2024年4月13日发(作者：冒舒荣)

33

(

6

)

:685

～

690,2007

浙江大学学报

(

农业与生命科学版

)

JournalofZhejiangUniversity

(

Agric

1

&LifeSci

1

)

文章编号

:1008

2

9209

(

2007

)

06

2

0685

2

06

异养型同步硝化反硝化处理氨氮废水及群落结构分析

苏俊峰

1,2

,

马放

1

,

高珊珊

1

,

魏利

1

,

李维国

1

(

1.

哈尔滨工业大学市政环境工程学院环境科学与工程系

,

黑龙江哈尔滨

150090;

2.

西安建筑科技大学环境与市政工程学院

,

陕西西安

710055

)

摘　要

:

从生物陶粒反应器中筛选出

6

株异养硝化细菌

,

采用乙酸钠2氯化铵培养基培养细菌进行硝化

特性研究

.

经过

12d

好氧培养

,6

株异养硝化细菌对

COD

的去除率在

45%

以上

,

总氮和氨氮最终去除

率在

60%

以上

,

并且具有产生

NO

x

-

2

N

的硝化性能

.

采用污泥驯化手段富集好氧反硝化细菌

,

将得到的

驯化污泥分离纯化

,

共得到

5

株高效好氧反硝化细菌

(

f1

、

f2

、

f3

、

f5

、

f7

)

,

他们对总氮

(

TN

)

的去除率分别

为

90

1

4%

、

91

1

2%

、

94

1

6%

、

95

1

6%

、

97%,

表现出较好的总氮去除能力

.

将

6

株异养硝化细菌和

5

株好

氧反硝化细菌扩大培养后

,

建立

SBR

反应器进行氨氮去除的试验研究

.PCR

2

DGGE

图谱表明

,

在反应

器运行的不同时期

,

微生物群落结构发生动态演替

.

在反应器稳定运行期间

,

筛选的异养硝化细菌

wgy5,wgy21,

好氧反硝化细菌

d5

和

Pseudomonas

sp.

的细菌是系统的优势菌群

.

关　键　词

:PCR

2

DGGE;

异养硝化细菌

;

好氧反硝化细菌

;

同步硝化反硝化

中图分类号

:TP273

　　　文献标识码

:A

SUJun

2

feng

1,2

,MAFang

1

,

InstituteofTechnology,

GAOShan

2

shan

1

,WEILI

1

,LIWei

2

guo

1

(

mentof

EnvironmentalandMunicipal

EnvironmentalScience&Engineering,SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,Harbin

Harbin150090,China;of

Engineering,Xi

’

anUniversityofArchitectureandTechnology,Xi

’

an710055,China

)

Heterotrophicnitrifiersandaerobicdenitrifiersinprocessofsimultaneousnitrificationanddenitrification

disposingNH

4

+

2

lofZhejiangUniversity

(

Agric

1

&LifeSci

1

)

,2007,33

(

6

)

:

685

2

690

Abstract:Heterotrophicnitrifierswerescreenedfrombio

2

ceramicreactor,andwerecharacterizedusing

ultsobtainedwerethat

CODremovalratereachedover45%,TNandNH

4

+

2

Nremovalratereachedover60%,andalsothe

nitrificationfunctionofproducingNO

x

-

2

omesticatingactivatedsludgetoenrich

aerobicdenitrifiers,5aerobicdenitrifiers

(

f1,f2,f3,f5,f7

)

wereisolatedfromit,andtheremovalof

TNwere90

1

4%,91

1

2%,94

1

6%,95

1

6%,97%bythesestrains,cessofremoving

ammoniacnitrogenwasdonebysettingtheheterotrophicnitrifyingbacteriaandaerobicdenitrifiersonthe

sequencingbatchreactor

(

SBR

)

.ThePCR

2

DGGEprofilesshowedthatshiftofmicrobialdiversity

theSBRstableperformanceperiod,heterotrophic

　　收稿日期

:2006

2

11

2

10

基金项目

:

国家自然科学基金重大国际合作资助项目

(

5

)

;

国家重点基础研究发展计划“

973"

资助项目

(

2004CB185050

)

.

)

,

男

,

黑龙江北安人

,

博士

,

主要从事环境生物技术方面的研究

.E

2

mai:sjf1977518@.

作者简介

:

苏俊峰

(

1977

—

通讯作者

:

马放

,

男

,

教授

,

博士生导师

,

主要从事环境生物技术方面的研究

.E

2

mai:mafang@

686

浙江大学学报

(

农业与生命科学版

)

第

33

卷　

nitrobacteriawgy5,wgy21,aerobicdenitrifiersd5and

Pseudomonas

minantbacteriainSBR.

Keywords:PCR

2

DGGE;heterotrophicnitrificationbacteria;aerobicdenitrifiers;

nitrificationanddenitrification

simultaneous

　　氮素污染是引起水体富营养化的重要原因

之一

[1

2

3]

,

因此污水的脱氮处理对于维持水体清

洁以及防止富营养化都具有重要的作用

.

根据

传统生物脱氮理论

,

生物脱氮必须通过硝化和

反硝化两个独立过程来实现

.

硝化和反硝化不

能同时发生

,

硝化反应在有氧条件下进行

,

而反

硝化反应需要在严格的厌氧或缺氧条件下进

行

.

最近几年国内外有不少实验和报道证明有

同步硝化和反硝化现象

(

simultaneous

nitrificationanddenitrification,SND

)

,

尤其在

g,H

2

O1000mL.

　　③

DM:Na

2

HPO

4

!

7H

2

O7

1

9g,KH

2

PO

4

1

1

5g,NH

4

Cl0

1

3g,MgSO

4

!

7H

2

O0

1

1g,

琥珀

酸钠

4

1

7g,KNO

3

1g,NaNO

2

0

1

1g,

微量元素溶

液

2mL,H

2

O998mL.

　　微量元素溶液

:EDTA50

1

0g,ZnSO

4

2

1

2

g,CaCl

2

5

1

5g,MnCl

2

!

4H

2

O5

1

06g,FeSO

4

!

7H

2

O5

1

0g,

(

NH

4

)

6

Mo

7

O

2

!

4H

2

O1

1

1g,

CuSO

4

!

5H

2

O1

1

57g,CoCl

2

!

6H

2

O1

1

61g,

H

2

O1000mL.

1

1

2

　异养硝化细菌的分离及硝化能力测定

有氧条件下同步硝化与反硝化存在不同的生物

处理系统中

,

如流化床反应器

[4]

、生物转盘

[5]

、

MBR

[6]

、氧化沟

[7]

、

CAST

[8]

工艺等

.

　　将生物陶粒样品充分悬浮于

100mL

无菌

水中

,

震荡培养

12h

后取菌悬液按

10%

接种量

接种于牛肉膏蛋白胨培养基中

.30

℃摇床富集

培养

2

代

,

每代

24h,

然后将富集培养液接种于

异养氨化培养基固体平板中

,30

℃温箱培养

1

d,

待形成菌落后挑取单菌落

,

接种于异养亚硝

PCR

2

DGGE

作为一种指纹分析技术

,

具

有可重复、快速和操作简便等特点

,

近年来在

分子微生态研究方面得到了广泛应用

[9

2

11]

.

