2024年4月13日发(作者：斋代芹)
气候变化对土壤微生物多样性及其功能的影响
刘远;张辉;熊明华;李峰;张旭辉;潘根兴;王光利
【摘 要】以同时模拟未来大气 CO2浓度和温度升高的田间开放式气候变化平台为
依托,研究 CO2浓度升高(CE)、升温(WA)以及两者同时升高(CW)对麦田土壤基础
呼吸和微生物丰度、群落结构的影响.结果表明：CE对土壤基础呼吸没有影响,但是
WA显著提高了土壤基础呼吸,在抽穗和成熟期分别增加了51.6%和38.5%.在分蘖
期,土壤细菌和真菌丰度没有显著变化；而在抽穗和成熟期,CW和WA处理显著降
低了真菌丰度,降低幅度分别达到32.1%~50.2%和32.0%~37.4%.通过对T-RFLP
数据分析发现,CE、CW和WA处理对麦田土壤真菌和细菌群落结构没有显著影响,
但是在一定程度上改变了古菌群落结构.与对照相比,CE处理真菌多样性提高了
7.1%~8.2%,CW和WA处理真菌多样性分别降低了5.3%~13.5%和
22.1%~33.6%；在分蘖和抽穗期,CE、CW和WA处理土壤细菌多样性比对照显
著提高.%A climate change experiment was conducted to examine the
effect of simulated elevated atmospheric carbon dioxide (CO2) and
temperature simultaneously on soil basal respiration and microbial
community structure and abundance in an open field. Field treatments
included the atmospheric CO2 enrichment (CE), warming of canopy air
(WA), interactive CO2 enrichment and warming (CW) and the ambient
control (CK) plots in the experiment platform. The results shown that CE
had no effect on soil basal respiration, when soil basal respiration under
WA treatment was increased by 51.6%and 38.5%at the heading and
ripening stages, respectively. At the tillering stage, no change in the
abundance of bacteria or fungi was observed, however abundances of
fungi were decreased by 32.1%~50.2%and 32.0%~37.4%at the heading
and ripening stages, respectively. The analysis of T-RFLP profiles showed
that CE, CW and WA treatment had no obvious effect on fungal and
bacterial community structure, but changed the archaeal community
structure in a certain extent. Comparing to the control, the diversity of
fungi was increased by 7.1%~8.2%during the wheat growth period but
decreased by 5.3%~13.5% and 22.1%~33.6% under CW and WA
treatments, respectively; CE, CW and WA treatment increased bacterial
diversity in wheat tillering and heading stages.
【期刊名称】《中国环境科学》
【年(卷),期】2016(036)012
【总页数】7页(P3793-3799)
【关键词】CO2浓度升高;温度升高;冬小麦;土壤微生物
【作 者】刘远;张辉;熊明华;李峰;张旭辉;潘根兴;王光利
【作者单位】淮北师范大学生命科学学院，安徽 淮北235000;淮北师范大学生命
科学学院，安徽 淮北235000;淮北师范大学生命科学学院，安徽 淮北235000;淮
北师范大学生命科学学院，安徽 淮北235000;南京农业大学资源与环境科学学院，
江苏 南京 210095;南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095;淮北师
范大学生命科学学院，安徽 淮北235000
【正文语种】中 文
【中图分类】X703.5
以气候变暖为主要特征的全球气候变化已经日益对全球自然环境和社会经济活动产
生重大影响,成为全球可持续发展的研究挑战[1].通过对净初级生产力(NPP)变化研
究结果表明,虽然升温、CO2浓度升高等有利于植物生长,但降水量的变化以及极端
气候事件的增加,可能会导致湿地在未来气候变化情境下面临较高风险[2].大气
CO2浓度和温度升高将通过光合作用影响到植物的生理生长过程及陆地生态系统
的结构和功能,而作为对陆地生态系统的反馈,土壤微生物也将发生变化[3-4].
土壤微生物在生态系统中参与生物化学循环、土壤有机质的分解和土壤结构的形成
等过程,对环境因子干扰比较敏感[5].综合国内外相关研究发现,未来降水的变化以及
氮沉降增加势必对植物生长和土壤代谢产生影响,进而显著影响土壤氮循化过程的
微生物和酶活性[6].由于土壤中CO2浓度大约为大气中的 10～50倍,因此大气
CO2浓度升高对土壤微生物的影响主要是通过植物生长而间接产生的[7].利用中国
扬州开放式空气 CO2浓度升高(FACE)平台,研究结果表明,在常氮施肥中,大气CO2
浓度升高增加土壤微生物生物量碳、脱氢酶活性以及微生物多样性[8].大气 CO2
浓度升高促进植物生物量、根分泌物和根际沉积物而间接地影响土壤微生物群落
[9].利用OTC开顶箱研究发现CO2浓度升高显著提高了长白赤松和红松土壤细菌
数量[10].在短时间FACE运行期间,CO2浓度升高对土壤细菌数量有一定的影响.对
真菌数量影响不大[11].而一些和植物生长密切相关的微生物生理类群,如菌根真菌、
硝化细菌的数量也有所增加[12-13].温度升高通过影响凋落物的数量和质量、土壤
养分有效性以及微生物的生长环境,从而改变土壤微生物群落的结构和功能[14].通
过对美国大平原地区的研究,发现模拟增温 1.8℃明显地改变了微生物群落结构,温
度升高明显提高了土壤真菌的活性,增加了其丰富度[15].但是也有学者认为,温度升
高并不能改变土壤细菌和真菌的丰富度[16].
