2024年10月7日发(作者：端木如冬)
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第３期
・
临床论著・
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－０２６４．２０１０．０３．００２
干扰素一 基因＋８７４位点及肿瘤坏死因子一
基因一２３８位点单核苷酸多态性与
ＨＢＶ宫内感染相关性研究
林巧 刘晋洪。 吴其恺 高 洁 陈家建 万学信 聂 广 杨大国
１．深圳宝安慢性病防治院肝病科（广东深圳，５１８１３３） ２．深圳市东湖医院３．深圳市妇幼保健院
摘要 目的：研究ＩＦＮ一＿ｙ＋８７４位点Ｔ／Ａ以及ＴＮＦ—ｏｔ一２３８位点Ｇ／Ａ的单核苷酸多态性与ＨＢＶ宫内感染的相关
性。方法：采集ＨＢＶ标记物单项或多项阳性孕妇的外周血，提取基因组ＤＮＡ，根据新生儿是否感染ＨＢＶ将孕妇分为
宫内感染组和对照组。利用等位基因特异性ＰＣＲ检测ＩＦＮ一 ＋８７４位点等位基因型，利用ＰＣＲ．ＲＦＩＪＰ方法检测ＴＮＦ—
一
２３８位点等位基因型。结果：等位基因特异性ＰＣＲ可以准确判断ＩＦＮ． ＋８７４位点等位基因型，对照组ＩＦＮ一 ＋８７４
位点等位基因频率Ａ为０．５６２，Ｔ为０．４３８，而宫内感染组Ａ为０．７３８，Ｔ为０．２６２，两组之间的差异具有统计学意义
（ ＝４．３８，Ｐ＝０．０３６）。ＴＮＦ—ｅｔ一２３８位点等位基因型的检测可以使用ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法，对照组ＴＮＦ—ｄ一２３８位点等位
基因频率Ａ为０．１４６，Ｇ为０．８５４，宫内感染组Ａ为０．２６２，Ｇ为０．７３８，两组之间的差异无统计学意义（ ＝３．２６，Ｐ
＝
０．０７１）。结论：ＩＦＮ一 ＋８７４位点Ｔ／Ａ等位基因与ＨＢＶ宫内感染具有一定相关性，Ｔ等位基因对胎儿ＨＢＶ宫内感染
具有防护作用。ＴＮＦ—ｏｔ一２３８位点Ｇ／Ａ等位基因型与ＨＢＶ宫内感染的关系尚不明确。
关键词干扰素一 ；肿瘤坏死因子一ｏｔ；单核苷酸多态性；肝炎病毒，乙型；宫内感染
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ＋８７４
ｓｉｔｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ——２３ ８ ｓｉｔｅ ｗｉｔｈ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ＬＩＮ Ｑ１ＡＯ１．ＨＵ ＪＩＮ—ＨＯＮＧｌ，ＷＵ Ｑｌ一１６１１２，ｅｔ ａ１．Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｂａｏａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｐｒ￣ｅｍｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｒｅ Ｓｈｅｎｚ－
ｈｅｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，５１８１３３）Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ＩＦＮ一 ＋８７４ ｓｉｔｅ ａｎｄ ＴＮＦ—ｏｔ一２３８
ｓｉｔｅ ｗｉｔｈ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｏ ｃｏｌｌｅｃｔ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ＨＢＶ ｉｆｅｃｔｉｎｏｎ，ａｎｄ
ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ２ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ
