2024年4月23日发(作者：贡沛)
发酵科技通讯 第４１卷
响应面法优化谷氨酸温度敏感突变株生产Ｌ一谷氨酸
梁静波 郭 轩 张大龙 徐庆阳 谢希贤 陈 宁
（天津科技大学天津３００４５７）
摘要：采用响应面分析法对谷氨酸温度敏感突变株产生谷氨酸的培养基成分进行优化。首先
利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ试验设计筛选出影响谷氨酸产量的三个主要因素：糖蜜，玉米浆和ＭｇＳＯ 。在
此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域，再利用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计及响应面分析法进行回
归分析。通过求解回归方程得到最佳浓度：糖蜜３０．５９ｍｌ／Ｌ，玉米浆３３．８２ｍｌ／Ｌ，ＭｇＳＯ４２．９９ｇ／Ｌ，谷氨酸
产量理论最大值达８７．６８ｇ／Ｌ。经模型验证，预测值与验证试验平均值接近，在优化条件下谷氨酸产量
提高了２１．５％。
关键词：谷氨酸温度敏感突变株谷氨酸培养基优化 响应面法
Ｌ一谷氨酸是世界上第一大氨基酸产品，同时
１．１．２培养基
我国又是谷氨酸第一生产大国，在食品、医药、与
工业方面均有广泛的用途，尤其是在食品方面，是
制造味精的前体。谷氨酸温度敏感突变株具有耐
生物素、温度敏感的特点，要在较高温度下才能正
常产酸（一般为３７℃～４０ｏｃ）。良好的培养条件将有
利于挖掘菌株的发酵能力，最大程度地发挥菌株
的优势，所以寻找一个能使菌体生长良好而又产
酸高的发酵条件是必须的［ 。１
固体斜面培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１，牛肉膏１０，
蛋白胨１０，ＮａＣ１ ２．５，琼脂２０，ｐＨ７．０－７．２，１２１￣Ｃ，
２０ｍｉｎ。
种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖３０，玉米浆３０，豆浓
１０，酵母粉２，蛋白胨５，尿素０．５，ＫＨ２ＰＯ １，
ＭｇＳ０４０．５，蛋氨酸０．５，ＶＨ５００１ｘ／Ｌ，ＶＢｌ５００ Ｌ，
１２１℃，２０ｍｉｎ。
初始发酵培养基 Ｌ）：糖蜜２０ ｍｌ／Ｌ，玉米浆２０ｍｌ／
Ｌ，葡萄糖３Ｏｇ／Ｌ，豆饼水解液ｌＯｍｌ／Ｌ，
ＭｎＳ０４０．０３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４２ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ３０．０３ｇ／Ｌ，
发酵条件的优化是一个复杂的过程，涉及大
量的实验研究，是一个耗时、耗力、耗费的过程。
Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计和响应面法克服了传统的
单因素实验次数多、实验周期长和结果不准确等
缺点，已被成功地运用于培养基的优化工作中口］。
本研究拟采用响应面设计法对谷氨酸温度敏感突
变株产生谷氨酸的诸多因素进行考察和评价，对
筛选得到的重要因素进行优化，确定较优的产酸
条件，以期为后续谷氨酸温度敏感突变株工业化
ＦｅＳ０４０．０２ｇ／Ｌ，ＶＨ３０１３’ｔｘ／Ｌ，ＶＢｌ３００ ，１２１￣Ｃ，２０ｍｉｎ。
ｌＩ２方法
１．２．１培养条件
种子培养：接１环生长良好的斜面菌种于装
有３０ｍｌ液体种子培养基的５００ｍｌ三角瓶中，８
层纱布封口，３２ｃｃ，２００ｒｐｍ条件下摇瓶培养１４ｈ。
发酵培养：按１０％接种量将种子液接人装有
生产谷氨酸提供理论基础和实验依据。 ２０ｍｌ发酵培养基的５００ｍｌ三角瓶中，８层纱布封
口，３４℃，２００ｒｐｍ，当ＡＯＤ为０．７～０．８时将提高温
１材料和方法
１．１ 材料
度至３８．５℃，当ｐＨ降至７．０时，补加３００＃Ｌ尿素
溶液０．３ｍｌ／瓶，发酵培养３６ｈ。
１．２．２谷氨酸的测定
１．１．１ 菌种谷氨酸温度敏感突变株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ—
ｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ），天津科技大学代谢控制发酵
研究室保藏菌种。
采用ＳＢＡ一４０Ｃ多功能谷氨酸一葡萄糖分析仪
测定。
———一
第４１卷第２期
２０１２年４月 发酵科技通讯
１．３．３响应面分析法ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓ）