由于CO2浓度和温度升高的程度、土壤特性和植物类型的不同,CO2浓度升高和
升温对土壤微生物量和根分泌物的影响也各有不同,因此,土壤微生物对不同气候变
化因子的响应也存在差异[17-18].大气 CO2浓度和温度的上升对植物的影响将改
变陆地生态系统的结构和功能,而这种变化很大程度上受到土壤微生物的调控,因而
只有全面了解土壤微生物的变化,才能弄清陆地生态系统对大气CO2浓度升高和升
温的响应和反馈.
目前,国内外关于土壤微生物对大气CO2浓度和温度的上升地响应研究多关于草地
和森林生态系统,对于农田生态系统的研究相对较少.本课题组依托同步模拟大气
CO2浓度升高和温度升高平台,以我国太湖地区稻麦轮作系统为研究对象.在水稻生
长季,我们研究发现土壤细菌、真菌和古菌的基因拷贝数和群落多样性对大气CO2
浓度升高和升温的响应不同;其中,CO2浓度的促进作用较为明显[19].由于水分管理
方式的不同,小麦和水稻季土壤微生物群落对未来气候变化的响应可能存在差异.为
此,本试验以小麦土壤作为研究对象,能较为全面地认识大气CO2浓度和温度升高
对不同农田土壤微生物群落和功能的影响,为阐明未来气候变化条件下农田土壤微
生物的变化提供科学依据.
1.1 试验地概况与试验设计
该气候变化试验点位于江苏省常熟市古里镇(31°30′N,120°33′E).该地区属于亚热
带季风气候,四季分明,降雨量充沛,光照充足,是我国著名的稻米产地.该地区年平均
温度 16℃,年平均降水量大于 1100mm,年日照时间大于 2000h,年无霜期大于
200d.主要种植方式为小麦-水稻轮作.每年11月初种植小麦,次年6月处收割,7～
10月为水稻季.该地区土壤类型为太湖地区典型的乌栅土,表层土壤(0～15cm)pH
为 7.0,容重为1.2g/cm3,有机碳含量19.2g/kg,总氮含量1.6g/kg,速效磷含量
12.3g/kg,速效钾含量93.4g/kg.
本试验平台为模拟未来近地表大气CO2浓度升高(500µmol/mol)和温度升高(2℃)
对稻麦轮作农业系统的影响.平台建于2010年,共设置4个处理:大气 CO2浓度升
高处理(CE);温度升高处理(WA);大气 CO2浓度和温度同时升高处理(CW),以及正常
CO2浓度和温度的对照处理(CK).每个处理各设3个重复,共计12个处理小区,每个
试验圈为八边形构造,面积约 45m2.为了避免设备干扰的影响,所有处理圈从外观上
保持一致,CO2处理圈和对照圈中均安装了升温圈中的红外灯罩,升温处理圈安装了
CO2释放管.平台设计示意图如图1所示.
1.2 土壤样品的采集
小麦供试品种为扬麦 14号,2012年在水稻收获后即种植小麦.选取了小麦季3个生
育期进行采样:3月5日分蘖期(S1)、4月24日抽穗期(S2)和5月23日成熟期(S3).
采集0～15cm的耕层根际土壤.根据不同生育期植株根系发育情况不同,随机选择
3～5株植株,采用抖根法收集根围0～2mm范围内土壤作为根际土壤,每个圈内根
际土壤充分混合.混合新鲜土样去除碎石、秸秆及动植物残体后过2mm筛,过筛后
的混合样品被装入无菌自封袋与低温带回实验室.将样品分为 2份:第一份存储于4℃
冰箱,以测定土壤基础呼吸;第二份存储于-20℃,以供土壤总DNA提取.
1.3 土壤基础呼吸的测定
在小麦的不同生育期,分别从每个试验圈称取一份20g鲜土放入120mL培养瓶中,
土壤含水量调节为田间持水量(WHC)的60%,用硅胶塞密封,25℃恒温好氧培养 7d.
培养期间,分别于培养开始后2、6、12、24、48、60、72、96、120、144和
168h采集 CO2气体,每次采样后充空气3min并调节含水量,然后继续培养直到培
养结束.所采集CO2样品采用Agilent公司GC-4890D气相色谱仪测定,仪器采用
FID检测器,工作条件:柱温 35℃,气体流速分别是载气(N2)30mL/min,
H245mL/min,空气 400mL/min.生成的 CO2用CO2-Cμg/g来表示.
1.4 土壤微生物丰度的测定
采用MOBIO公司的土壤DNA快速提取试剂盒(PowerSoil™ DNA Isolation
Kit,Mo Bio Laboratories Inc.,CA)提取土壤微生物基因组DNA,具体步骤按照说明
书进行.
