2024年5月9日发(作者：谭思菱)
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定
原理
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生
物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的
自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化
损伤方面起着重要作用。离子(0
2
-
)是人体氧代谢产物，它在体内过量
积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物
体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子
-
(O
2
)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应
用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌
金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植
物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D
酶蛋白的分子量约为3.2×10
4
，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚
基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含
有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子
(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的
叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽
链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近
来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品
呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有
一个Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐
化酶。 自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，
即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类
和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻
类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓
宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目
前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点
聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合
-
物在自氧化过程中会产生有色中间物和O
2
，利用SOD分解而间接
推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚
法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte
还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发
光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反
应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。
但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。
亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD
测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，
操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较
好的测定方法之一。
在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本
实验采用邻苯三酚自氧化方法。
-
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O
2
，生成带色
的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小
时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测
定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～
45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，
中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能
-
催化O
2
与H
+
结合生成O
2
和H
2
O
2
，从而阻止了中间产物的积累，因
此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分
钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
方法和步骤
1、从猪血中提取SOD
（1）分离血球
取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗
凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红
血球。
（2）除血红蛋白
红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复
三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血
30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和
0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4
000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取上清液，过滤，收集
滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
（3）热变性
上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3
000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活
性和蛋白浓度）。
（4）沉淀
上清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5
倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，
迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4
2024年5月9日发(作者：谭思菱)
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定
原理
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生
物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的
自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化
损伤方面起着重要作用。离子(0
2
-
)是人体氧代谢产物，它在体内过量
积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物
体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子
-
(O
2
)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应
用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌
金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植
物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D
酶蛋白的分子量约为3.2×10
4
，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚
基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含
有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子
(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的
叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽
链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近
来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品
呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有
一个Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐
化酶。 自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，
即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类
和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻
类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓
宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目
前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点
聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合
-
物在自氧化过程中会产生有色中间物和O
2
，利用SOD分解而间接
推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚
法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte
还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发
光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反
应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。
但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。
亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD
测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，
操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较
好的测定方法之一。
在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本
实验采用邻苯三酚自氧化方法。
-
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O
2
，生成带色
的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小
时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测
定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～
45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，
中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能
-
催化O
2
与H
+
结合生成O
2
和H
2
O
2
，从而阻止了中间产物的积累，因
此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分
钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
方法和步骤
1、从猪血中提取SOD
（1）分离血球
取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗
凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红
血球。
（2）除血红蛋白
红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复
三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血
30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和
0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4
000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取上清液，过滤，收集
滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
（3）热变性
上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3
000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活
性和蛋白浓度）。
（4）沉淀
上清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5
倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，
迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4