逼近最大产酸区域后，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设
ｌ－３实验设计
１．３．１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计
Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ（ＰＢ）设计法是一种近饱和的
２水平实验优化法，基于不完全平衡模块原理，它
可以用最少的试验次数使各因素的主效应得到尽
计法，对其关键因子进一步研究，每个因素取３个
水平，以（一１，０，１）编码。根据相应的实验表进行实
验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和
平方项的二次方程：
可能精确的估计，从众多考察因素中快速筛选出
最为重要的几个因素，以供进一步研究 ］。本实验
选用实验次数Ｎ＝１２的试验方法，以发酵培养基
的８种成分（糖蜜，玉米浆，葡萄糖，豆饼水解液，
ＭｎＳＯ ，ＭｇＳＯ４，Ｋ２ＨＰＯ３，ＦｅＳ０４）作为８个因素口
（Ｘｌ，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５，ｘ６，ｘ７，Ｘ８，Ｘ９，Ｘｌｏ），并设计２个空
Ｙ＝［３ｏ＋１３１Ｘ广卜ｐ２Ｘ ｐ ３＋ｐｌ２ＸｌＸ２＋ｐｌ３Ｘｌｘ ｐ２３Ｘ２Ｘ３＋
１３ｎＸｌ ＂｝－［￣２２Ｘ２２－｝－［３３３Ｘ３２
式中Ｙ为预测项最佳响应值，Ｂ为回归系
数，自变量Ｘ。、Ｘ 、Ｘ，，为主要影响因素。多项式模
型方程拟合的性质由确定系数Ｒ 表达，其统计学
上的显著性由Ｆ检验确定［６１。
白（Ｘ ，Ｘ９）作为误差分析项。每个因素取高（＋）低（一）
两个水平，响应值为谷氨酸产量，自变量、编码和
水平因素见表１。运用ＳＡＳ软件分别计算个因素
效应进行ｔ检验，选择置信度较高的因素作为显
著因素作进一步考察。
２结果与讨论
２．１ 应用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计试验筛选重要因
素
１－３．２最陡爬坡实验（ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ）
响应面拟合方程只在考察的紧接领域里才充
分近似真实情形，在其他区域，拟合方程与被近似
的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。因此要建
立有效的响应面方程，就必须逼近最大产酸区域。
根据１．３．１节Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计，自
变量编码和水平因素见表１，实验结果见图１。利
用ＳＡＳ软件对Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验结果进行方
差分析，结果见表２。Ｐｒ＞ｔ值的大小表明各个考察
因素的显著水平【７＇８１。．Ｐｒ＞ｔ值小于０．０５表明各因素
有显著影响，由表２可知，对谷氨酸产量有显著影
响的因素包括：糖蜜，玉米浆和ＭｇＳＯ ，选取这３
个影响因素进行最陡爬坡实验。
最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方
向，根据各因素效应值的大小确定变化步长能快
速、经济地逼近最大产酸区域。根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ—
Ｂｕｒｍａｎ法的结论，作最陡爬坡实验【５］。
表１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计
Ｔａｂｌｅ１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ
Ｒｔｉｎ
１
２
３
４
５
６
Ｘｌ
１
１
—１
１
１
ｌ
Ｘ２
—１
１
１
１
１
１
Ｘ３
１
１
１
１
１
１
（Ｘ ）
１
１
１
１
１
１
Ｘ５
１
１
１
１
１
ｌ
Ｘ６
１
１
１
１
１
１
Ｘ，
１
１
１
１
１
１
Ｘ８
１
１
１
１
１
１
（Ｘ。）
１
１
１
１
１
１
Ｘｌ０
１
１
１
１
１
１
产酸ｇｅＬ
８２
７６
５２
６２
８４
７７
７
８
—１
—１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
ｌ
１
６８
５５
９
１０
１１
１２
—１
１
—１
—１
１
１
１
１
ｌ