活

性污泥微生物种类极其丰富

,

只有

0

1

1%

～

1%

的微生物种类通过常规方法能被培养

.

因此

,

近

几年

,DGGE

技术被广泛应用于活性污泥微生

物群落多样性和动态分析

[12]

.

　　关于同步硝化反硝化的报道

,

多局限于实

验室内纯种微生物培养的理论研究

,

较少有水

处理实用工艺及种群结构分析研究

.

本研究采

用从污水处理系统中筛选到的

6

株异养硝化细

菌和

5

株好氧反硝化细菌构成复合菌群

,

利用

复合菌群建立

SBR

反应器处理含氨氮的污水

并对系统的种群多样性进行分析

.

化培养基中

.

将

5mL

含纯化菌株的混合液样

品加入到

500mL

经灭菌的培养用培养基

,

溶

液

pH

值调至

7

1

0

～

8

1

0,

三角瓶在

30

℃恒定

转速培养

,

每日取样

,

样品经离心分离后用标

准方法测定

COD

、氨氮、亚硝酸盐氮和总

N,

所

有结果均以空白溶液做对照

.

1

1

3

　好氧反硝化菌的分离及反硝化能力测定

　　从驯化后富集好氧反硝化菌的活性污泥中

分离得到

62

株细菌

,

将上述分离纯化后得到的

纯菌斜面

,

用灭菌后的

DM

(

加入氧化态氮

KNO

3

1g

!

L

-1

,NaNO

2

0

1

5g

!

L

-1

)

培养液洗

到装有

100mLDM

培养液的

250mL

三角瓶

中

,

并在每个三角瓶内加入几粒灭过菌的玻璃

珠

,

用

9

层纱布包好瓶口

,

放入空气振荡器培

养

.

具体培养条件如下

:

温度

30

℃

,

转速

160r

!

min

-1

,

培养时间

24h.

取培养前后的菌液测量

TN

浓度

,

考察其对

TN

的去除率

.

1

1

4

SBR

反应器的人工配水方法

1

　材料和方法

1

1

1

　异养硝化分离培养基

　　①牛肉膏蛋白胨培养基

:

牛肉膏

3g,NaCl

5g,

蛋白胨

10g,H

2

O1000mL,pH7

1

0

～

7

1

2.

　　②异养氨化培养基

:NH

4

Cl0

1

382g,

乙酸

钠

2g,MgSO

4

!

7H

2

O0

1

05g,K

2

HPO

4

0

1

2g,

NaCl0

1

12g,MnSO

4

!

4H

2

O0

1

01g,FeSO

4

0

1

01

　　由人工配水代替试验用废水

,

由

NH

4

Cl

、

Na

2

HPO

4

、

KH

2

PO

4

、

MgSO

4

!

7H

2

O

、

MnSO

4

、

　第

6

期

苏俊峰

,

等

:

异养型同步硝化反硝化处理氨氮废水及群落结构分析

687

NaAc

!

3H

2

O

和微量元素按一定比例配制

.

其水

质见表

1.

其中进水

COD

浓度根据试验需求

配制

.

表

1

　试验模拟用水水质

Table1

Waterqualityofsyntheticwastewater

体系组成如下

:100ng

模板、

20pmol

正反引

物、

200

μ

mol

!

L

-1

dNTP

(

每种

10mmol

!

L

-1

)

、

5

μ

L

的

10

×

PCRbuffer

(

MgCl

2

)

、

2

1

5U

的

PfuDNA

聚合酶

,

无菌纯水补足到

50

μ

L.

1

1

6

1

3

PCR

反应条件　　采用降落

PCR

策

水质指标

COD

NH

4

+

2

N

NO

3

-

2

N

NO

2

-

2

N

TP

pH

浓度

/

(

mg

!

L

-1

)

38

～

216

22

1

78

～

53

1

62

0

～

1

1

92

0

～

0

1

22

3

～

6

7

1

2

～

8

1

0

略扩增

,95

℃预变性

5min,94

℃变性

1min,

65

℃退火

1min,72

℃延伸

30s,

每个循环退火

温度降低

0

1

5

℃直至

55

℃

,30

个循环

,72

℃最

终延伸

反应的产物用

2%

琼脂糖凝

胶电泳检测

.

1

1

7

　变性梯度凝胶电泳

(DGGE)

分析

　　采用

BioRad

公司

Dcode

TM

的基因突变检

测系统对

PCR

反应产物进行电泳分离

.

1

1

7

1

1

　变性梯度胶的制备　　使用梯度混合

装置

,

制备

8%

的聚丙烯酰胺凝胶

,

变性剂浓度

从

35%

到

60%

(

100%

的变性剂为

7mol

!

L

-1

的尿素和

40%

的去离子甲酰胺的混合物

)

,

其

中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增

.

1

1

7

1

2

PCR

样品的加样　　待变性梯度胶完

全凝固后

,

将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳

槽中

,

取

PCR

样品

5

μ

L

和

10

倍加样缓冲液混

合后加入上样孔

.

1

1

7

1

3

　电泳及染色　　在

150V

电压下

,60

℃

电泳

4h.

电泳结束后

,

将凝胶进行银染

.

1

1

7

1

4

　胶图扫描　　将染色后的凝胶用

UMAX

透射扫描仪扫描后获取胶图

,

在凝胶两

面覆上干胶膜

(

promega

)

,

用干胶夹定型

,

自然

干燥后长期保存

.

1

1

5

SBR

反应器的建立

SBR

反应器由有机玻璃加工而成

,

容积为

3L,

采用鼓风曝气、电动搅拌机搅拌

.

将筛选

的异养硝化细菌扩大培养

,

接种相当于整个反

应器体积

0

1

1%

的新鲜活性污泥

,

空曝气

3

～

7

d

形成活性污泥后开始运行

.

当氨氮去除率在

70%

以上时表明已建立稳定的异养硝化污泥体

系

,

整个反应器运行期间逐步降低溶解氧的浓

度

,

从

4

～

5mg

!

L

-1

逐步降到

1

～

2mg

!

L

-1

.

将

筛选的好氧反硝化细菌扩大培养

,

接种相当于

整个反应器体积

0

1

1%

的新鲜活性污泥

,

空曝

气

3

～

7d

后形成活性污泥

,

整个驯化过程逐步

提高溶解氧浓度

,

从

0

1

5mg

!

L

-1

逐步升到

2

～

3mg

!

L

-1

.

当硝酸盐去除率在

80%

以上时表明

已建立稳定的好养反硝化污泥体系

.

向稳定的

异养硝化污泥体系投加用好养反硝化细菌驯化

培养液驯化的污泥

,

每天测定反应器氨氮和亚

硝酸盐浓度的变化

,

水温为

20

～

25

℃

,

以

12h

为

1

个周期

,

每个周期进水

5min,

曝气

11h20

min,

沉淀

30min,

排水

5min,

每次换水时排出

总水量的

50%

左右

,

溶解氧浓度为

2mg

!

L

-1

.

