2024年4月2日发(作者：晏丝微)
Western Blotting试验步骤
一， 组织蛋白提取
1. 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管
中，充分混合。
注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF
为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。
2. 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀
将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA
裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/
匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。
注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，
再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。
3. 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至
200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western
和免疫印迹等操作。
二， 提取液中总蛋白的测定
用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。
1.
配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积
Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温
24小时内温度。
注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔，
2. 稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升
1 / 8
（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按
0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS
补足至20ul。
3. 稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加
稀释好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小
量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品
点落在标准线1/2以后。
4. 在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用
酶标仪测定A
562nm，
使用温箱孵育时，
根据标准曲线计算出蛋白浓度。
应注意防止因水分蒸发影响检测结果。
注：1）标准曲线布板：（单位：微升）
试剂/孔
1 2 3 4
编号
5
8
12
200
6
12
8
200
7
16
4
200
8
20
0
200
标准品 0
PBS 20
2
18
200
4
16
200
6
14
200 工作液 200
样品蛋白布板：
试剂/
1
编号
样品
PBS
工作液
2 3 4 5 6 7 8 9
2倍稀释 4倍稀释 10倍稀释
9
11
9
11
9
11
4
16
4
16
4
16
2
18
2
18
2
18
200 200 200 200 200 200 200 200 200
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2024年4月2日发(作者：晏丝微)
Western Blotting试验步骤
一， 组织蛋白提取
1. 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管
中，充分混合。
注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF
为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。
2. 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀
将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA
裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/
匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。
注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，
再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。
3. 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至
200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western
和免疫印迹等操作。
二， 提取液中总蛋白的测定
用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。
1.
配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积
Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温
24小时内温度。
注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔，
2. 稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升
1 / 8
（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按
0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS
补足至20ul。
3. 稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加
稀释好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小
量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品
点落在标准线1/2以后。
4. 在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用
酶标仪测定A
562nm，
使用温箱孵育时，
根据标准曲线计算出蛋白浓度。
应注意防止因水分蒸发影响检测结果。
注：1）标准曲线布板：（单位：微升）
试剂/孔
1 2 3 4
编号
5
8
12
200
6
12
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7
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200
8
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0
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标准品 0
PBS 20
2
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200 工作液 200
样品蛋白布板：
试剂/
1
编号
样品
PBS
工作液
2 3 4 5 6 7 8 9
2倍稀释 4倍稀释 10倍稀释
9
11
9
11
9
11
4
16
4
16
4
16
2
18
2
18
2
18
200 200 200 200 200 200 200 200 200
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