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
４８
７２
６４
４０
注：每次实验平行３次，结果取平均数
发酵科技通讯 ４ｌ
表２ Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验设计的因素水平及效应分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ａｓｓｉｇｎｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔ￣ｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｉｎ
Ｐ１ ａｃｋｅｔｔ－ＢＵｒｍａｎ
Ｆａｃｔｏｒ Ｌｅｖｅｌｓ
Ｃｏｄｅ ｇ／Ｌ或
ｍｌ／Ｌ Ｌｏｗ（
一
ｔ－ｔｅｓｔ
１） Ｈｉｇｈ（１）
Ｐｒ＞ｌｔｌＩ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
Ｘｌ
Ｘ２
Ｘ３
糖蜜
玉米浆
葡萄糖
空白
１０
１０
１０
５０
５０
５０
３１．５
ｌ５．５
３
１．５
０．０２０２０３
０．Ｏ４１０１５
０．２０４８３３
０．３７４３３４
木
术
ＮＳ
ＮＳ
Ｘ５
Ｘ６
豆饼水解液
ＭｎＳ０
１０
０．０１
５０
０．Ｏ５
—１
０．５
０．５
０．７０４８３３
ＮＳ
ＮＳ
Ｘ
Ｘ８
ＭｇＳＯ４
Ｋ２ＨＰＯ３
１
１
５
５
１７．５
６
０．０３６３３９
０．１０５１３７ ＮＳ
Ｘ９
Ｘｌ０
空白
ＦｅＳＯ４ ０．０１ Ｏ．０５
５
－４．５
０．１５５９５８
０．１３９２０９
ＮＳ
ＮＳ
Ｎｏｔｅ： ：Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ；ＮＳ：Ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．
２．２最陡爬坡实验
素效应大小比例设定其变化方向及步长进行实验，
设计及结果如表３所示。可见最优产酸条件在处理３
与处理４之间，故以处理３条件为后续实验中心点。
由Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验可知糖蜜，玉米浆和
ＭｇＳＯ 对于谷氨酸产量有显著影响，根据这３个因
表３最陡爬坡实验设计
Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ
Ｒｕｎ
１
糖蜜ｍｌ／Ｌ
１０
玉米浆ｍｌ／Ｌ
ｌ０
ＭｇＳＯ４ ｇ／Ｌ
１
产酸ｇ／Ｌ
４７
２ ２０ ２０ ２ ６ｌ
３ ３０ ３０ ３ ８２
４ ４０ ４０ ４ ７６
５ ５０ ５０ ５ ５４
２．３ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计及结果
Ｙ作为响应值，以糖蜜３０ｍｌ／Ｌ，玉米浆３０ｍｌ／Ｌ，
ＭｇＳＯ ３ｇ／Ｌ班为中心点实施响应面分析。实验设
根据Ｈａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ和最陡爬坡实验确定
的实验因素与水平，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ实验设计
三因素三水平的响应面分析实验，以谷氨酸产量
计及结果见表４。
—■■■
第４ｌ卷第２期
２０１２年４月 发酵科技通讯
表４ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计及结果
Ｔａｂｌｅ ４ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
糖蜜ｍ］／Ｌ 玉米浆ｍＩ／Ｌ ＭｇＳ０ａ ｅ／Ｌ 产酸
Ｒａｎ
Ｘｌ ＣｏｄｅＸｌ Ｘ２ ＣｏｄｅＸ， Ｘ３ ＣｏｄｅＸ ｅｇＬ
１ —１ ２０ —１ ２０ Ｏ ３ ６３
２ １ ４０ —１ ２０ ０ ３ ６８
３ 一ｌ ２０ １ ３０ ０ ３ ８１
４ １ ４０ １ ３０ ０ ３ ８０
５ —１ ２０ Ｏ ４０ 一ｌ ２ ７９
６ １ ４０ ０ ４０ —１ ２ ７７
７ —１ ２０ ０ ４０ １ ４ ７６
８ １ ４０ Ｏ ４０ １ ４ ８３
９ Ｏ ３０ —１ ２０ －１ ２ ６７
１０ ０ ３０ １ ３０ —１ ２ ８２
１１ ０ ３０ —１ ２０ １ ４ ６９
１２ ０ ３０ １ ３０ １ ４ ７９
ｌ３ ０ ３０ ０ ４０ ０ ３ ８６
１４ Ｏ ３０ ０ ４０ Ｏ ３ ８６