土壤细菌16S rRNA(F338/R518)、古菌16S rRNA(519f/915r)和真菌 18S
rRNA(NS1/FungR)基因拷贝数采用 qPCR技术进行测定.土壤提取的DNA浓度用
NanoDrop ND-1000微量分光光度计测定,然后将 DNA稀释到 15ng/μL.实验在
ABI 7500定量PCR仪上进行,采用25µL反应体系:12.5µL扩增酶混合物 SYBR
premix EX TaqTM,9.5µL无菌超纯水,10µM 正反向引物各1µL,DNA模板
1µL(15ng).每次扩增均做溶解曲线分析以确保荧光信号来自于目标PCR产物而非
引物二聚体或其它杂质.并采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进一步验证PCR产物的片段
大小是否正确.本试验用于制作标准曲线的质粒的拷贝数从103～109,扩增效率在
98%和109%之间,R2值大于0.98.结果以每g干土重的基因拷贝数表示.
1.5 土壤微生物群落多样性的测定
用具有 6-FAM 标记的引物扩增细菌 16S rRNA(27F/1492R)、古菌 16S rRNA
(A20f/ AR927r)和真菌 ITS(ITS1F/ITS4R)区片段.扩增体系为50uL:25µL扩增反应
液,10µmol/L正反向引物各2µL,20µL无菌水及1µL DNA模板.每个样品按上述同
样条件各扩增3管,混合后的扩增产物用 PCR片段纯化试剂盒(PCR Fragment
Purification Kit,Takara)纯化.将纯化后的产物用NanoDrop ND-1000微光分光
光度计测定浓度.
细菌和真菌的纯化产物用HhaI(Takara)酶切消化,古菌的纯化产物用 AfaI(Takara)
酶切消化.酶切反应体系:10×Buffer 2µL,DNA 200ng,0.1% BSA 2µL,无菌水补足
20µL.酶切条件:37℃消化5h,然后65℃热处理15min终止酶活.将酶切产物进行琼
脂糖凝胶电泳,检测酶切是否完全.酶切产物送上海生工测序,末端带荧光标记的片段
能被检测到.T-RFLP图谱中选择的限制性片段(T-RF)范围在50～550bp,在平行试
验的图谱中重复出现的峰纳入统计分析,并去除丰度 ＜1%的 T-RFs.每个 T-RF的相
对丰度为其峰高占总峰高的比值,T-RFs片段大小± 1bp被认为是同一片段.根据图
谱中T-RFs的数目及其相对丰度进行主成分分析和多样性指数计算.
1.6 数据处理
所有结果表示为平均值±标准差.用方差分析(ANOVA)检验同一采样时期处理之间
差异是否显著(Duncan-test).重复测量方差分析和 TRFLP图谱主成分分析采用
SPSS 20.0统计软件和Minitab 15处理.
2.1 大气CO2浓度和温度升高对麦田土壤基础呼吸的影响
从图 2可以看出,气候变化对小麦季土壤基础呼吸的影响随生育期而变化.在小麦分
蘖期,气候变化处理对土壤基础呼吸没有影响.而在抽穗和成熟期,气候变化处理的土
壤基础呼吸与对照相比提高,其中WA处理的升高幅度达到显著水平(P＜0.05),分别
增加了51.6%和38.5%.
2.2 大气CO2浓度和温度升高对麦田土壤微生物丰度的影响
小麦季土壤细菌、真菌和古菌基因拷贝数如图3所示.细菌16S rRNA和真菌18S
rRNA基因拷贝数范围介于 3.96×1010～1.02×1011和 2.12× 107～
1.06×108copies/g.不同生育期的细菌和真菌丰度对大气CO2浓度升高和升温的
响应不同.在分蘖期,不同处理的土壤细菌和真菌丰度没有显著变化;而在抽穗和成熟
期,CW和WA处理显著降低了真菌丰度,降低幅度分别达到 32.1%～50.2%和
32.0%～37.4%.WA处理降低了成熟期的细菌丰度.相对于土壤细菌和真菌,古菌数
量在小麦季相对稳定,拷贝数介于 3.02×108～6.36× 108copies/g,CE和CW处理
的小麦季土壤古菌丰度与对照相比提高,而WA处理的古菌丰度没有显著变化.
2.3 大气CO2浓度和温度升高对麦田土壤微生物群落结构的影响
利用T-RFLP技术对小麦季土壤真菌、细菌和古菌群落结构进行分析,其多样性结
果如表 1所示,小麦季土壤真菌、细菌和古菌多样性对大气CO2浓度升高和升温的
响应有所不同.与对照相比,CE处理显著提高了小麦季土壤真菌多样性,CW和WA
处理降低了真菌多样性;CE、CW和WA处理提高了分蘖和抽穗期土壤细菌多样性,
对成熟期细菌多样性没有显著影响;而古菌多样性在小麦不同生育期对大气CO2浓
度升高和升温有不同的响应.
T-RFLP数据的主成分分析(PCA)结果如图4,土壤真菌和细菌群落在小麦季各个生
育期分别聚在一起,不同生育期的微生物群落结构差异明显,而古菌群落结构在不同
生育期的变异不明显.在同一采样时期,气候变化处理的真菌和细菌群落结构与对照
相比没有明显分开,但是在一定程度上改变了古菌群落结构.