1

1

6

　基因组总

DNA16SrDNAV3

区扩增

1

1

6

1

1

　引物序列　　采用对大多数细菌和古

细菌的

16SrDNA

基因

,V3

区具有特异性的引

物对

:F

338

GC

和

R

518

,

他们的序列分别为

:F

338

GC:

(

5

’2

CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCC

GCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG

2

)

和

R

518

(

5

’

)

.3

’2

ATTACCGCGGCTGCTGG

2

3

’

1

1

6

1

2

PCR

反应体系　　

50

μ

L

的

PCR

反应

2

　结果与讨论

2

1

1

　异养硝化细菌硝化速率的测定

　　采用乙酸钠、氯化铵作为碳源及氮源检验

微生物的硝化性能

,

经过

12d

的好氧培养

,6

株

异养硝化菌对

COD

的去除率在

45%

以上

,

对

总氮最终去除率在

60%

以上

(

表

2

)

,

表明

6

株

细菌具有良好的脱氮除碳性能

.

对氨氮最终去

除率在

60%

以上

.

在前

5d

细菌利用培养基中

的碳源、氮源及其它营养源进行快速增殖

,

使

COD

、总氮、氨氮快速下降

,5d

以后细菌由于

快速繁殖使培养液中的营养物质大量被耗用

,

细菌的增殖速度减慢

,

另一方面大量死亡的细

688

浙江大学学报

(

农业与生命科学版

)

第

33

卷　

菌释放出其内源有机物

,

使

COD

、总氮、氨氮浓

度趋于稳定

.NO

2

-

2

N

和

NO

3

-

2

N

浓度变化较

小

(

表

2

)

.NO

2

-

2

N

和

NO

3

-

2

N

浓度在整个试

验过程后期积累明显快于前期

,

说明

NO

2

-

2

N

和

NO

3

-

2

N

浓度变化与生长情况不一致

,

其积

累不是出现在菌体对数增殖期

,

这表明硝化作

用可能是在老龄细胞中发生的

.

表

2

6

株异养硝化细菌对培养液中

COD,TN,NH

4

+

2

N

及

NO

x

-

2

N

的去除率

Table2

AverageremovalratesofCOD,TN,NH

4

+

2

NandNO

x

-

2

Ninculturemediumduringbatchtestofstrains

mg

!

L

-1

菌株

编号

CODTNNH

4

+

2

N

NO

2

-

2

N

NO

3

-

2

N

初始

浓度

结束

浓度

954

1

24

873

1

00

去除

率

/%

49

1

63

56

1

54

56

1

10

45

1

44

50

1

85

45

1

03

初始

浓度

151

1

63

171

1

55

154

1

88

171

1

56

152

1

47

172

1

85

结束

浓度

52

1

3

59

1

39

52

1

89

54

1

93

59

1

83

52

1

36

去除

率

/%

65

1

51

65

1

38

65

1

85

67

1

98

60

1

76

69

1

71

初始

浓度

105

1

68

110

1

59

99

1

77

102

1

87

115

1

67

106

1

25

结束

浓度

18

1

11

22

1

92

25

1

86

15

1

47

16

1

27

21

1

12

去除

率

/%

82

1

86

79

1

27

74

1

08

84

1

96

85

1

93

80

1

12

初始

浓度

0

0

0

0

0

0

结束

浓度

0

1

25

0

1

49

0

1

72

0

1

19

0

1

60

0

1

75

初始

浓度

3

1

36

3

1

52

3

1

12

2

1

97

3

1

19

3

1

02

结束

浓度

4

1

45

4

1

68

3

1

85

3

1

59

3

1

38

3

1

21

wgy12064

1

841040

1

15

wgy22195

1

65

wgy31988

1

51

wgy42087

1

261138

1

71

wgy52076

1

79986

1

39

wgy62033

1

151117

1

55

2

1

2

　好氧反硝化菌的筛选

　　从太平污水处理厂的曝气池和生物陶粒作

为载体的好氧反硝化反应器中取得活性污泥样

品

,

采用

SBR

反应器对活性污泥样品进行

1

个

月的驯化

,

在污泥驯化后

,

从装置中共分离纯化

得到

62

株细菌

,

其中

TN

去除率在

90%

以上

的菌株有

5

株

.

分别为

f1

、

f2

、

f3

、

f5

、

f7,

其对总

氮的去除率分别为

90

1

4%

、

91

1

2%

、

94

1

6%

、

95

1

6%

、

97%,

表现出较好的总氮去除能力

.

一

般认为

,

生物同化作用利用的氮不会超过

TN

的

30%,

所以可以基本认为这

5

株细菌在好氧

条件下具有反硝化作用

.

2

1

3

PCR

2

DGGE

指纹图谱分析

　　分别在反应器运行的不同时期

(

第

2

、

15

、

30d

)

取样

,

采用细菌

16SrRNA

基因通用引物

F

338

GC

2

R

518

进行扩增

,

其

PCR

2

DGGE

图谱见

图

1.

在

PCR

2

DGGE

带谱中

,

样品

1

有

14

条

带

,

样品

2

有

9

条带

,

样品

3

有

16

条带

.

反应器

运行到第

15d

时

,

细菌种群多样性最低

,

特征

条带

e,f

所指示的优势种群消失

,

条带

b

出现

并富集

.

这主要是由于试验前期向

SBR

反应器

异养硝化污泥中投加了采用亚硝酸盐和硝酸盐

驯化的好氧反硝化污泥

,2

种污泥中含有的细

菌菌群发生剧烈的竞争

,

群落演替迅速

,

不适应

环境的菌群在竞争中处于劣势而被大量淘汰

,

但优势菌群较为明显

.

第

30d

时

,

细菌种群多

1:2d;2:15d;3:30d.

图

1

　不同样品

PCR

产物变性梯度凝胶电泳图

Fig.1

DGGEprofileofdifferentPCRsamplestakenat

differenttime

样性最高

,

既有先前的种群消亡

,

也有新的优势

菌种的出现

,

说明种群一直处于动态变化过程

中

,

逐渐形成了稳定的生态位

.

在稳定期特征条

带

f

所指示的优势种群重新出现

,

出现了新的

特征条带

a,

特征条带

c,d,g

所指示的优势菌

　第

6

期

苏俊峰

,

等

:

异养型同步硝化反硝化处理氨氮废水及群落结构分析

689

群始终是系统的优势菌群

,

称为常驻菌群

.

特征

条带

b,g

所指示的种群优势地位在稳定期逐渐

得以显现

.

DGGE

指纹图谱通过软件进行相似性分

析

,2d

与

15d

相似性为

47

1

62%,2d

与

30d

相似性最低为

42

1

86%,15d

与

30d

相似性最

高为

72%

(

表

3

)

.

群落的相似性随着运行时间

的延长先降低再升高

,

第

30d

逐渐形成稳定的

顶级群落

.

表

3

DGGE

图谱的相似性分析

Table3

SimilaritycoefficientofDGGEprofiles

硝化细菌由于底物缺乏且不适应新环境

.

试验

后期整个系统的群落结构趋于稳定

,

好氧反硝

化细菌有充足的底物且逐渐适应了新的环境而

成为整个系统的优势菌群

,

异养硝化细菌将氨

氮转化为硝酸盐

,

好氧反硝化细菌将硝酸盐转

化为氮气

,

并最终造成总氮的去除

.a,d,e,f

所

代表的特征条带分别为

Bacillusmegaterium

strain,

Pseudomonas

sp.,unculturedbacterium

clone

和

Pseudomonaschloritidismutans

.