１５ Ｏ ３０ ０ ４０ Ｏ ３ ８７
运用ＳＡＳ软件响应面分析程序对１５组试验
的变化关系时，方程的Ｆ值为５１．８３６０８，大于Ｆ
的响应值进行回归分析，经过回归拟合，各试验 的概率（Ｐｒ＞Ｆ）为０．０００２１，说明该方程是显著的。
因子对响应值的影响可以用一下函数表示：
由模型的可信度分析表可知，该方程的决定系数
Ｙ１－－８６．３３３３３＋６８７５ＸｄｌＸ８７５Ｘｚ￣Ｏ．５Ｘ ｊ９１６６６７Ｘ１
Ｒ ＝９８．９４％，说明模型可以解释９８．９４％的实验所
１５ＸｉＸ １．２５ＸｌＸ １ ６６６７Ｘｚ２＋２．２５ＸｚＸ３－３．１ ６６６６７Ｘ３
得的谷氨酸产量变化，表明方程拟合良好。ＣＶ表
回归方程的方差分析及模型可信度分析结 示实验的精确度，ＣＶ值越低，实验的可靠性越
果见表５、表６。从回归方程的方差分析表中可以
高，本设计实验中ＣＶ＝Ｉ．６７３３８８，说明实验操作可
看出，用上述回归方程描述各因子与响应面之间 信。
表５回归方程的方差分析
Ｔａｂｌｅ ５ ＡＮＯＶＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ
方差来源 自由度 总偏差平方和 平均偏差平方和 Ｆ 概率＞Ｆ
Ｓｏｕｒｃｅ ｖａｒｉａｎｃｅ ＤＦ ＳＳ ＭＳ Ｐｒ＞Ｆ
模型 ９ ７８５．３ １６７ ８７．２５７４ｌ ５１．８３６０８ ０．０００２１
误差项 ５ ８．４１６６６７ １．６８３３３３
总和 １４ ７９３．７３３３
表６模型可信度分析
Ｔａｂｌｅ Ｆｉｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｙｌ
Ｍｅａｎ平均值 ７７．５３３３３
Ｒ－ｓｑｕａｒｅ决定系数 ９８．９４％
Ａｄｊ．Ｒ－ｓｑｕａｒｅ调整后的决定系数 ９７．Ｏ３％
ＲＭＳＥ模型误差平方根 １．２９７４３３
ＣＶ变异系数 １．６７３３８８
发酵科技通讯
第
得到最佳培养基配方。本实验筛选出的重要
优化研究ｆＪ１．食品科学，２００９，３０（７）：１０９—１１４．
４ ２ １ Ｏ
因子为糖蜜，玉米浆和ＭｇＳＯ ，确定谷氨酸发酵的
【４］Ｌｉｌｉａｎａ Ｒ，Ｇｒａｚｉｅｌｌａ Ｃ Ｚ，Ｎｉｃｃｉｌｏ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｆｏｒ ｏｉｌ：ｓｔｒａｉｎ
卷
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｕｔｄｏｏｒ ｍａｓｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
第年
最佳培养基为：糖蜜３０．５９ｍｌ／Ｌ，玉米浆３３．８２ｍｌ／Ｌ，
２ ４
ｉｎ ａ Ｉｏｗ—ｃｏｓｔ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ，２００９，１０２：
期月
葡萄糖３０ｇ／Ｌ，豆饼水解液１０ｍｌ／Ｌ，ＭｎＳＯ４０．０３ｇ／Ｌ，
１００一ｌ１２．
ＭｇＳＯ４２．９９ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ３０．０３ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４０．Ｏ２ｇ／Ｌ ＶＨ３ＯＯＩｘ／
［５］Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｄ Ｃ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．３ ｄ［Ｍ】．
Ｌ，ＶＢ１３００ｌｘ／ｄ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：】ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１，２１６－２４７．
［６］阮文兵，陈必钦，陈素华，等．响应面分析法优化（Ｒ）一扁桃酸发
参考文献：
酵培养基［Ｊ】．中国生物工程杂志，２０１０，３０（８）：１１２￣１１７．
［１】陈宁，彭飞，张克旭．Ｌ一谷氨酸温度敏感突变株的细胞融合育
［７】杨元营，李忠琴，许小平，等．基于ＳＡＳＶ８．１的黄嘌呤氧化酶产
种及发酵条件［Ｊ】．发酵科技通讯，２００２，（２３）：１０￣１２。
酶培养基的优化【Ｊ１．计算机与应用化学，２００８，２５（５）：６１１－６１４．
［８】熊志强，徐平，涂国全，等．利用响应面法优化红谷霉素发酵培
［２】陈宁，赵丽丽，张克旭．Ｌ一谷氨酸温度敏感突变株的选育［Ｊ】．生