ＨＢＶ．Ｔｈｅ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ＩＦＮ一－ｙ＋８７４ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ｂｙ ａｌｌｆｅｌｅ—ｓｐｅｃｉｉｃ ＰＣＲ，ｍｅａｎｗｈｉｆｌｅ，ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ＴＮＦ—ｏｔ一２３８ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｂｙ ＰＣＲ—ＲＦＬＰ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉｔ ｗａｓ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉ￣ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ＩＦＮ一 ＋８７４ ｓｉｔｅ ｂｙ ｌａｌｅｌｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＰＣＲ，ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ＩＦＮ一
＾Ｙ＋８７４ ｓｉｔｅ ｗｅｒｅ ０．５６２（Ａ）ａｎｄ ０．４３８（Ｔ）ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（ ＝４．３８，Ｐ＝０．０３６）
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｆｅｃｔｎｉｏｎ ｒｏｕｐ ｇｗｉｔｈ ０．７３８（Ａ）ａｎｄ ０．２６２（Ｔ）．ＰＣＲ—ＲＦＬＰ ｗａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｌａｌｅｌｅ
ｏｆ ＴＮＦ．ｏｔ一２３８ ｓｉｔｅ，ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ ２＝３．２６，Ｐ＝０．０７１）ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｌｌａｅｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ＴＮＦ一 一２３８ ｓｉｔｅ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ０．１４６（Ａ）ａｎｄ ０．８５４（Ｇ）ａｎｄ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ０．２６２（Ａ）ａｎｄ ０．７３８（Ｇ）．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｌｌｅｌｅ Ｔ／Ａ ｏｆ ＩＦＮ一 ＋８７４ ｓｉｔｅ ａｎｄ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｔ ａｌｌｅｌｅ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｌｌｅｌｅ Ｇ／Ａ ｏｆ ＴＮＦ— 一２３８ ｓｉｔｅ ａｎｄ
ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｆｅｃｔｉｎｏｎ ｉｓ ｎｏｔ ｏｂｖｉｏｕｓ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—ｇａｍｍａ；ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ—ａｌｐｈａ；ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｂ；ｉｎｔｒａｕ—
ｔｅｒｉｎｅ ｉｆｅｃｔｎｉｏｎ
基金项目：深圳市宝安科技计划项目（Ｎｏ．２００８１４９）；Ａ通讯作者
・
’１３２・
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第３期
母婴垂直传播是ＨＢＶ传播的重要途径，自从乙
型肝炎疫苗纳入计划免疫管理以来，对于高危新生儿
即ＨＢｓＡｇ阳性孕妇所生婴儿，采取主、被动联合免
疫的阻断效果约为９０％，但仍有５％～１０％婴儿免疫
酸多态性，该反应所需要的引物见表１，其中包括两
条ｒｒ／Ａ等位基因特异性正向引物，１条ＩＦＮ－ 反向引
物，还有１对用于扩增人垂体生长激素基因的内参对
