2024年4月21日发(作者：戢颖颖)
关于pEASY T载体
摘自<小木虫>科学卫士 论坛发言
pEASY-T1、T3从Invitrogen的pCRII而来，pEASY-T5 zero来自Invitrogen
的pCR4topo zero，Invitrogen已经换了抗生素，不用Amp + Kan， 新一代
载体用Kan + Zeocin (博来霉素）。 根据我们院校使用pEASY-T or B 的结果，
发现两个问题: 1) 白斑常常只能在一种抗生素中生长，而另一种抗生素中不长，
这些克隆是M13不能测序的污染质粒；如果Kan里生长，你可以试一试用T7
去测序，然后将序列拿到 NCBI 网上Blast 或者与 Transgen的网页上的所有
载体进行比对（Alignment，可以下载Genecode的 Sequencher 4 或 5
demo版本来做比对，非常好用，100个序列一眨眼就完成），你可能会发现他
们的污染是怎么来的、什么载体污染。
Transgen (全式金）的pEASY-T5 克隆区两侧测出来的序列与他们网上提供的序
列是完全不一样的，实际测出来的序列是pCR4blunt zero (美国英骏公司）的
克隆区序列，不知为什么要隐瞒，可其余序列100%与之相同啊？！另外，
pEASY-T5 zero中，用了ccdB基因，可ccdB本身在载体的UV5 Promoter
下不能抑制空载体生长（蓝斑），Invitrogen只是炒了个ccdB自杀基因的概念，
买了专利使用权限，有苦说不出，不好向股民交待。不信你拿Invitrogen的
pCR4topo zero, 或 pCRblunt zero, 用她的载体1ul, 用T4 DNA连接酶连接
（Vector 1 ul，10XT4 buffer 1 ul, H2O 7 ul, T4 DNA ligase 1 ul, 22度，2小
时），然后转化感受态，IPTG + X-gal 显示蓝白斑。你会发现大量蓝斑，因为载
体自连，LacZa 表达了，与LacZa 融合的ccdB也应该表达了，但不能压制
空载体（蓝斑菌落）。这种情况下，Invitrogen还在打什么“Zero Background’
岂不是有些欺骗科学界的意味？ Transgen的快速克隆试剂盒用的是英骏的第
一代拓扑异构酶技术，里面会有不少于10%的空载体，Invitrogen用Hind3酶
切后加识别接头，全式金只是改成EcoR1酶切后加接头。所以，我们用全式金
的载体试用装，用T4 连接酶自连过，居然有很多白斑，知道为什么吗？ 要想
零背景，您可以：
1）不用IPTG和X-Gal, 自然就全是白斑，--零背景了；
2）Not in-frame with LacZa, 让T载体自连也不会与LacZa的读码框一致；
2024年4月21日发(作者：戢颖颖)
关于pEASY T载体
摘自<小木虫>科学卫士 论坛发言
pEASY-T1、T3从Invitrogen的pCRII而来，pEASY-T5 zero来自Invitrogen
的pCR4topo zero，Invitrogen已经换了抗生素，不用Amp + Kan， 新一代
载体用Kan + Zeocin (博来霉素）。 根据我们院校使用pEASY-T or B 的结果，
发现两个问题: 1) 白斑常常只能在一种抗生素中生长，而另一种抗生素中不长，
这些克隆是M13不能测序的污染质粒；如果Kan里生长，你可以试一试用T7
去测序，然后将序列拿到 NCBI 网上Blast 或者与 Transgen的网页上的所有
载体进行比对（Alignment，可以下载Genecode的 Sequencher 4 或 5
demo版本来做比对，非常好用，100个序列一眨眼就完成），你可能会发现他
们的污染是怎么来的、什么载体污染。
Transgen (全式金）的pEASY-T5 克隆区两侧测出来的序列与他们网上提供的序
列是完全不一样的，实际测出来的序列是pCR4blunt zero (美国英骏公司）的
克隆区序列，不知为什么要隐瞒，可其余序列100%与之相同啊？！另外，
pEASY-T5 zero中，用了ccdB基因，可ccdB本身在载体的UV5 Promoter
下不能抑制空载体生长（蓝斑），Invitrogen只是炒了个ccdB自杀基因的概念，
买了专利使用权限，有苦说不出，不好向股民交待。不信你拿Invitrogen的
pCR4topo zero, 或 pCRblunt zero, 用她的载体1ul, 用T4 DNA连接酶连接
（Vector 1 ul，10XT4 buffer 1 ul, H2O 7 ul, T4 DNA ligase 1 ul, 22度，2小
时），然后转化感受态，IPTG + X-gal 显示蓝白斑。你会发现大量蓝斑，因为载
体自连，LacZa 表达了，与LacZa 融合的ccdB也应该表达了，但不能压制
空载体（蓝斑菌落）。这种情况下，Invitrogen还在打什么“Zero Background’
岂不是有些欺骗科学界的意味？ Transgen的快速克隆试剂盒用的是英骏的第
一代拓扑异构酶技术，里面会有不少于10%的空载体，Invitrogen用Hind3酶
切后加识别接头，全式金只是改成EcoR1酶切后加接头。所以，我们用全式金
的载体试用装，用T4 连接酶自连过，居然有很多白斑，知道为什么吗？ 要想
零背景，您可以：
1）不用IPTG和X-Gal, 自然就全是白斑，--零背景了；
2）Not in-frame with LacZa, 让T载体自连也不会与LacZa的读码框一致；