养基［Ｊ１．微生物学通报，２００６，３３（４）：５￣９．
物技术通讯，２００２，１３（２）：１５２－１５４．
［９］宋萍，戚小灵，谢宁昌，等．响应面法优化枯草芽孢杆菌产脂肪
［３］谯顺彬，迟海洋，高振，等．螺旋藻混合营养培养基响应面法的
酶的合成培养基［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１０，３０（８）：１００￣１０５．
2024年4月23日发(作者：贡沛)
发酵科技通讯 第４１卷
响应面法优化谷氨酸温度敏感突变株生产Ｌ一谷氨酸
梁静波 郭 轩 张大龙 徐庆阳 谢希贤 陈 宁
（天津科技大学天津３００４５７）
摘要：采用响应面分析法对谷氨酸温度敏感突变株产生谷氨酸的培养基成分进行优化。首先
利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ试验设计筛选出影响谷氨酸产量的三个主要因素：糖蜜，玉米浆和ＭｇＳＯ 。在
此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域，再利用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计及响应面分析法进行回
归分析。通过求解回归方程得到最佳浓度：糖蜜３０．５９ｍｌ／Ｌ，玉米浆３３．８２ｍｌ／Ｌ，ＭｇＳＯ４２．９９ｇ／Ｌ，谷氨酸
产量理论最大值达８７．６８ｇ／Ｌ。经模型验证，预测值与验证试验平均值接近，在优化条件下谷氨酸产量
提高了２１．５％。
关键词：谷氨酸温度敏感突变株谷氨酸培养基优化 响应面法
Ｌ一谷氨酸是世界上第一大氨基酸产品，同时
１．１．２培养基
我国又是谷氨酸第一生产大国，在食品、医药、与
工业方面均有广泛的用途，尤其是在食品方面，是
制造味精的前体。谷氨酸温度敏感突变株具有耐
生物素、温度敏感的特点，要在较高温度下才能正
常产酸（一般为３７℃～４０ｏｃ）。良好的培养条件将有
利于挖掘菌株的发酵能力，最大程度地发挥菌株
的优势，所以寻找一个能使菌体生长良好而又产
酸高的发酵条件是必须的［ 。１
固体斜面培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１，牛肉膏１０，
蛋白胨１０，ＮａＣ１ ２．５，琼脂２０，ｐＨ７．０－７．２，１２１￣Ｃ，
２０ｍｉｎ。
种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖３０，玉米浆３０，豆浓
１０，酵母粉２，蛋白胨５，尿素０．５，ＫＨ２ＰＯ １，
ＭｇＳ０４０．５，蛋氨酸０．５，ＶＨ５００１ｘ／Ｌ，ＶＢｌ５００ Ｌ，
１２１℃，２０ｍｉｎ。
初始发酵培养基 Ｌ）：糖蜜２０ ｍｌ／Ｌ，玉米浆２０ｍｌ／
Ｌ，葡萄糖３Ｏｇ／Ｌ，豆饼水解液ｌＯｍｌ／Ｌ，
ＭｎＳ０４０．０３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４２ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ３０．０３ｇ／Ｌ，
发酵条件的优化是一个复杂的过程，涉及大
量的实验研究，是一个耗时、耗力、耗费的过程。
Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计和响应面法克服了传统的
单因素实验次数多、实验周期长和结果不准确等
缺点，已被成功地运用于培养基的优化工作中口］。
本研究拟采用响应面设计法对谷氨酸温度敏感突
变株产生谷氨酸的诸多因素进行考察和评价，对
筛选得到的重要因素进行优化，确定较优的产酸
条件，以期为后续谷氨酸温度敏感突变株工业化
ＦｅＳ０４０．０２ｇ／Ｌ，ＶＨ３０１３’ｔｘ／Ｌ，ＶＢｌ３００ ，１２１￣Ｃ，２０ｍｉｎ。
ｌＩ２方法
１．２．１培养条件
种子培养：接１环生长良好的斜面菌种于装
有３０ｍｌ液体种子培养基的５００ｍｌ三角瓶中，８
层纱布封口，３２ｃｃ，２００ｒｐｍ条件下摇瓶培养１４ｈ。
发酵培养：按１０％接种量将种子液接人装有
生产谷氨酸提供理论基础和实验依据。 ２０ｍｌ发酵培养基的５００ｍｌ三角瓶中，８层纱布封
口，３４℃，２００ｒｐｍ，当ＡＯＤ为０．７～０．８时将提高温
１材料和方法
１．１ 材料
度至３８．５℃，当ｐＨ降至７．０时，补加３００＃Ｌ尿素
溶液０．３ｍｌ／瓶，发酵培养３６ｈ。
１．２．２谷氨酸的测定
１．１．１ 菌种谷氨酸温度敏感突变株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ—
ｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ），天津科技大学代谢控制发酵
研究室保藏菌种。
采用ＳＢＡ一４０Ｃ多功能谷氨酸一葡萄糖分析仪
测定。
———一
第４１卷第２期
２０１２年４月 发酵科技通讯
１．３．３响应面分析法ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓ）
逼近最大产酸区域后，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设
ｌ－３实验设计
１．３．１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计
Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ（ＰＢ）设计法是一种近饱和的
２水平实验优化法，基于不完全平衡模块原理，它
可以用最少的试验次数使各因素的主效应得到尽
计法，对其关键因子进一步研究，每个因素取３个
水平，以（一１，０，１）编码。根据相应的实验表进行实
验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和
平方项的二次方程：
可能精确的估计，从众多考察因素中快速筛选出
最为重要的几个因素，以供进一步研究 ］。本实验
选用实验次数Ｎ＝１２的试验方法，以发酵培养基
的８种成分（糖蜜，玉米浆，葡萄糖，豆饼水解液，
ＭｎＳＯ ，ＭｇＳＯ４，Ｋ２ＨＰＯ３，ＦｅＳ０４）作为８个因素口
（Ｘｌ，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５，ｘ６，ｘ７，Ｘ８，Ｘ９，Ｘｌｏ），并设计２个空
Ｙ＝［３ｏ＋１３１Ｘ广卜ｐ２Ｘ ｐ ３＋ｐｌ２ＸｌＸ２＋ｐｌ３Ｘｌｘ ｐ２３Ｘ２Ｘ３＋
１３ｎＸｌ ＂｝－［￣２２Ｘ２２－｝－［３３３Ｘ３２
式中Ｙ为预测项最佳响应值，Ｂ为回归系
数，自变量Ｘ。、Ｘ 、Ｘ，，为主要影响因素。多项式模
型方程拟合的性质由确定系数Ｒ 表达，其统计学
上的显著性由Ｆ检验确定［６１。
白（Ｘ ，Ｘ９）作为误差分析项。每个因素取高（＋）低（一）
两个水平，响应值为谷氨酸产量，自变量、编码和
水平因素见表１。运用ＳＡＳ软件分别计算个因素
效应进行ｔ检验，选择置信度较高的因素作为显
著因素作进一步考察。
２结果与讨论
２．１ 应用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计试验筛选重要因
素
１－３．２最陡爬坡实验（ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ）
响应面拟合方程只在考察的紧接领域里才充
分近似真实情形，在其他区域，拟合方程与被近似
的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。因此要建
立有效的响应面方程，就必须逼近最大产酸区域。
根据１．３．１节Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计，自
变量编码和水平因素见表１，实验结果见图１。利
用ＳＡＳ软件对Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验结果进行方
差分析，结果见表２。Ｐｒ＞ｔ值的大小表明各个考察
因素的显著水平【７＇８１。．Ｐｒ＞ｔ值小于０．０５表明各因素
有显著影响，由表２可知，对谷氨酸产量有显著影
响的因素包括：糖蜜，玉米浆和ＭｇＳＯ ，选取这３
个影响因素进行最陡爬坡实验。
最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方
向，根据各因素效应值的大小确定变化步长能快
速、经济地逼近最大产酸区域。根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ—
Ｂｕｒｍａｎ法的结论，作最陡爬坡实验【５］。
表１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计
Ｔａｂｌｅ１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ
Ｒｔｉｎ
１
２
３
４
５
６
Ｘｌ
１
１
—１
１
１
ｌ
Ｘ２
—１
１
１
１
１
１
Ｘ３
１
１
１
１
１
１
（Ｘ ）
１
１
１
１
１
１
Ｘ５
１
１
１
１
１
ｌ
Ｘ６
１
１
１
１
１
１
