

min,每孔吸取上清100 IxL置平底96孔培养板中, 

同时加入LDH基质液100 IxL,反应3 min,每孔加入 

1 mol/L的HC1 30lxL,在酶标仪490 nm处测定光密 

度值(OD)。NK细胞活性(NK cell activity,%)= 

(OD 一(ODS-ODE))/ODT X 100%,ODT:靶细胞空 

白光密度值,OD :样品光密度值,OD :效应细胞空 

白光密度值。 

1.2.5 统计学分析:结果以x±s表示,使用 

SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析。 

2 结果 

2.1 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠体内碳粒 

廓清功能影响 

由表1可见,与模型对照组比较,给予3.0 g/kg 

中国被毛孢、3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉和1.0 g/kg冬 

虫夏草后,小鼠碳粒吞噬指数均显著升高(P< 

0.05);而1.0 g/kg中国被毛孢和1.0 g/kg蝙蝠蛾 

拟青霉有升高小鼠碳粒吞噬指数的趋势,但无显著 

差异(P>0.05)。 

表1 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠体内碳 

粒廓清功能影响(i± ,n=10) 

Tab.1 The effects in carbon clearance function by HS 

and PH in mice(i± ,n=10) 

组 ̄/Groups给药剂量/Drugs吞噬指数/Phagocytic index 

注:与正常对照组比较, P<0.05,“P<0.01;与模型对照组 

比较, P<0.05, P<0.01 

Note:compared withnormal control group, P<0.05, P< 

0.01;compared with model control group, P<0.05,” P 

<0.O1 

2.2 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对二硝基氟苯诱 

导小鼠迟发型变态反应影响 

由表2可见,与正常对照组比较,模型对照组小 

鼠经二硝基氟苯(DNFB)诱导后,耳廓明显肿胀和 

脾脏显著增大(P<0.01),胸腺略有增大,但无显著 

性差异(P>0.05)。给予不同剂量的中国被毛孢 

和蝙蝠蛾拟青霉后均具有不同程度的抑制小鼠耳 

廓肿胀、脾脏增大,与模型对照组比较,1.5 g/kg中 

国被毛孢的小鼠耳廓肿胀显著降低(P<0.01),0.5 

g/kg中国被毛孢、0.5—1.5 g/kg蝙蝠蛾拟青霉和 

0.5 g/kg冬虫夏草对小鼠耳廓肿胀度均明显降低 

(P<0.05);1.5 g/kg中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和 

0.5 g/kg冬虫夏草能明显抑制脾脏增大的作用(P 

<0.05),1.5 g/kg中国被毛孢高和0.5 g/kg冬虫 

夏草能显著抑制胸腺增大的作用(P<0.01,P< 

0.05)。 

中国比较医学杂志2012年9月第22卷第9期 Chin J Comp Med,September 2012,Vo1.22.No.9 19 

表2 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对DNFB诱导小鼠迟发型变态反应影响(i 4-s,/7,=10) 

Tab.2 The effects in DNFB—induced delayed type hypersensitivity by HS and PH in mice( ±s,n=10) 

注:与正常对照组比较, P<0.05,“P<0.01;与模型对照组比较, P<0.05,”P<0.O1 

Note:compared with normal control group,△P<005,AAP<0

01;compared with model control group, P<0.05, .P<0.01 

..

2.3 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对SRBC致小鼠 

2.4 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠脾淋巴细 

胞增殖反应和NK细胞活性影响 

溶血素抗体生成影响 

由表3可见,与正常对照组比较,模型对照组的 

由表4可见,与空白对照组比较,中国被毛孢、 

小鼠半数溶血值明显升高(P<0.01);与模型对照 

组比较,3.0 g/kg中国被毛孢、1~3.0 g/kg蝙蝠蛾 

拟青霉和1.0 g/kg冬虫夏草均能显著升高小鼠的 

蝙蝠蛾拟青霉高剂量(3.0 g/kg)组和拟青霉低(1.0 

g/kg)剂量、冬虫夏草组均能显著提高T淋巴细胞 

增殖作用(P<0.01),中国被毛孢低剂量组也能显 

著提高T淋巴细胞增殖作用(P<0.05),但作用明 

显低于拟青霉低剂组(P<0.05);中国被毛孢、拟青 

半数溶血值(P<0.01),1.0 g/kg中国被毛孢对 

SRBC免疫小鼠的半数溶血值有明显升高作用(P< 

0.05)。 

表3 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对SRBC致 

小鼠溶血素抗体生成影响(露4-s,t=10)I 

Tab.3 The effects in SRBC-induced hemolysin antibody by 

霉、冬虫夏草低剂量组还能促进B淋巴细胞增殖作 

用,而中国被毛孢低剂量组无显著作用。与正常对 

照组比较,被毛孢高剂量组(3.0 g/kg)和低剂量 

(1.0 g/kg)以及冬虫夏草组均能显著性提高NK细 

胞活性(P<0.05),被毛孢低剂量(1.0 g/kg)提高 

HS and PH in mice( ±s,n=10) 

NK细胞活性的作用明显强于蝙蝠蛾拟青霉低剂量 

(1.0 g/kg),蝙蝠蛾拟青霉无论高、低剂量组对NK 

细胞活性均无显著性差异。 

3 讨论 

中国被毛孢菌粉和蝙蝠蛾拟青酶已有很多文 

注:与正常对照组比较, P<0.05,“P<0.O1;与模型对照组 

比较, P<0.05,”P<0.01. 