Pseudomonas

sp.

的细菌是异养硝化细菌和好

氧反硝化细菌的主要类郡

.

这些细菌可能是通

过接种的污泥带进反应器中

,

由于它们有较强

的适应能力而逐渐成为系统的优势菌群

.

表

4

SBR

反应器细菌

OTU

与

GenBank

数据库中最为

相似性

/%

2d

15d

30d

2d

100

47

1

62

42

1

86

15d30d

100

72100

接近的细菌种类

Table4

Mostcloselymatchedspeciesof6partial16SrDNA

sequencesinGeneBank

2

1

4

　测序结果分析

　　不同样品经过变性梯度凝胶电泳

(

DGGE

)

分离出数目不等的电泳条带

,

各个条带的信号

强度不同

.

根据

DGGE

对具有相同大小不同

DNA

序列片段分离原理

,

可以得知

3

个时期活

操作分

类单元

(

OTU

)

a

b

c

d

e

f

g

GenBank

数据库或筛选的硝化细菌

最为接近的细菌种类

Bacillusmegaterium

strain

相似

性

/%

98

100

100

99

100

97

95

wgy21

wgy5

Pseudomonas

111063.1

性污泥的

PCR

产物中含有十几种不同指纹条

带

,

每个独立分离的条带为

1

个操作分类单元

(

operationaltaxonomyunit,OTU

)

,

可能包括

1

种或

1

种以上的微生物种属

.

在反应器运行

UnculturedbacteriumcloneDQ469220

Pseudomonaschloritidismutans

AY017341

d5

过程中

,

不同时期的活性污泥微生物群落结构

和种群数量不同

.

　　对

DGGE

图谱上的

7

条主要条带分别进

行切割、

DNA

洗脱、回收、重新扩增和电泳检

测

.

对每个重新扩增条带进行纯化、连接、转化、

克隆

,

所有割胶条带都能找到与其相对应的阳

性克隆转化子

,

在

GenBank

数据库和筛选菌

16SrDNA

中找出与每条序列亲缘关系最近的

3

1

1

　在氨氧化培养基中经过

12d

的好氧培

3

　结　论

养

,6

株细菌的

COD

及

TN

浓度均呈现出降低

趋势

,6

株异养硝化菌对

COD

的去除率在

45%

以上

,

对氨氮和总氮最终去除率在

60%

以上

,

表明

6

株细菌具有良好的脱氮除碳性能

.

整个

试验期间

NO

2

-

2

N

和

NO

3

-

2

N

浓度变化较小

.

3

1

2

　从太平污水处理厂的曝气池和生物陶粒

菌

,

其结果见表

4.

反应器的整个运行阶段

,

筛

选的异养硝化细菌

wgy21

所代表的特征条带

在反应器运行到第

2d

消失

,

第

15dwgy21

所

代表的特征条带出现并逐渐富集

,

第

30d

wgy21

成为反应器中的优势菌群

.

异养硝化细

作为载体的好氧反硝化反应器中取得活性污泥

样品

,

采用

SBR

反应器对活性污泥样品进行

1

个月的驯化

,

从装置中共分离纯化得到

5

株高

效好氧反硝化细菌

,

分别为

f1

、

f2

、

f3

、

f5

、

f7,

其

对总氮的去除率分别为

90

1

4%

、

91

1

2%

、

菌

wgy5

所代表的特征条带始终是反应器中的

优势菌群

,

称为常驻菌群

.

好氧反硝化细菌

d5

在试验前期生物量较低

,

这主要是由于好氧反

690

浙江大学学报

(

农业与生命科学版

)

亮

,

李春杰

,

等

)

.

denitrificationand

第

33

卷　

Simultaneousnitrificationand

heterotrophicnitrificationin

94

1

6%

、

95

1

6%

、

97%,

表现出较好的总氮去除

能力

.

3

1

3

PCR

2

DGGE

图谱表明

,

在反应器运行的

不同时期

,

微生物群落结构发生动态演替

.2d

与

15d

的相似性为

47

1

62%,15d

与

30d

的相

似性最高为

72%,2d

与

30d

的相似性最低为

42

1

86%.

测序结果显示

,

在反应器稳定运行期

membranebioreactor[J].EnvironmentalScienceand

Technology(

环境科学与技术

),2006,29

(

1

)

:7

2

9,27.

(

inChinese

)

[7]

MoriyamaK,SatoK,HaradaY,

etal

.Simultaneous

biologicalremovalofnitrogenandphosphorususing

oxicanaerobicoxicprocess[J].

Technology,1990,22

(

78

)

:54

2

69.

[8]

PochanaK,ffactorsaffecting

simultaneousnitrificationanddenitrification

(

SND

)

[J].WaterScienceTechnology,1999,39

(

6

)

:55

2

71.

[9]

CasamayorEO,SchaferH,BanerasL,

etal

.

Identificationofspatiotemporaldifferencesbetween

microbialassemblagesfromtwoneighboringsulfurous

lakes:comparisonbymicroscopyanddenaturing

gradientgelelectrophoresis[J].AppliedEnvironmental

Microbiology,2000,66:499

2

508.

[10]

FerrisMJ,MuyzerG,ring

gradientgelelectrophoresisof16SrRNAdefined

populationsinhabitingahotspringmicrobialmat

community[J].AppliedEnvironmentalMicrobiology,

1996,62:340

2

346.

[11]

IwamoT,NakamuraK,SuzukiY,

etal

.Monitoring

impactof

insitu

WaterScience

间

,

筛选的异养硝化细菌

wgy5,wgy21,

好氧反

硝化细菌

d5

和

Pseudomonas

sp.

的细菌是系

统的优势菌群

.

References:

[1]

lvingconceptualmodelofthe

coastaleutrophicationproblem[J].MarineEcology

2

ProgressSeries,2001,210:223

2

253.

[2]

nmentalthreatsandenvironmental

futureofestuaries[J].EnvironmentalConservation,2002,

29:78

2

107.

[3]

RabalaisNN,TurnerRE,science

intopolicy:gulfofMexicohypoxiaandtheMississippi

River[J].BiologicalScience,2002,52:129

2

142.

[4]

ElisabethVM,PaulL,Jurg

nitrification

sequencing

and

batch

denitrification

reactors[J].

K.

in

Simultaneous

bench

Water

scale

Science

bio

2

stimulationtreatmenton

groundwaterbacterialcommunitybyDGGE[J].FEMS

MicrobiologyEcology,2000,32:137

2

14.

[12]

LiuWT,ChartOC,ial

communitydynamicsduringstaff

2

upofacidogenic

anaerobicreactors[J].WaterResource,2002,36:

3203

2

3210.

Technology,1996,30

(

2

)

:259

2

293.

[5]

MasudaS,WatanabeY,mproerties

andsimultaneousnitrificationanddenitrificationin

aerobicrotatingbiologicalcontactors[J].WaterScience

Technology,1991,23:1347

2

1369.

[6]

LINYan,HEYi

2

liang,LIChun

2

jie,

etal

.