照引物。每个ＤＮＡ样本使用两对等位基因特异性引
阻断失败，其主要原因就是ＨＢＶ宫内感染¨Ｊ。ＨＢＶ
物分别进行两次ＰＣＲ反应。ＰＣＲ反应体系为２０ｐＪ，
宫内感染是指妊娠期ＨＢＶ侵入胎儿肝细胞并复制，
使胎儿在宫内即被感染。目前国内外学者 对ＨＢＶ
宫内感染的机制进行了广泛研究，并筛选出一些引起
ＨＢＶ宫内感染的危险因素，如孕妇ＨＢｅＡｇ阳性、
ＨＢＶ ＤＮＡ阳性、先兆早产、先兆流产等，但其确切
机制尚未完全阐明。近年来研究发现多种非遗传性疾
病（如变应性鼻炎、利什曼原虫感染等）均存在遗
传背景，从而导致不同个体对疾病易感性、疗效和预
后存在差异，而单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）是遗传背景多样性的重要表现
形式＿４ ｊ。本研究选取与ＨＢＶ清除密切相关的细胞
因子干扰素－ （ＩＦＮ一 ）、肿瘤坏死因子一ＯＬ（ＴＮＦ一仅），
分析ＩＦＮ一＾ｙ＋８７４位点Ｔ／Ａ以及ＴＮＦ—ｄ一２３８位点Ｇ／
Ａ的单核苷酸多态性与ＨＢＶ宫内感染的相关性。
１资料与方法
１．１ 一般资料搜集２００８年３月一２００９年８月期间
在深圳市东湖医院、深圳市妇幼保健院及深圳宝安慢
性病防治院随访的ＨＢＶ标记物（如ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、
ＨＢＶ ＤＮＡ等）单项或多项阳性的孕妇２２３例，并追
踪至胎儿分娩，根据胎儿是否发生宫内感染将孕妇分
为对照组和宫内感染组。宫内感染的诊断标准依据文
献报道，即新生儿期外周血ＨＢｓＡｇ和（或）ＨＢｅＡｇ
阳性为现行感染标志，如果抗一ＨＢｅ和（或）抗一ＨＢｃ
阳性表示曾发生宫内感染，现在处于恢复期或自然好
转。本组资料中发生ＨＢＶ宫内感染的孕妇共２１例，
发生率９．４％，平均年龄（２８．２６±１１．０４）岁，对照
组中孕妇２０２例，平均年龄（２６．５７±１０．９５）岁。
１．２基因组ＤＮＡ提取抽取孕妇空腹静脉血３ｍｌ，
使用２．５％ＥＤＴＡ抗凝。基因组ＤＮＡ抽提使用基因
组ＤＮＡ小量提取试剂盒（德国Ｑｉａｇｅｎ公司），操作
方法按照试剂盒说明书进行。基因组ＤＮＡ用灭菌水
溶解后一２０￣Ｃ保存。宫内感染组２１例孕妇均获得基
因组ＤＮＡ样本，对照组中由于部分孕妇拒绝参与本
项研究，或者部分孕妇的基因组ＤＮＡ提取失败，仅
获得８９份样本。
１．３ ＩＦＮ． ＋８７４位点Ｔ／Ａ单核苷酸多态性检测 参
照国外文献报道 ，采用等位基因特异性ＰＣＲ（ａｌ－
ｌｅｌｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＰＣＲ）检测ＩＦＮ． ＋８７４位点Ｔ／Ａ单核苷
其中包括ＤＮＡ模板５０～１００ｎｇ，ｄＮＴＰ ２００ｔ．ｚｍｏｌ／Ｌ，
１０×ＰＣＲ缓冲液２１ｘｌ，１对等位基因特异性引物各
５￣ｍｏＵＬ，１对内参引物各０．５ ｍ０ｌ／，Ｌ。ＰＣＲ反应条
件为：９４℃预变性５分钟，随后按９４℃３０秒、６０℃
５Ｏ秒、７２ｑＣ ４０秒循环３０次，最后７２℃延伸５分钟。
ＰＣＲ反应完成后，用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测扩增
产物。
１．４ ＴＮＦ一 一２３８位点Ｇ／Ａ单核苷酸多态性检测
ＴＮＦ—ｏ【一２３８位点Ｇ／Ａ单核苷酸多态性的检测使用
ＰＣＲ结合限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）技术 。利用表１中
ＴＮＦ— 特异性正、反向引物进行ＰＣＲ扩增，反应体
系为２０ｔｚｌ，其中包括ＤＮＡ模板５０～１００ｎｇ，ｄＮＴＰ
２００ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ，１０×ＰＣＲ缓冲液２１，ｚｌ，正、反向引物各
５￣ｍｏＵＬ。ＰＣＲ反应条件为：９４￣Ｃ预变性５分钟，随
后按９４℃３０秒、５８￣Ｃ ３０秒、 ７２℃３０秒循环３０次，
最后７２＂１２延伸５分钟。ＰＣＲ反应完成后，用２．０％琼
脂糖凝胶电泳检测扩增产物。取ＰＣＲ产物１０ ，使
用１０Ｕ ＭｓｐＩ限制性内切酶３７℃酶切１２小时，之后使
用２．０％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
表１检测ＩＦＮ一＾ｒ＋８７４位点Ｔ／Ａ和 ＩＴＮＦ—ｏｔ一２３８