Note:compared with normal control group, P<0.05, P< 

0.01;compared with model control group, 

<0.01. 

献报道均有免疫调节功能,其增强或抑制作用取决 

于机体的生理状态,即炎症迹象的程度,在无炎症 

迹象时,冬虫夏草促进DCs向Thl型免疫,反过来, 

P<0.05,”P 

表4 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性影响( 4-s, =6) 

Tab.4 The effects in Splenocyte proliferation and NK cell activity by HS and PH in mice(面4-s,n=6) 

注:与空白对照组比较, P<0.05,”P<0.01;与HS低剂组比较, P<0.05 

Note:compared withblank control group, P<0.05,”P<0.O1;compared with model control group, P<0.05 

20 中国比较医学杂志2012年9月第22卷第9期Chin J Comp Med,September 2012,Vo1.22.No.9 

就抑制Thl型超敏反应,在一定程度上体现了中医 

药对机体调控作用的特色 。本文通过免疫药效 

强作用蝙蝠蛾拟青霉略强于中国被毛孢。 

参考文献: 

蒋毅,姚一建.冬虫夏草无性型研究概况[J].菌物系统, 

2003,22(1)161—176. 

功能评价体系对中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉一同 

进行免疫调节作用研究,观察两者是否具有差异。 

实验结果显示,中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和 

冬虫夏草均具有免疫调节作用,但两者在作用程强 

和作用靶向性各有倾向。在免疫增强方面,中国被 

赵锦,王宁,陈月琴等.冬虫夏草无性型的分子鉴别.中山大 

学学报(自然科学版)1999.38(1):121. 

王宁,陈月琴,章卫民等.虫草属多元起源的分子生物学证 

据.中山大学学报(自然科学版).2000,39(14):70. 

魏鑫丽,印象初,郭英兰等.冬虫夏草及其相关类群的分子系 

统学分析.菌物学报.2006,25(2):192. 

毛孢和蝙蝠蛾拟青霉均可显著提高小鼠吞噬指数 

和半数溶血值;同时也均能促进T、B淋巴细胞增殖 

能力,但蝙蝠蛾拟青霉作用要强于中国被毛孢;中 

国被毛孢还能显著提高NK细胞活性,而蝙蝠蛾拟 

青霉在本研究中未发现。在免疫抑制方面,中国被 

杨金玲,肖薇,何惠霞,等.蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草关系的 

分子系统学研究[J].药学学报,2008,43(4):421—426. 

徐孝平,王辉,陈民利,等.盐酸奥芬米洛对二硝基氟苯诱导 

小鼠迟发型变态反应的影响[J].浙江中医药大学学报, 

2006,30(6):617. 

毛孢除能抑制小鼠耳廓肿胀程度外,还能抑制小鼠 

脾脏和胸腺增大,而蝙蝠蛾拟青酶对胸腺增大无作 

用,中国被毛孢免疫抑制作用要强于蝙蝠蛾拟青霉。 

因此,通过检测中国被毛孢菌粉和蝙蝠蛾拟青霉 

菌粉对先天性免疫系统NK活性、吞噬指数的影响及 

i i i 

王辉,林琳,陈民利,等.盐酸奥芬米洛对小鼠细胞免疫功能 

的影响[J].实验动物与比较医学,2008,28(3):177. 

寿旗扬,傅惠英,陈方明,等.中国被毛孢发酵物对NOD小鼠1型 

糖尿病的预防作用[J].中草药.2010,41(8):1311—1315. 

Li CY,Chiang CS,Tsai mL,et a1.Two—sided effect of Cordyceps 

9 

 

对适应性免疫系统细胞免疫、体液免疫的影响,结果 

i j i

l 2 3 4 5 6 7 8 

表明中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉均具有免疫调节作 

sinensis on dendritic cells in different physiological stages[J]. 

Journal of Leukocyte Biology.2009,85(6):987—995. 

用,但中国被毛孢免疫抑制作用及增强天然免疫系统 

作用要强于蝙蝠蛾拟青霉,而对适应性性免疫系统增 

(上接第16页) 

][一4 一 一~][~一5 ~一~一~一 一][一6 一~ 一][~一7 ~一

[修回日期]2012-08 25 

提高,仅使造血干细胞数量增加,而不能增强其干 

细胞功能,生成淋巴细胞的能力降低,所以,老龄小 

鼠B淋巴细胞及T减少 ’ 。本研究发现随年龄增 

长,Cramp基因敲除后,骨髓长期造血干细胞(LT— 

HSC)减少,而骨髓多潜能造血祖细胞(MPP—HSC) 

增多;同时,骨髓中前体B淋巴细胞和未成熟B淋 

巴细胞减少,而成熟B淋巴细胞增多。这说明 

Cramp基因在骨髓造血干细胞及B淋巴细胞发育及 

衰老中具有重要作用,其作用机制有待进一步深入 

研究。 

参考文献 

[1] 

[2] 

[3] 

[修回日期]2012-08—25 

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