Ｘ，
１
１
１
１
１
１
Ｘ８
１
１
１
１
１
１
（Ｘ。）
１
１
１
１
１
１
Ｘｌ０
１
１
１
１
１
１
产酸ｇｅＬ
８２
７６
５２
６２
８４
７７
７
８
—１
—１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
ｌ
１
６８
５５
９
１０
１１
１２
—１
１
—１
—１
１
１
１
１
ｌ
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
４８
７２
６４
４０
注：每次实验平行３次，结果取平均数
发酵科技通讯 ４ｌ
表２ Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验设计的因素水平及效应分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ａｓｓｉｇｎｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔ￣ｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｉｎ
Ｐ１ ａｃｋｅｔｔ－ＢＵｒｍａｎ
Ｆａｃｔｏｒ Ｌｅｖｅｌｓ
Ｃｏｄｅ ｇ／Ｌ或
ｍｌ／Ｌ Ｌｏｗ（
一
ｔ－ｔｅｓｔ
１） Ｈｉｇｈ（１）
Ｐｒ＞ｌｔｌＩ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
Ｘｌ
Ｘ２
Ｘ３
糖蜜
玉米浆
葡萄糖
空白
１０
１０
１０
５０
５０
５０
３１．５
ｌ５．５
３
１．５
０．０２０２０３
０．Ｏ４１０１５
０．２０４８３３
０．３７４３３４
木
术
ＮＳ
ＮＳ
Ｘ５
Ｘ６
豆饼水解液
ＭｎＳ０
１０
０．０１
５０
０．Ｏ５
—１
０．５
０．５
０．７０４８３３
ＮＳ
ＮＳ
Ｘ
Ｘ８
ＭｇＳＯ４
Ｋ２ＨＰＯ３
１
１
５
５
１７．５
６
０．０３６３３９
０．１０５１３７ ＮＳ
Ｘ９
Ｘｌ０
空白
ＦｅＳＯ４ ０．０１ Ｏ．０５
５
－４．５
０．１５５９５８
０．１３９２０９
ＮＳ
ＮＳ
Ｎｏｔｅ： ：Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ；ＮＳ：Ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．
２．２最陡爬坡实验
素效应大小比例设定其变化方向及步长进行实验，
设计及结果如表３所示。可见最优产酸条件在处理３
与处理４之间，故以处理３条件为后续实验中心点。
由Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验可知糖蜜，玉米浆和
ＭｇＳＯ 对于谷氨酸产量有显著影响，根据这３个因
表３最陡爬坡实验设计
Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ
Ｒｕｎ
１
糖蜜ｍｌ／Ｌ
１０
玉米浆ｍｌ／Ｌ
ｌ０
ＭｇＳＯ４ ｇ／Ｌ
１
产酸ｇ／Ｌ
４７
２ ２０ ２０ ２ ６ｌ
３ ３０ ３０ ３ ８２
４ ４０ ４０ ４ ７６
５ ５０ ５０ ５ ５４
２．３ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计及结果
Ｙ作为响应值，以糖蜜３０ｍｌ／Ｌ，玉米浆３０ｍｌ／Ｌ，
ＭｇＳＯ ３ｇ／Ｌ班为中心点实施响应面分析。实验设
根据Ｈａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ和最陡爬坡实验确定
的实验因素与水平，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ实验设计
三因素三水平的响应面分析实验，以谷氨酸产量
计及结果见表４。
—■■■
第４ｌ卷第２期
２０１２年４月 发酵科技通讯
表４ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计及结果
Ｔａｂｌｅ ４ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
糖蜜ｍ］／Ｌ 玉米浆ｍＩ／Ｌ ＭｇＳ０ａ ｅ／Ｌ 产酸
Ｒａｎ
Ｘｌ ＣｏｄｅＸｌ Ｘ２ ＣｏｄｅＸ， Ｘ３ ＣｏｄｅＸ ｅｇＬ
１ —１ ２０ —１ ２０ Ｏ ３ ６３
２ １ ４０ —１ ２０ ０ ３ ６８
３ 一ｌ ２０ １ ３０ ０ ３ ８１
４ １ ４０ １ ３０ ０ ３ ８０
５ —１ ２０ Ｏ ４０ 一ｌ ２ ７９