(

林燕

,

何义

2024年4月13日发(作者：冒舒荣)

33

(

6

)

:685

～

690,2007

浙江大学学报

(

农业与生命科学版

)

JournalofZhejiangUniversity

(

Agric

1

&LifeSci

1

)

文章编号

:1008

2

9209

(

2007

)

06

2

0685

2

06

异养型同步硝化反硝化处理氨氮废水及群落结构分析

苏俊峰

1,2

,

马放

1

,

高珊珊

1

,

魏利

1

,

李维国

1

(

1.

哈尔滨工业大学市政环境工程学院环境科学与工程系

,

黑龙江哈尔滨

150090;

2.

西安建筑科技大学环境与市政工程学院

,

陕西西安

710055

)

摘　要

:

从生物陶粒反应器中筛选出

6

株异养硝化细菌

,

采用乙酸钠2氯化铵培养基培养细菌进行硝化

特性研究

.

经过

12d

好氧培养

,6

株异养硝化细菌对

COD

的去除率在

45%

以上

,

总氮和氨氮最终去除

率在

60%

以上

,

并且具有产生

NO

x

-

2

N

的硝化性能

.

采用污泥驯化手段富集好氧反硝化细菌

,

将得到的

驯化污泥分离纯化

,

共得到

5

株高效好氧反硝化细菌

(

f1

、

f2

、

f3

、

f5

、

f7

)

,

他们对总氮

(

TN

)

的去除率分别

为

90

1

4%

、

91

1

2%

、

94

1

6%

、

95

1

6%

、

97%,

表现出较好的总氮去除能力

.

将

6

株异养硝化细菌和

5

株好

氧反硝化细菌扩大培养后

,

建立

SBR

反应器进行氨氮去除的试验研究

.PCR

2

DGGE

图谱表明

,

在反应

器运行的不同时期

,

微生物群落结构发生动态演替

.

在反应器稳定运行期间

,

筛选的异养硝化细菌

wgy5,wgy21,

好氧反硝化细菌

d5

和

Pseudomonas

sp.

的细菌是系统的优势菌群

.

关　键　词

:PCR

2

DGGE;

异养硝化细菌

;

好氧反硝化细菌

;

同步硝化反硝化

中图分类号

:TP273

　　　文献标识码

:A

SUJun

2

feng

1,2

,MAFang

1

,

InstituteofTechnology,

GAOShan

2

shan

1

,WEILI

1

,LIWei

2

guo

1

(

mentof

EnvironmentalandMunicipal

EnvironmentalScience&Engineering,SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,Harbin

Harbin150090,China;of

Engineering,Xi

’

anUniversityofArchitectureandTechnology,Xi

’

an710055,China

)

Heterotrophicnitrifiersandaerobicdenitrifiersinprocessofsimultaneousnitrificationanddenitrification

disposingNH

4

+

2

lofZhejiangUniversity

(

Agric

1

&LifeSci

1

)

,2007,33

(

6

)

:

685

2

690

Abstract:Heterotrophicnitrifierswerescreenedfrombio

2

ceramicreactor,andwerecharacterizedusing

ultsobtainedwerethat

CODremovalratereachedover45%,TNandNH

4

+

2

Nremovalratereachedover60%,andalsothe

nitrificationfunctionofproducingNO

x

-

2

omesticatingactivatedsludgetoenrich

aerobicdenitrifiers,5aerobicdenitrifiers

(

f1,f2,f3,f5,f7

)

wereisolatedfromit,andtheremovalof

TNwere90

1

4%,91

1

2%,94

1

6%,95

1

6%,97%bythesestrains,cessofremoving

ammoniacnitrogenwasdonebysettingtheheterotrophicnitrifyingbacteriaandaerobicdenitrifiersonthe

sequencingbatchreactor

(

SBR

)

.ThePCR

2

DGGEprofilesshowedthatshiftofmicrobialdiversity

theSBRstableperformanceperiod,heterotrophic

　　收稿日期

:2006

2

11

2

10

基金项目

:

国家自然科学基金重大国际合作资助项目

(

5

)

;

国家重点基础研究发展计划“

973"

资助项目

(

2004CB185050

)

.

)

,

男

,

黑龙江北安人

,

博士

,

主要从事环境生物技术方面的研究

.E

2

mai:sjf1977518@.

作者简介

:

苏俊峰

(

1977

—

通讯作者

:

马放

,

男

,

教授

,

博士生导师

,

主要从事环境生物技术方面的研究

.E

2

mai:mafang@

686

浙江大学学报

(

农业与生命科学版

)

第

33

卷　

nitrobacteriawgy5,wgy21,aerobicdenitrifiersd5and

Pseudomonas

minantbacteriainSBR.

Keywords:PCR

2

DGGE;heterotrophicnitrificationbacteria;aerobicdenitrifiers;

nitrificationanddenitrification

simultaneous

　　氮素污染是引起水体富营养化的重要原因

之一

[1

2

3]

,

因此污水的脱氮处理对于维持水体清

洁以及防止富营养化都具有重要的作用

.

根据

传统生物脱氮理论

,

生物脱氮必须通过硝化和

反硝化两个独立过程来实现

.

硝化和反硝化不

能同时发生

,

硝化反应在有氧条件下进行

,

而反

硝化反应需要在严格的厌氧或缺氧条件下进

行

.

最近几年国内外有不少实验和报道证明有

同步硝化和反硝化现象

(

simultaneous

nitrificationanddenitrification,SND

)

,

尤其在

g,H

2

O1000mL.

　　③

DM:Na

2

HPO

4

!

7H

2

O7

1

9g,KH

2

PO

4

1

1

5g,NH

4

Cl0

1

3g,MgSO

4

!

7H

2

O0

1

1g,

琥珀

酸钠

4

1

7g,KNO

3

1g,NaNO

2

0

1

1g,

微量元素溶

液

2mL,H

2

O998mL.

　　微量元素溶液

:EDTA50

1

0g,ZnSO

4

2

1

2

g,CaCl

2

5

1

5g,MnCl

2

!

4H

2

O5

1

06g,FeSO

4

!

7H

2

O5

1

0g,

(

NH

4

)

6

Mo

7

O

2

!

4H

2

O1

1

1g,

CuSO

4

!

5H

2

O1

1

57g,CoCl

2

!

6H

2

O1

1

61g,

H

2

O1000mL.

1

1

2

　异养硝化细菌的分离及硝化能力测定

有氧条件下同步硝化与反硝化存在不同的生物

处理系统中

,

如流化床反应器

[4]

、生物转盘

[5]

、

MBR

[6]

、氧化沟

[7]

、

CAST

[8]

工艺等

.

　　将生物陶粒样品充分悬浮于

100mL

无菌

水中

,

震荡培养

12h

后取菌悬液按

10%

接种量

接种于牛肉膏蛋白胨培养基中

.30

℃摇床富集

培养

2

代

,

每代

24h,

然后将富集培养液接种于

异养氨化培养基固体平板中

,30

℃温箱培养

1

d,

待形成菌落后挑取单菌落

,

接种于异养亚硝

PCR

2

DGGE

作为一种指纹分析技术

,

具

有可重复、快速和操作简便等特点

,

近年来在

分子微生态研究方面得到了广泛应用

[9

2

11]

.