位点Ｇ／Ａ单核苷酸多态性所用引物
引物名称 引物序列（５’－３’）
Ｔ特异性正向引物
ＴＩ℃ＴｒＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴ
Ａ特异性正向引物
ＴＩ℃ＴＴＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡ Ｉ℃Ａ
ＩＦＮ－ 反向引物
ＴＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＴＡＣ Ｉ℃ＣＡ
内参正向引物
ＧＣＣ１ＴＣＣＣＡＡＣＣＡ Ｉ’Ｉ℃ＣＣＴｒＡ
内参反向引物
ＴＮＦ．Ⅱ一２３８位点Ｇ／Ａ
ＴＮＦ—ｏｔ正向引物
ＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＣＧＧＡＡＣＣ
ｒＮＦ一０【反向引物
ＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴＡＧＴＧ
１．５统计学方法统计分析使用ＳＰＳＳ １１．０软件，
分类变量使用 检验，Ｐ＜０．０５（双侧检验）认为
有统计学意义。
２ 结果
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第３期
２．１ ＩＦＮ一 ＋８７４位点ｒｒ／Ａ等位基因特异性ＰＣＲ方
法的建立每份基因组ＤＮＡ样本在使用两对等位基
因特异性引物进行两次ＰＣＲ反应后，可以出现３种
不同情况，１Ｔｒ正常纯合子仅能使用Ａ等位基因特异
性引物扩增获得２６４ｂｐ片段；ＡＡ突变纯合子仅能使
用Ｔ等位基因特异性引物获得２６４ｂｐ片段；而ＡＴ杂
合子则使用两种等位基因特异性引物均可以获得目的
片段（图１）。由于每轮ＰＣＲ反应中均含有内参引物
用于评价整个反应体系，所以产物中包括４２９ｂｐ长度
的阳性对照片段。
图１ ＩＦＮ－．ｙ＋８７４位点Ｔ／Ａ等位基因特异性ＰＣＲ
产物琼脂糖凝胶电泳图
ａ使用Ｔ等位基因特异性引物；ｂ．使用Ａ等位基因特异性引物
２．２ ＩＦＮ一 ＋８７４位点基因型数量及Ｔ／Ａ等位基因分
布频率表２显示对照组和宫内感染组孕妇中ＡＡ突
变纯合子的数量最多，分别为４０．４％（３６／８９）和
６１．９％（１３／２１），对照组ＩＦＮ－＾ｙ＋８７４位点Ｔ／Ａ等位
基因频率Ａ为０．５６２，Ｔ为０．４３８，而宫内感染组Ａ
等位基因频率为０．７３８，Ｔ为０．２６２，两组之间的差
异具有统计学意义（ ＝４．３８，Ｐ＝０．０３６）。
表２ ＩＦＮ一．ｙ＋８７４位点基因型数量及Ｔ／Ａ等位基因分布频率
与对照组比较， Ｐ＜０．０５
２．３ ＴＮＦ—ｏ【一２３８位点Ｇ／Ａ等位基因ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方
法的建立 由于在ＴＮＦ． 正向引物一２４０位点引入Ｔ
—ｃ突变，在ＧＧ正常纯合子的ＰＣＲ产物中引入Ｍｓｐ
Ｉ酶切位点，产物可以发生完全酶切，产生１３３ｂｐ和
１９ｂｐ两条片段；而ＡＡ突变纯合子ＰＣＲ产物则缺少
・
ｌ３３・
该酶切位点，Ｍｓｐ Ｉ不能发生酶切，仅出现１５２ｂｐ １
条片段；ＡＧ杂合子在酶切后应该出现１５２ｂｐ、１３３ｂｐ
和１９ｂｐ共３条片段。由于１９ｂｐ片段较小，电泳过程
中容易丢失，所以本研究仅通过１５２ｂｐ和１３３ｂｐ两条
片段进行等位基因的判断（图２）。
２５０ｂｐ
１ＯＯｂｐ
图２ ＴＮＦ—ｄ一２３８位点Ｇ／Ａ等位基因ＰＣＲ—ＲＦＬＰ
产物琼脂糖凝胶电泳图
２．４ Ｆ— 一２３８位点基因型数量及Ｇ／Ａ等位基因
分布频率ＴＮＦ—ｄ一２３８位点３种等位基因型在对照
组和宫内感染组孕妇中的数量、分布频率见表３。对
照组ＴＮＦ一仅一２３８位点Ａ等位基因频率为０．１４６，Ｇ
为０．８５４，而宫内感染组Ａ等位基因频率为０．２６２，
Ｇ为０．７３８，两组之问的差异无统计学意义（ ＝
３．２６，Ｐ＝０．０７１）。
表３ ＴＮＦ—ａ一２３８位点基因型数量及Ｇ／Ａ等位基因分布频率
３讨论
有关ＨＢＶ宫内感染机制的研究始于上世纪８０年
代，由于国内ＨＢＶ感染率较高，近年来此类报道较
多，并提出３种假说用于阐明ＨＢＶ宫内感染的机制，
其中包括胎盘渗漏学说、胎盘感染学说以及外周血单
核细胞（ＰＢＭＣｓ）感染学说 Ｊ。虽然以上学说都获
得部分科学证据的支持，然而也存在一定片面性，而
且其研究角度均从ＨＢＶ自身出发，缺少对宿主因素