土壤是陆地生态系统的主体,决定着陆地生态系统的主要功能.大部分研究认为,大气
CO2浓度升高不仅增加陆地生态系统的初级生产力,而且促进植物光合作用和根系
的生长,使根系分泌物和沉降物数量增多[20].导致植物向根系输出的碳增多,但是这
并不能简单地认为是陆地碳库增加的标志.大气CO2浓度升高对土壤的影响是复杂
多变的,研究表明,CO2浓度升高不仅影响植物向土壤碳库的输入[21].同时也可能会
影响根系的形态和化学成分[22]、土壤微生物丰度和群落组成,从而影响土壤呼吸
[23],导致土壤碳库输出.
土壤呼吸主要由土壤微生物代谢活动所引起,研究表明大约85%的土壤CO2来自
于土壤微生物的作用[24].大气CO2浓度升高对土壤微生物呼吸呈现增加、降低或
没有显著影响3种不同的变化趋势.一般认为,大气CO2浓度升高通过增强植物光
合产物和根系分泌物,使微生物代谢底物增加,进而增强土壤微生物的呼吸强度[23].
在本试验中,我们发现温度升高增强了麦田土壤的基础呼吸.温度升高能够改变植物
群落多样性和植物的生长速率[3],促进植物生长,使凋落物、根系分泌物和细根周转
率提高,土壤碳输入增加,从而影响到土壤微生物群落的数量和功能,进而提高土壤微
生物呼吸.
大气 CO2浓度升高和升温通过影响植物生长和土壤性质来影响土壤微生物的数量、
群落结构和活性,而这些变化又可通过矿化作用、有机质分解和凋落物分解等土壤
生化过程,来增强或弱化大气 CO2浓度升高和升温带给陆地生态系统的影响[25-
26].大气CO2浓度升高通过改变微生物功能类群的结构、根际细菌的数量或是增
加菌根真菌的侵染率来改变土壤微生物的群落结构.贾夏等[10]利用OTC开顶箱研
究发现CO2浓度升高对长白赤松和红松根际土壤细菌有显著地促进作用,这可能是
由于土壤中根系分泌物和凋落物的增加,使土壤中微生物可利用碳增加,因而使其数
量提高.在短时间FACE条件下,大气CO2浓度升高对细菌生长有一定的影响,但是
对真菌生长没有明显影响.目前很多研究表明,土壤细菌和真菌丰度在大气 CO2浓
度升高条件下没有变化
[27-28].Hayden[29]利用多因子气候变化草地平台研究发现,CO2浓度升高、升温
和两者同时升高对细菌和真菌丰度没有影响.本试验结果与其他学者有相似的发现,
大气CO2浓度升高对土壤细菌和真菌丰度没有明显地影响.一般认为,植物利用光
合作用固定的产物输送到地上及地下部分后,再以凋落物、根系分泌物的形式进入
到土壤中.为土壤微生物提供C源和能源,而这些有机物质的成分和数量由于 CO2
浓度的升高而发生变化,进而影响土壤细菌和真菌的生长[23-24].目前,CO2浓度升
高对微生物的影响都是短时间处理的研究结果,而且处理方式及供试条件的不稳定
性增加了研究结果的不确定性,但是确定的是CO2浓度升高对土壤微生物产生了一
定的影响.
Papatheodorou[30]在文章中指出,与土壤微生物量和微生物活性相比,土壤微生物
群落结构对升温的响应更为敏感,温度季节性变化对土壤微生物群落具有显著地影
响,升温通过影响植物凋落物的组分和养分的有效性,为真菌提供较适合的生长环境,
因此,温度升高可能会有利于真菌生长而抑制细菌生长,从而改变了微生物群落结构
[31].对于旱地作物,温度升高还会改变土壤温度和水分状况,这可能会进一步改变土
壤微生物群落多样性.在本研究中,我们发现升温显著抑制了小麦晚期土壤真菌和细
菌的生长.在美国大平原地区研究发现,气温上升提高土壤真菌的优势,进而导致群落
结构发生改变[15].然而,升温有时对土壤真菌和细菌丰富度没有影响[16].因此,有学
者认为,微生物的温度适应范围较广,而升温处理的气温升高幅度相对较小,其对微生
物的影响可能会被自身的调节所消失,因而对微生物群落不会产生很大的影响[25].
由于土壤-植物-微生物之间的复杂性,升温对土壤微生物群落数量和组成的影响还
存在很大的不确定性,因此,在这方面的研究有待于进一步加强.
4.1 CE处理对小麦土壤基础呼吸没有影响,但是 WA处理土壤基础呼吸在抽穗和成
熟期分别增加了 51.6%和 38.5%.在分蘖期,土壤真菌和细菌丰度没有变化,而在抽
穗和成熟期,升温显著降低了真菌丰度,降低幅度分别达到 32.1%～50.2%和
32.0%～37.4%.
4.2 大气CO2浓度和温度升高对土壤真菌和细菌群落结构没有明显影响,但是在一
定程度上改变了古菌群落结构.与对照相比,CE处理显著提高了真菌多样性(7.1%～
8.2%),CW和WA处理真菌多样性分别降低了 5.3%～13.5%和 22.1%～33.6%;在
分蘖和抽穗期,CE、CW和WA处理提高了土壤细菌多样性.