活

性污泥微生物种类极其丰富

,

只有

0

1

1%

～

1%

的微生物种类通过常规方法能被培养

.

因此

,

近

几年

,DGGE

技术被广泛应用于活性污泥微生

物群落多样性和动态分析

[12]

.

　　关于同步硝化反硝化的报道

,

多局限于实

验室内纯种微生物培养的理论研究

,

较少有水

处理实用工艺及种群结构分析研究

.

本研究采

用从污水处理系统中筛选到的

6

株异养硝化细

菌和

5

株好氧反硝化细菌构成复合菌群

,

利用

复合菌群建立

SBR

反应器处理含氨氮的污水

并对系统的种群多样性进行分析

.

化培养基中

.

将

5mL

含纯化菌株的混合液样

品加入到

500mL

经灭菌的培养用培养基

,

溶

液

pH

值调至

7

1

0

～

8

1

0,

三角瓶在

30

℃恒定

转速培养

,

每日取样

,

样品经离心分离后用标

准方法测定

COD

、氨氮、亚硝酸盐氮和总

N,

所

有结果均以空白溶液做对照

.

1

1

3

　好氧反硝化菌的分离及反硝化能力测定

　　从驯化后富集好氧反硝化菌的活性污泥中

分离得到

62

株细菌

,

将上述分离纯化后得到的

纯菌斜面

,

用灭菌后的

DM

(

加入氧化态氮

KNO

3

1g

!

L

-1

,NaNO

2

0

1

5g

!

L

-1

)

培养液洗

到装有

100mLDM

培养液的

250mL

三角瓶

中

,

并在每个三角瓶内加入几粒灭过菌的玻璃

珠

,

用

9

层纱布包好瓶口

,

放入空气振荡器培

养

.

具体培养条件如下

:

温度

30

℃

,

转速

160r

!

min

-1

,

培养时间

24h.

取培养前后的菌液测量

TN

浓度

,

考察其对

TN

的去除率

.

1

1

4

SBR

反应器的人工配水方法

1

　材料和方法

1

1

1

　异养硝化分离培养基

　　①牛肉膏蛋白胨培养基

:

牛肉膏

3g,NaCl

5g,

蛋白胨

10g,H

2

O1000mL,pH7

1

0

～

7

1

2.

　　②异养氨化培养基

:NH

4

Cl0

1

382g,

乙酸

钠

2g,MgSO

4

!

7H

2

O0

1

05g,K

2

HPO

4

0

1

2g,

NaCl0

1

12g,MnSO

4

!

4H

2

O0

1

01g,FeSO

4

0

1

01

　　由人工配水代替试验用废水

,

由

NH

4

Cl

、

Na

2

HPO

4

、

KH

2

PO

4

、

MgSO

4

!

7H

2

O

、

MnSO

4

、

　第

6

期

苏俊峰

,

等

:

异养型同步硝化反硝化处理氨氮废水及群落结构分析

687

NaAc

!

3H

2

O

和微量元素按一定比例配制

.

其水

质见表

1.

其中进水

COD

浓度根据试验需求

配制

.

表

1

　试验模拟用水水质

Table1

Waterqualityofsyntheticwastewater

体系组成如下

:100ng

模板、

20pmol

正反引

物、

200

μ

mol

!

L

-1

dNTP

(

每种

10mmol

!

L

-1

)

、

5

μ

L

的

10

×

PCRbuffer

(

MgCl

2

)

、

2

1

5U

的

PfuDNA

聚合酶

,

无菌纯水补足到

50

μ

L.

1

1

6

1

3

PCR

反应条件　　采用降落

PCR

策

水质指标

COD

NH

4

+

2

N

NO

3

-

2

N

NO

2

-

2

N

TP

pH

浓度

/

(

mg

!

L

-1

)

38

～

216

22

1

78

～

53

1

62

0

～

1

1

92

0

～

0

1

22

3

～

6

7

1

2

～

8

1

0

略扩增

,95

℃预变性

5min,94

℃变性

1min,

65

℃退火

1min,72

℃延伸

30s,

每个循环退火

温度降低

0

1

5

℃直至

55

℃

,30

个循环

,72

℃最

终延伸

反应的产物用

2%

琼脂糖凝

胶电泳检测

.

1

1

7

　变性梯度凝胶电泳

(DGGE)

分析

　　采用

BioRad

公司

Dcode

TM

的基因突变检

测系统对

PCR

反应产物进行电泳分离

.

1

1

7

1

1

　变性梯度胶的制备　　使用梯度混合

装置

,

制备

8%

的聚丙烯酰胺凝胶

,

变性剂浓度

从

35%

到

60%

(

100%

的变性剂为

7mol

!

L

-1

的尿素和

40%

的去离子甲酰胺的混合物

)

,

其

中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增

.

1

1

7

1

2

PCR

样品的加样　　待变性梯度胶完

全凝固后

,

将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳

槽中

,

取

PCR

样品

5

μ

L

和

10

倍加样缓冲液混

合后加入上样孔

.

1

1

7

1

3

　电泳及染色　　在

150V

电压下

,60

℃

电泳

4h.

电泳结束后

,

将凝胶进行银染

.

1

1

7

1

4

　胶图扫描　　将染色后的凝胶用

UMAX

透射扫描仪扫描后获取胶图

,

在凝胶两

面覆上干胶膜

(

promega

)

,

用干胶夹定型

,

自然

干燥后长期保存

.

1

1

5

SBR

反应器的建立

SBR

反应器由有机玻璃加工而成

,

容积为

3L,

采用鼓风曝气、电动搅拌机搅拌

.

将筛选

的异养硝化细菌扩大培养

,

接种相当于整个反

应器体积

0

1

1%

的新鲜活性污泥

,

空曝气

3

～

7

d

形成活性污泥后开始运行

.

当氨氮去除率在

70%

以上时表明已建立稳定的异养硝化污泥体

系

,

整个反应器运行期间逐步降低溶解氧的浓

度

,

从

4

～

5mg

!

L

-1

逐步降到

1

～

2mg

!

L

-1

.

将

筛选的好氧反硝化细菌扩大培养

,

接种相当于

整个反应器体积

0

1

1%

的新鲜活性污泥

,

空曝

气

3

～

7d

后形成活性污泥

,

整个驯化过程逐步

提高溶解氧浓度

,

从

0

1

5mg

!

L

-1

逐步升到

2

～

3mg

!

L

-1

.

当硝酸盐去除率在

80%

以上时表明

已建立稳定的好养反硝化污泥体系

.

向稳定的

异养硝化污泥体系投加用好养反硝化细菌驯化

培养液驯化的污泥

,

每天测定反应器氨氮和亚

硝酸盐浓度的变化

,

水温为

20

～

25

℃

,

以

12h

为

1

个周期

,

每个周期进水

5min,

曝气

11h20

min,

沉淀

30min,

排水

5min,

每次换水时排出

总水量的

50%

左右

,

溶解氧浓度为

2mg

!

L

-1

.