６ １ ４０ ０ ４０ —１ ２ ７７
７ —１ ２０ ０ ４０ １ ４ ７６
８ １ ４０ Ｏ ４０ １ ４ ８３
９ Ｏ ３０ —１ ２０ －１ ２ ６７
１０ ０ ３０ １ ３０ —１ ２ ８２
１１ ０ ３０ —１ ２０ １ ４ ６９
１２ ０ ３０ １ ３０ １ ４ ７９
ｌ３ ０ ３０ ０ ４０ ０ ３ ８６
１４ Ｏ ３０ ０ ４０ Ｏ ３ ８６
１５ Ｏ ３０ ０ ４０ Ｏ ３ ８７
运用ＳＡＳ软件响应面分析程序对１５组试验
的变化关系时，方程的Ｆ值为５１．８３６０８，大于Ｆ
的响应值进行回归分析，经过回归拟合，各试验 的概率（Ｐｒ＞Ｆ）为０．０００２１，说明该方程是显著的。
因子对响应值的影响可以用一下函数表示：
由模型的可信度分析表可知，该方程的决定系数
Ｙ１－－８６．３３３３３＋６８７５ＸｄｌＸ８７５Ｘｚ￣Ｏ．５Ｘ ｊ９１６６６７Ｘ１
Ｒ ＝９８．９４％，说明模型可以解释９８．９４％的实验所
１５ＸｉＸ １．２５ＸｌＸ １ ６６６７Ｘｚ２＋２．２５ＸｚＸ３－３．１ ６６６６７Ｘ３
得的谷氨酸产量变化，表明方程拟合良好。ＣＶ表
回归方程的方差分析及模型可信度分析结 示实验的精确度，ＣＶ值越低，实验的可靠性越
果见表５、表６。从回归方程的方差分析表中可以
高，本设计实验中ＣＶ＝Ｉ．６７３３８８，说明实验操作可
看出，用上述回归方程描述各因子与响应面之间 信。
表５回归方程的方差分析
Ｔａｂｌｅ ５ ＡＮＯＶＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ
方差来源 自由度 总偏差平方和 平均偏差平方和 Ｆ 概率＞Ｆ
Ｓｏｕｒｃｅ ｖａｒｉａｎｃｅ ＤＦ ＳＳ ＭＳ Ｐｒ＞Ｆ
模型 ９ ７８５．３ １６７ ８７．２５７４ｌ ５１．８３６０８ ０．０００２１
误差项 ５ ８．４１６６６７ １．６８３３３３
总和 １４ ７９３．７３３３
表６模型可信度分析
Ｔａｂｌｅ Ｆｉｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｙｌ
Ｍｅａｎ平均值 ７７．５３３３３
Ｒ－ｓｑｕａｒｅ决定系数 ９８．９４％
Ａｄｊ．Ｒ－ｓｑｕａｒｅ调整后的决定系数 ９７．Ｏ３％
ＲＭＳＥ模型误差平方根 １．２９７４３３
ＣＶ变异系数 １．６７３３８８
发酵科技通讯
第
得到最佳培养基配方。本实验筛选出的重要
优化研究ｆＪ１．食品科学，２００９，３０（７）：１０９—１１４．
４ ２ １ Ｏ
因子为糖蜜，玉米浆和ＭｇＳＯ ，确定谷氨酸发酵的
【４］Ｌｉｌｉａｎａ Ｒ，Ｇｒａｚｉｅｌｌａ Ｃ Ｚ，Ｎｉｃｃｉｌｏ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｆｏｒ ｏｉｌ：ｓｔｒａｉｎ
卷
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｕｔｄｏｏｒ ｍａｓｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
第年
最佳培养基为：糖蜜３０．５９ｍｌ／Ｌ，玉米浆３３．８２ｍｌ／Ｌ，
２ ４
ｉｎ ａ Ｉｏｗ—ｃｏｓｔ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ，２００９，１０２：
期月
葡萄糖３０ｇ／Ｌ，豆饼水解液１０ｍｌ／Ｌ，ＭｎＳＯ４０．０３ｇ／Ｌ，
１００一ｌ１２．
ＭｇＳＯ４２．９９ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ３０．０３ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４０．Ｏ２ｇ／Ｌ ＶＨ３ＯＯＩｘ／
［５］Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｄ Ｃ．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．３ ｄ［Ｍ】．
Ｌ，ＶＢ１３００ｌｘ／ｄ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：】ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１，２１６－２４７．
［６］阮文兵，陈必钦，陈素华，等．响应面分析法优化（Ｒ）一扁桃酸发
参考文献：
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