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2024年4月13日发(作者：斋代芹)
气候变化对土壤微生物多样性及其功能的影响
刘远;张辉;熊明华;李峰;张旭辉;潘根兴;王光利
【摘 要】以同时模拟未来大气 CO2浓度和温度升高的田间开放式气候变化平台为
依托,研究 CO2浓度升高(CE)、升温(WA)以及两者同时升高(CW)对麦田土壤基础
呼吸和微生物丰度、群落结构的影响.结果表明：CE对土壤基础呼吸没有影响,但是
WA显著提高了土壤基础呼吸,在抽穗和成熟期分别增加了51.6%和38.5%.在分蘖
期,土壤细菌和真菌丰度没有显著变化；而在抽穗和成熟期,CW和WA处理显著降
低了真菌丰度,降低幅度分别达到32.1%~50.2%和32.0%~37.4%.通过对T-RFLP
数据分析发现,CE、CW和WA处理对麦田土壤真菌和细菌群落结构没有显著影响,
但是在一定程度上改变了古菌群落结构.与对照相比,CE处理真菌多样性提高了
7.1%~8.2%,CW和WA处理真菌多样性分别降低了5.3%~13.5%和
22.1%~33.6%；在分蘖和抽穗期,CE、CW和WA处理土壤细菌多样性比对照显
著提高.%A climate change experiment was conducted to examine the
effect of simulated elevated atmospheric carbon dioxide (CO2) and
temperature simultaneously on soil basal respiration and microbial
community structure and abundance in an open field. Field treatments
included the atmospheric CO2 enrichment (CE), warming of canopy air
(WA), interactive CO2 enrichment and warming (CW) and the ambient
control (CK) plots in the experiment platform. The results shown that CE
had no effect on soil basal respiration, when soil basal respiration under
WA treatment was increased by 51.6%and 38.5%at the heading and
ripening stages, respectively. At the tillering stage, no change in the
abundance of bacteria or fungi was observed, however abundances of
fungi were decreased by 32.1%~50.2%and 32.0%~37.4%at the heading
and ripening stages, respectively. The analysis of T-RFLP profiles showed
that CE, CW and WA treatment had no obvious effect on fungal and
bacterial community structure, but changed the archaeal community
structure in a certain extent. Comparing to the control, the diversity of
fungi was increased by 7.1%~8.2%during the wheat growth period but
decreased by 5.3%~13.5% and 22.1%~33.6% under CW and WA
treatments, respectively; CE, CW and WA treatment increased bacterial
diversity in wheat tillering and heading stages.
【期刊名称】《中国环境科学》
【年(卷),期】2016(036)012
【总页数】7页(P3793-3799)
【关键词】CO2浓度升高;温度升高;冬小麦;土壤微生物
【作 者】刘远;张辉;熊明华;李峰;张旭辉;潘根兴;王光利
【作者单位】淮北师范大学生命科学学院，安徽 淮北235000;淮北师范大学生命
科学学院，安徽 淮北235000;淮北师范大学生命科学学院，安徽 淮北235000;淮
北师范大学生命科学学院，安徽 淮北235000;南京农业大学资源与环境科学学院，
江苏 南京 210095;南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095;淮北师
范大学生命科学学院，安徽 淮北235000
【正文语种】中 文
【中图分类】X703.5
以气候变暖为主要特征的全球气候变化已经日益对全球自然环境和社会经济活动产
生重大影响,成为全球可持续发展的研究挑战[1].通过对净初级生产力(NPP)变化研
究结果表明,虽然升温、CO2浓度升高等有利于植物生长,但降水量的变化以及极端
气候事件的增加,可能会导致湿地在未来气候变化情境下面临较高风险[2].大气
CO2浓度和温度升高将通过光合作用影响到植物的生理生长过程及陆地生态系统
的结构和功能,而作为对陆地生态系统的反馈,土壤微生物也将发生变化[3-4].
土壤微生物在生态系统中参与生物化学循环、土壤有机质的分解和土壤结构的形成
等过程,对环境因子干扰比较敏感[5].综合国内外相关研究发现,未来降水的变化以及
氮沉降增加势必对植物生长和土壤代谢产生影响,进而显著影响土壤氮循化过程的
微生物和酶活性[6].由于土壤中CO2浓度大约为大气中的 10～50倍,因此大气
CO2浓度升高对土壤微生物的影响主要是通过植物生长而间接产生的[7].利用中国
扬州开放式空气 CO2浓度升高(FACE)平台,研究结果表明,在常氮施肥中,大气CO2
浓度升高增加土壤微生物生物量碳、脱氢酶活性以及微生物多样性[8].大气 CO2
浓度升高促进植物生物量、根分泌物和根际沉积物而间接地影响土壤微生物群落
[9].利用OTC开顶箱研究发现CO2浓度升高显著提高了长白赤松和红松土壤细菌
数量[10].在短时间FACE运行期间,CO2浓度升高对土壤细菌数量有一定的影响.对
真菌数量影响不大[11].而一些和植物生长密切相关的微生物生理类群,如菌根真菌、
硝化细菌的数量也有所增加[12-13].温度升高通过影响凋落物的数量和质量、土壤
养分有效性以及微生物的生长环境,从而改变土壤微生物群落的结构和功能[14].通
过对美国大平原地区的研究,发现模拟增温 1.8℃明显地改变了微生物群落结构,温
度升高明显提高了土壤真菌的活性,增加了其丰富度[15].但是也有学者认为,温度升
高并不能改变土壤细菌和真菌的丰富度[16].