1

1

6

　基因组总

DNA16SrDNAV3

区扩增

1

1

6

1

1

　引物序列　　采用对大多数细菌和古

细菌的

16SrDNA

基因

,V3

区具有特异性的引

物对

:F

338

GC

和

R

518

,

他们的序列分别为

:F

338

GC:

(

5

’2

CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCC

GCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG

2

)

和

R

518

(

5

’

)

.3

’2

ATTACCGCGGCTGCTGG

2

3

’

1

1

6

1

2

PCR

反应体系　　

50

μ

L

的

PCR

反应

2

　结果与讨论

2

1

1

　异养硝化细菌硝化速率的测定

　　采用乙酸钠、氯化铵作为碳源及氮源检验

微生物的硝化性能

,

经过

12d

的好氧培养

,6

株

异养硝化菌对

COD

的去除率在

45%

以上

,

对

总氮最终去除率在

60%

以上

(

表

2

)

,

表明

6

株

细菌具有良好的脱氮除碳性能

.

对氨氮最终去

除率在

60%

以上

.

在前

5d

细菌利用培养基中

的碳源、氮源及其它营养源进行快速增殖

,

使

COD

、总氮、氨氮快速下降

,5d

以后细菌由于

快速繁殖使培养液中的营养物质大量被耗用

,

细菌的增殖速度减慢

,

另一方面大量死亡的细

688

浙江大学学报

(

农业与生命科学版

)

第

33

卷　

菌释放出其内源有机物

,

使

COD

、总氮、氨氮浓

度趋于稳定

.NO

2

-

2

N

和

NO

3

-

2

N

浓度变化较

小

(

表

2

)

.NO

2

-

2

N

和

NO

3

-

2

N

浓度在整个试

验过程后期积累明显快于前期

,

说明

NO

2

-

2

N

和

NO

3

-

2

N

浓度变化与生长情况不一致

,

其积

累不是出现在菌体对数增殖期

,

这表明硝化作

用可能是在老龄细胞中发生的

.

表

2

6

株异养硝化细菌对培养液中

COD,TN,NH

4

+

2

N

及

NO

x

-

2

N

的去除率

Table2

AverageremovalratesofCOD,TN,NH

4

+

2

NandNO

x

-

2

Ninculturemediumduringbatchtestofstrains

mg

!

L

-1

菌株

编号

CODTNNH

4

+

2

N

NO

2

-

2

N

NO

3

-

2

N

初始

浓度

结束

浓度

954

1

24

873

1

00

去除

率

/%

49

1

63

56

1

54

56

1

10

45

1

44

50

1

85

45

1

03

初始

浓度

151

1

63

171

1

55

154

1

88

171

1

56

152

1

47

172

1

85

结束

浓度

52

1

3

59

1

39

52

1

89

54

1

93

59

1

83

52

1

36

去除

率

/%

65

1

51

65

1

38

65

1

85

67

1

98

60

1

76

69

1

71

初始

浓度

105

1

68

110

1

59

99

1

77

102

1

87

115

1

67

106

1

25

结束

浓度

18

1

11

22

1

92

25

1

86

15

1

47

16

1

27

21

1

12

去除

率

/%

82

1

86

79

1

27

74

1

08

84

1

96

85

1

93

80

1

12

初始

浓度

0

0

0

0

0

0

结束

浓度

0

1

25

0

1

49

0

1

72

0

1

19

0

1

60

0

1

75

初始

浓度

3

1

36

3

1

52

3

1

12

2

1

97

3

1

19

3

1

02

结束

浓度

4

1

45

4

1

68

3

1

85

3

1

59

3

1

38

3

1

21

wgy12064

1

841040

1

15

wgy22195

1

65

wgy31988

1

51

wgy42087

1

261138

1

71

wgy52076

1

79986

1

39

wgy62033

1

151117

1

55

2

1

2

　好氧反硝化菌的筛选

　　从太平污水处理厂的曝气池和生物陶粒作

为载体的好氧反硝化反应器中取得活性污泥样

品

,

采用

SBR

反应器对活性污泥样品进行

1

个

月的驯化

,

在污泥驯化后

,

从装置中共分离纯化

得到

62

株细菌

,

其中

TN

去除率在

90%

以上

的菌株有

5

株

.

分别为

f1

、

f2

、

f3

、

f5

、

f7,

其对总

氮的去除率分别为

90

1

4%

、

91

1

2%

、

94

1

6%

、

95

1

6%

、

97%,

表现出较好的总氮去除能力

.

一

般认为

,

生物同化作用利用的氮不会超过

TN

的

30%,

所以可以基本认为这

5

株细菌在好氧

条件下具有反硝化作用

.

2

1

3

PCR

2

DGGE

指纹图谱分析

　　分别在反应器运行的不同时期

(

第

2

、

15

、

30d

)

取样

,

采用细菌

16SrRNA

基因通用引物

F

338

GC

2

R

518

进行扩增

,

其

PCR

2

DGGE

图谱见

图

1.

在

PCR

2

DGGE

带谱中

,

样品

1

有

14

条

带

,

样品

2

有

9

条带

,

样品

3

有

16

条带

.

反应器

运行到第

15d

时

,

细菌种群多样性最低

,

特征

条带

e,f

所指示的优势种群消失

,

条带

b

出现

并富集

.

这主要是由于试验前期向

SBR

反应器

异养硝化污泥中投加了采用亚硝酸盐和硝酸盐

驯化的好氧反硝化污泥

,2

种污泥中含有的细

菌菌群发生剧烈的竞争

,

群落演替迅速

,

不适应

环境的菌群在竞争中处于劣势而被大量淘汰

,

但优势菌群较为明显

.

第

30d

时

,

细菌种群多

1:2d;2:15d;3:30d.

图

1

　不同样品

PCR

产物变性梯度凝胶电泳图

Fig.1

DGGEprofileofdifferentPCRsamplestakenat

differenttime

样性最高

,

既有先前的种群消亡

,

也有新的优势

菌种的出现

,

说明种群一直处于动态变化过程

中

,

逐渐形成了稳定的生态位

.

在稳定期特征条

带

f

所指示的优势种群重新出现

,

出现了新的

特征条带

a,

特征条带

c,d,g

所指示的优势菌

　第

6

期

苏俊峰

,

等

:

异养型同步硝化反硝化处理氨氮废水及群落结构分析

689

群始终是系统的优势菌群

,

称为常驻菌群

.

特征

条带

b,g

所指示的种群优势地位在稳定期逐渐

得以显现

.

DGGE

指纹图谱通过软件进行相似性分

析

,2d

与

15d

相似性为

47

1

62%,2d

与

30d

相似性最低为

42

1

86%,15d

与

30d

相似性最

高为

72%

(

表

3

)

.

群落的相似性随着运行时间

的延长先降低再升高

,

第

30d

逐渐形成稳定的

顶级群落

.

表

3

DGGE

图谱的相似性分析

Table3

SimilaritycoefficientofDGGEprofiles

硝化细菌由于底物缺乏且不适应新环境

.

试验

后期整个系统的群落结构趋于稳定

,

好氧反硝

化细菌有充足的底物且逐渐适应了新的环境而

成为整个系统的优势菌群

,

异养硝化细菌将氨

氮转化为硝酸盐

,

好氧反硝化细菌将硝酸盐转

化为氮气

,

并最终造成总氮的去除

.a,d,e,f

所

代表的特征条带分别为

Bacillusmegaterium

strain,

Pseudomonas

sp.,unculturedbacterium

clone

和

Pseudomonaschloritidismutans

.