由于CO2浓度和温度升高的程度、土壤特性和植物类型的不同,CO2浓度升高和
升温对土壤微生物量和根分泌物的影响也各有不同,因此,土壤微生物对不同气候变
化因子的响应也存在差异[17-18].大气 CO2浓度和温度的上升对植物的影响将改
变陆地生态系统的结构和功能,而这种变化很大程度上受到土壤微生物的调控,因而
只有全面了解土壤微生物的变化,才能弄清陆地生态系统对大气CO2浓度升高和升
温的响应和反馈.
目前,国内外关于土壤微生物对大气CO2浓度和温度的上升地响应研究多关于草地
和森林生态系统,对于农田生态系统的研究相对较少.本课题组依托同步模拟大气
CO2浓度升高和温度升高平台,以我国太湖地区稻麦轮作系统为研究对象.在水稻生
长季,我们研究发现土壤细菌、真菌和古菌的基因拷贝数和群落多样性对大气CO2
浓度升高和升温的响应不同;其中,CO2浓度的促进作用较为明显[19].由于水分管理
方式的不同,小麦和水稻季土壤微生物群落对未来气候变化的响应可能存在差异.为
此,本试验以小麦土壤作为研究对象,能较为全面地认识大气CO2浓度和温度升高
对不同农田土壤微生物群落和功能的影响,为阐明未来气候变化条件下农田土壤微
生物的变化提供科学依据.
1.1 试验地概况与试验设计
该气候变化试验点位于江苏省常熟市古里镇(31°30′N,120°33′E).该地区属于亚热
带季风气候,四季分明,降雨量充沛,光照充足,是我国著名的稻米产地.该地区年平均
温度 16℃,年平均降水量大于 1100mm,年日照时间大于 2000h,年无霜期大于
200d.主要种植方式为小麦-水稻轮作.每年11月初种植小麦,次年6月处收割,7～
10月为水稻季.该地区土壤类型为太湖地区典型的乌栅土,表层土壤(0～15cm)pH
为 7.0,容重为1.2g/cm3,有机碳含量19.2g/kg,总氮含量1.6g/kg,速效磷含量
12.3g/kg,速效钾含量93.4g/kg.
本试验平台为模拟未来近地表大气CO2浓度升高(500µmol/mol)和温度升高(2℃)
对稻麦轮作农业系统的影响.平台建于2010年,共设置4个处理:大气 CO2浓度升
高处理(CE);温度升高处理(WA);大气 CO2浓度和温度同时升高处理(CW),以及正常
CO2浓度和温度的对照处理(CK).每个处理各设3个重复,共计12个处理小区,每个
试验圈为八边形构造,面积约 45m2.为了避免设备干扰的影响,所有处理圈从外观上
保持一致,CO2处理圈和对照圈中均安装了升温圈中的红外灯罩,升温处理圈安装了
CO2释放管.平台设计示意图如图1所示.
1.2 土壤样品的采集
小麦供试品种为扬麦 14号,2012年在水稻收获后即种植小麦.选取了小麦季3个生
育期进行采样:3月5日分蘖期(S1)、4月24日抽穗期(S2)和5月23日成熟期(S3).
采集0～15cm的耕层根际土壤.根据不同生育期植株根系发育情况不同,随机选择
3～5株植株,采用抖根法收集根围0～2mm范围内土壤作为根际土壤,每个圈内根
际土壤充分混合.混合新鲜土样去除碎石、秸秆及动植物残体后过2mm筛,过筛后
的混合样品被装入无菌自封袋与低温带回实验室.将样品分为 2份:第一份存储于4℃
冰箱,以测定土壤基础呼吸;第二份存储于-20℃,以供土壤总DNA提取.
1.3 土壤基础呼吸的测定
在小麦的不同生育期,分别从每个试验圈称取一份20g鲜土放入120mL培养瓶中,
土壤含水量调节为田间持水量(WHC)的60%,用硅胶塞密封,25℃恒温好氧培养 7d.
培养期间,分别于培养开始后2、6、12、24、48、60、72、96、120、144和
168h采集 CO2气体,每次采样后充空气3min并调节含水量,然后继续培养直到培
养结束.所采集CO2样品采用Agilent公司GC-4890D气相色谱仪测定,仪器采用
FID检测器,工作条件:柱温 35℃,气体流速分别是载气(N2)30mL/min,
H245mL/min,空气 400mL/min.生成的 CO2用CO2-Cμg/g来表示.
1.4 土壤微生物丰度的测定
采用MOBIO公司的土壤DNA快速提取试剂盒(PowerSoil™ DNA Isolation
Kit,Mo Bio Laboratories Inc.,CA)提取土壤微生物基因组DNA,具体步骤按照说明
书进行.
土壤细菌16S rRNA(F338/R518)、古菌16S rRNA(519f/915r)和真菌 18S
rRNA(NS1/FungR)基因拷贝数采用 qPCR技术进行测定.土壤提取的DNA浓度用
NanoDrop ND-1000微量分光光度计测定,然后将 DNA稀释到 15ng/μL.实验在
ABI 7500定量PCR仪上进行,采用25µL反应体系:12.5µL扩增酶混合物 SYBR
premix EX TaqTM,9.5µL无菌超纯水,10µM 正反向引物各1µL,DNA模板
1µL(15ng).每次扩增均做溶解曲线分析以确保荧光信号来自于目标PCR产物而非
引物二聚体或其它杂质.并采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进一步验证PCR产物的片段
大小是否正确.本试验用于制作标准曲线的质粒的拷贝数从103～109,扩增效率在
98%和109%之间,R2值大于0.98.结果以每g干土重的基因拷贝数表示.
1.5 土壤微生物群落多样性的测定
用具有 6-FAM 标记的引物扩增细菌 16S rRNA(27F/1492R)、古菌 16S rRNA
(A20f/ AR927r)和真菌 ITS(ITS1F/ITS4R)区片段.扩增体系为50uL:25µL扩增反应
液,10µmol/L正反向引物各2µL,20µL无菌水及1µL DNA模板.每个样品按上述同
样条件各扩增3管,混合后的扩增产物用 PCR片段纯化试剂盒(PCR Fragment
Purification Kit,Takara)纯化.将纯化后的产物用NanoDrop ND-1000微光分光
光度计测定浓度.
细菌和真菌的纯化产物用HhaI(Takara)酶切消化,古菌的纯化产物用 AfaI(Takara)
酶切消化.酶切反应体系:10×Buffer 2µL,DNA 200ng,0.1% BSA 2µL,无菌水补足
20µL.酶切条件:37℃消化5h,然后65℃热处理15min终止酶活.将酶切产物进行琼
脂糖凝胶电泳,检测酶切是否完全.酶切产物送上海生工测序,末端带荧光标记的片段
能被检测到.T-RFLP图谱中选择的限制性片段(T-RF)范围在50～550bp,在平行试
验的图谱中重复出现的峰纳入统计分析,并去除丰度 ＜1%的 T-RFs.每个 T-RF的相
对丰度为其峰高占总峰高的比值,T-RFs片段大小± 1bp被认为是同一片段.根据图
谱中T-RFs的数目及其相对丰度进行主成分分析和多样性指数计算.
1.6 数据处理
所有结果表示为平均值±标准差.用方差分析(ANOVA)检验同一采样时期处理之间
差异是否显著(Duncan-test).重复测量方差分析和 TRFLP图谱主成分分析采用
SPSS 20.0统计软件和Minitab 15处理.
2.1 大气CO2浓度和温度升高对麦田土壤基础呼吸的影响
从图 2可以看出,气候变化对小麦季土壤基础呼吸的影响随生育期而变化.在小麦分
蘖期,气候变化处理对土壤基础呼吸没有影响.而在抽穗和成熟期,气候变化处理的土
壤基础呼吸与对照相比提高,其中WA处理的升高幅度达到显著水平(P＜0.05),分别
增加了51.6%和38.5%.
2.2 大气CO2浓度和温度升高对麦田土壤微生物丰度的影响
小麦季土壤细菌、真菌和古菌基因拷贝数如图3所示.细菌16S rRNA和真菌18S
rRNA基因拷贝数范围介于 3.96×1010～1.02×1011和 2.12× 107～
1.06×108copies/g.不同生育期的细菌和真菌丰度对大气CO2浓度升高和升温的
响应不同.在分蘖期,不同处理的土壤细菌和真菌丰度没有显著变化;而在抽穗和成熟
期,CW和WA处理显著降低了真菌丰度,降低幅度分别达到 32.1%～50.2%和
32.0%～37.4%.WA处理降低了成熟期的细菌丰度.相对于土壤细菌和真菌,古菌数
量在小麦季相对稳定,拷贝数介于 3.02×108～6.36× 108copies/g,CE和CW处理
的小麦季土壤古菌丰度与对照相比提高,而WA处理的古菌丰度没有显著变化.
2.3 大气CO2浓度和温度升高对麦田土壤微生物群落结构的影响
利用T-RFLP技术对小麦季土壤真菌、细菌和古菌群落结构进行分析,其多样性结
果如表 1所示,小麦季土壤真菌、细菌和古菌多样性对大气CO2浓度升高和升温的
响应有所不同.与对照相比,CE处理显著提高了小麦季土壤真菌多样性,CW和WA
处理降低了真菌多样性;CE、CW和WA处理提高了分蘖和抽穗期土壤细菌多样性,
对成熟期细菌多样性没有显著影响;而古菌多样性在小麦不同生育期对大气CO2浓
度升高和升温有不同的响应.
T-RFLP数据的主成分分析(PCA)结果如图4,土壤真菌和细菌群落在小麦季各个生
育期分别聚在一起,不同生育期的微生物群落结构差异明显,而古菌群落结构在不同
生育期的变异不明显.在同一采样时期,气候变化处理的真菌和细菌群落结构与对照
相比没有明显分开,但是在一定程度上改变了古菌群落结构.