Pseudomonas

sp.

的细菌是异养硝化细菌和好

氧反硝化细菌的主要类郡

.

这些细菌可能是通

过接种的污泥带进反应器中

,

由于它们有较强

的适应能力而逐渐成为系统的优势菌群

.

表

4

SBR

反应器细菌

OTU

与

GenBank

数据库中最为

相似性

/%

2d

15d

30d

2d

100

47

1

62

42

1

86

15d30d

100

72100

接近的细菌种类

Table4

Mostcloselymatchedspeciesof6partial16SrDNA

sequencesinGeneBank

2

1

4

　测序结果分析

　　不同样品经过变性梯度凝胶电泳

(

DGGE

)

分离出数目不等的电泳条带

,

各个条带的信号

强度不同

.

根据

DGGE

对具有相同大小不同

DNA

序列片段分离原理

,

可以得知

3

个时期活

操作分

类单元

(

OTU

)

a

b

c

d

e

f

g

GenBank

数据库或筛选的硝化细菌

最为接近的细菌种类

Bacillusmegaterium

strain

相似

性

/%

98

100

100

99

100

97

95

wgy21

wgy5

Pseudomonas

111063.1

性污泥的

PCR

产物中含有十几种不同指纹条

带

,

每个独立分离的条带为

1

个操作分类单元

(

operationaltaxonomyunit,OTU

)

,

可能包括

1

种或

1

种以上的微生物种属

.

在反应器运行

UnculturedbacteriumcloneDQ469220

Pseudomonaschloritidismutans

AY017341

d5

过程中

,

不同时期的活性污泥微生物群落结构

和种群数量不同

.

　　对

DGGE

图谱上的

7

条主要条带分别进

行切割、

DNA

洗脱、回收、重新扩增和电泳检

测

.

对每个重新扩增条带进行纯化、连接、转化、

克隆

,

所有割胶条带都能找到与其相对应的阳

性克隆转化子

,

在

GenBank

数据库和筛选菌

16SrDNA

中找出与每条序列亲缘关系最近的

3

1

1

　在氨氧化培养基中经过

12d

的好氧培

3

　结　论

养

,6

株细菌的

COD

及

TN

浓度均呈现出降低

趋势

,6

株异养硝化菌对

COD

的去除率在

45%

以上

,

对氨氮和总氮最终去除率在

60%

以上

,

表明

6

株细菌具有良好的脱氮除碳性能

.

整个

试验期间

NO

2

-

2

N

和

NO

3

-

2

N

浓度变化较小

.

3

1

2

　从太平污水处理厂的曝气池和生物陶粒

菌

,

其结果见表

4.

反应器的整个运行阶段

,

筛

选的异养硝化细菌

wgy21

所代表的特征条带

在反应器运行到第

2d

消失

,

第

15dwgy21

所

代表的特征条带出现并逐渐富集

,

第

30d

wgy21

成为反应器中的优势菌群

.

异养硝化细

作为载体的好氧反硝化反应器中取得活性污泥

样品

,

采用

SBR

反应器对活性污泥样品进行

1

个月的驯化

,

从装置中共分离纯化得到

5

株高

效好氧反硝化细菌

,

分别为

f1

、

f2

、

f3

、

f5

、

f7,

其

对总氮的去除率分别为

90

1

4%

、

91

1

2%

、

菌

wgy5

所代表的特征条带始终是反应器中的

优势菌群

,

称为常驻菌群

.

好氧反硝化细菌

d5

在试验前期生物量较低

,

这主要是由于好氧反

690

浙江大学学报

(

农业与生命科学版

)

亮

,

李春杰

,

等

)

.

denitrificationand

第

33

卷　

Simultaneousnitrificationand

heterotrophicnitrificationin

94

1

6%

、

95

1

6%

、

97%,

表现出较好的总氮去除

能力

.

3

1

3

PCR

2

DGGE

图谱表明

,

在反应器运行的

不同时期

,

微生物群落结构发生动态演替

.2d

与

15d

的相似性为

47

1

62%,15d

与

30d

的相

似性最高为

72%,2d

与

30d

的相似性最低为

42

1

86%.

测序结果显示

,

在反应器稳定运行期

membranebioreactor[J].EnvironmentalScienceand

Technology(

环境科学与技术

),2006,29

(

1

)

:7

2

9,27.

(

inChinese

)

[7]

MoriyamaK,SatoK,HaradaY,

etal

.Simultaneous

biologicalremovalofnitrogenandphosphorususing

oxicanaerobicoxicprocess[J].

Technology,1990,22

(

78

)

:54

2

69.

[8]

PochanaK,ffactorsaffecting

simultaneousnitrificationanddenitrification

(

SND

)

[J].WaterScienceTechnology,1999,39

(

6

)

:55

2

71.

[9]

CasamayorEO,SchaferH,BanerasL,

etal

.

Identificationofspatiotemporaldifferencesbetween

microbialassemblagesfromtwoneighboringsulfurous

lakes:comparisonbymicroscopyanddenaturing

gradientgelelectrophoresis[J].AppliedEnvironmental

Microbiology,2000,66:499

2

508.

[10]

FerrisMJ,MuyzerG,ring

gradientgelelectrophoresisof16SrRNAdefined

populationsinhabitingahotspringmicrobialmat

community[J].AppliedEnvironmentalMicrobiology,

1996,62:340

2

346.

[11]

IwamoT,NakamuraK,SuzukiY,

etal

.Monitoring

impactof

insitu

WaterScience

间

,

筛选的异养硝化细菌

wgy5,wgy21,

好氧反

硝化细菌

d5

和

Pseudomonas

sp.

的细菌是系

统的优势菌群

.

References:

[1]

lvingconceptualmodelofthe

coastaleutrophicationproblem[J].MarineEcology

2

ProgressSeries,2001,210:223

2

253.

[2]

nmentalthreatsandenvironmental

futureofestuaries[J].EnvironmentalConservation,2002,

29:78

2

107.

[3]

RabalaisNN,TurnerRE,science

intopolicy:gulfofMexicohypoxiaandtheMississippi

River[J].BiologicalScience,2002,52:129

2

142.

[4]

ElisabethVM,PaulL,Jurg

nitrification

sequencing

and

batch

denitrification

reactors[J].

K.

in

Simultaneous

bench

Water

scale

Science

bio

2

stimulationtreatmenton

groundwaterbacterialcommunitybyDGGE[J].FEMS

MicrobiologyEcology,2000,32:137

2

14.

[12]

LiuWT,ChartOC,ial

communitydynamicsduringstaff

2

upofacidogenic

anaerobicreactors[J].WaterResource,2002,36:

3203

2

3210.

Technology,1996,30

(

2

)

:259

2

293.

[5]

MasudaS,WatanabeY,mproerties

andsimultaneousnitrificationanddenitrificationin

aerobicrotatingbiologicalcontactors[J].WaterScience

Technology,1991,23:1347

2

1369.

[6]

LINYan,HEYi

2

liang,LIChun

2

jie,

etal

.

(

林燕

,

何义