土壤是陆地生态系统的主体,决定着陆地生态系统的主要功能.大部分研究认为,大气
CO2浓度升高不仅增加陆地生态系统的初级生产力,而且促进植物光合作用和根系
的生长,使根系分泌物和沉降物数量增多[20].导致植物向根系输出的碳增多,但是这
并不能简单地认为是陆地碳库增加的标志.大气CO2浓度升高对土壤的影响是复杂
多变的,研究表明,CO2浓度升高不仅影响植物向土壤碳库的输入[21].同时也可能会
影响根系的形态和化学成分[22]、土壤微生物丰度和群落组成,从而影响土壤呼吸
[23],导致土壤碳库输出.
土壤呼吸主要由土壤微生物代谢活动所引起,研究表明大约85%的土壤CO2来自
于土壤微生物的作用[24].大气CO2浓度升高对土壤微生物呼吸呈现增加、降低或
没有显著影响3种不同的变化趋势.一般认为,大气CO2浓度升高通过增强植物光
合产物和根系分泌物,使微生物代谢底物增加,进而增强土壤微生物的呼吸强度[23].
在本试验中,我们发现温度升高增强了麦田土壤的基础呼吸.温度升高能够改变植物
群落多样性和植物的生长速率[3],促进植物生长,使凋落物、根系分泌物和细根周转
率提高,土壤碳输入增加,从而影响到土壤微生物群落的数量和功能,进而提高土壤微
生物呼吸.
大气 CO2浓度升高和升温通过影响植物生长和土壤性质来影响土壤微生物的数量、
群落结构和活性,而这些变化又可通过矿化作用、有机质分解和凋落物分解等土壤
生化过程,来增强或弱化大气 CO2浓度升高和升温带给陆地生态系统的影响[25-
26].大气CO2浓度升高通过改变微生物功能类群的结构、根际细菌的数量或是增
加菌根真菌的侵染率来改变土壤微生物的群落结构.贾夏等[10]利用OTC开顶箱研
究发现CO2浓度升高对长白赤松和红松根际土壤细菌有显著地促进作用,这可能是
由于土壤中根系分泌物和凋落物的增加,使土壤中微生物可利用碳增加,因而使其数
量提高.在短时间FACE条件下,大气CO2浓度升高对细菌生长有一定的影响,但是
对真菌生长没有明显影响.目前很多研究表明,土壤细菌和真菌丰度在大气 CO2浓
度升高条件下没有变化
[27-28].Hayden[29]利用多因子气候变化草地平台研究发现,CO2浓度升高、升温
和两者同时升高对细菌和真菌丰度没有影响.本试验结果与其他学者有相似的发现,
大气CO2浓度升高对土壤细菌和真菌丰度没有明显地影响.一般认为,植物利用光
合作用固定的产物输送到地上及地下部分后,再以凋落物、根系分泌物的形式进入
到土壤中.为土壤微生物提供C源和能源,而这些有机物质的成分和数量由于 CO2
浓度的升高而发生变化,进而影响土壤细菌和真菌的生长[23-24].目前,CO2浓度升
高对微生物的影响都是短时间处理的研究结果,而且处理方式及供试条件的不稳定
性增加了研究结果的不确定性,但是确定的是CO2浓度升高对土壤微生物产生了一
定的影响.
Papatheodorou[30]在文章中指出,与土壤微生物量和微生物活性相比,土壤微生物
群落结构对升温的响应更为敏感,温度季节性变化对土壤微生物群落具有显著地影
响,升温通过影响植物凋落物的组分和养分的有效性,为真菌提供较适合的生长环境,
因此,温度升高可能会有利于真菌生长而抑制细菌生长,从而改变了微生物群落结构
[31].对于旱地作物,温度升高还会改变土壤温度和水分状况,这可能会进一步改变土
壤微生物群落多样性.在本研究中,我们发现升温显著抑制了小麦晚期土壤真菌和细
菌的生长.在美国大平原地区研究发现,气温上升提高土壤真菌的优势,进而导致群落
结构发生改变[15].然而,升温有时对土壤真菌和细菌丰富度没有影响[16].因此,有学
者认为,微生物的温度适应范围较广,而升温处理的气温升高幅度相对较小,其对微生
物的影响可能会被自身的调节所消失,因而对微生物群落不会产生很大的影响[25].
由于土壤-植物-微生物之间的复杂性,升温对土壤微生物群落数量和组成的影响还
存在很大的不确定性,因此,在这方面的研究有待于进一步加强.
4.1 CE处理对小麦土壤基础呼吸没有影响,但是 WA处理土壤基础呼吸在抽穗和成
熟期分别增加了 51.6%和 38.5%.在分蘖期,土壤真菌和细菌丰度没有变化,而在抽
穗和成熟期,升温显著降低了真菌丰度,降低幅度分别达到 32.1%～50.2%和
32.0%～37.4%.
4.2 大气CO2浓度和温度升高对土壤真菌和细菌群落结构没有明显影响,但是在一
定程度上改变了古菌群落结构.与对照相比,CE处理显著提高了真菌多样性(7.1%～
8.2%),CW和WA处理真菌多样性分别降低了 5.3%～13.5%和 22.1%～33.6%;在
分蘖和抽穗期,CE、CW和WA处理提高了土壤细菌多样性.
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