的分析。目前研究已经证实多种传染性疾病的发生、
发展及转归与宿主的遗传背景密切相关，如丙型肝
炎、ＥＢ病毒感染及流行性出血热等 ｊ，基于现在的
研究状况，本研究重点探讨宿主ＩＦＮ一 和ＴＮＦ－０【两
・
１３４・
种细胞因子的多态性在ＨＢＶ宫内感染中所扮演的角
色，这不仅有利于从新的角度阐明ＨＢＶ宫内感染的
发生机制，也可以为建立一套预测ＨＢＶ宫内感染发
生的准确预警机制奠定基础。
ＩＦＮ一 可以作为抗原提呈细胞和Ｔ淋巴细胞增
殖、分化的调节因子，参与抗病毒及炎症反应。
＋８７４位点位于ＩＦＮ一＾ｙ基因第一个内含子（ｉｎｔｒｏｎ）区
域，包括ＡＡ、ＡＴ、１－ｒ ３种基因型，不同基因型之间
在与转录因子的结合能力以及ＩＦＮ． 表达水平上并不
相同，并且与疾病的易感性相关 ｊ。Ｌｉｏ等 。。研究发
现ＩＦＮ一＾ｙ＋８７４位点ｒｒＩ’正常纯合子ＩＦＮ一 分泌水平显
著高于其他基因型，并且可以抑制慢性肺结核患者病
情进展。本研究发现宫内感染组孕妇＋８７４位点等位
基因频率以Ａ占优势，并且与对照组的差异有统计
学意义（Ｐ＜０．０５），这与朱启镕等¨ 对宫内感染患
儿的分子流行病学调查相符，从而提示Ａ等位基因
孕妇ＩＦＮ． 分泌量低下，消弱了ＣＤ４ Ｔｈｌ和ＣＤ８
ＣＴＬ对ＨＢＶ的识别和清除能力，从而导致胎儿容易
发生宫内感染。同时也提示应该加强对于＋８７４位点
Ａ等位基因孕妇的检测，及早采取有效的母婴阻断措
施，避免ＨＢＶ宫内感染的发生。
ＴＮＦ一 是一种多功能细胞因子，主要由单核．巨
噬细胞、自然杀伤细胞产生，其强烈的促炎效应、抗
病毒效应、免疫调节效应及抗肿瘤活性效应在许多疾
病的发生发展过程中发挥重要作用。ＴＮＦ基因位于主
要组织相容复合体（ＭＨＣ）ｍ类基因区内，具有
ＳＮＰ、微卫星多态性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）、
ＲＦＬＰ多态性等多种表现形式，这些多态性可以从转
录水平上影响ＴＮＦ－仪的产生，从而最终表现为不同
个体之间ＴＮＦ一 水平的明显差异，并与众多感染性
疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及器官移植后排
斥反应相关 。一２３８位点位于ＴＮＦ．仅启动子区域，
Ｈｕｉｚｉｎｇａ等 发现该位点ＧＧ纯合子ＴＮＦ．仪表达水
平显著高于其他基因型。国内其他相关研究发现
ＨＢＶ宫内感染患儿一２３８位点Ａ等位基因频率显著
升高 ，然而本研究发现宫内感染组和对照组在一
２３８位点Ａ等位基因频率的差异并无统计学意义（Ｐ
＞０．０５），推测可能存在两点原因，一是对于孕妇而
言，ＴＮＦ－ｄ一２３８位点的确与ＨＢＶ宫内感染无明显相
关性；二是可能由于宫内感染组样本数量偏少，存在
统计学偏倚，应当增加病例数进行重新评估。
本研究初步证实ＨＢＶ宫内感染的发生与宿主因
素具有一定相关性，尤其是孕妇ＩＦＮ． ＋８７４位点Ｔ／
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第３期
Ａ等位基因型对于ＨＢＶ宫内感染发生的预警具有重
要意义。然而人体抗ＨＢＶ效应涉及免疫反应过程中
的诸多细胞因子，不同个体之间细胞因子的多态性又
极为复杂，而且许多细胞因子又存在连锁不平衡性，
这些都为筛选与ＨＢＶ宫内感染相关的高危因素提出
了巨大挑战。
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ｔｈｅ＋８７４Ｔ—｝Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ一 ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ Ｓｉｃｉｌｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｕｂｅｒ－
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ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕ—
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（收稿日期：２０１０—０２—２８编辑：李晓东）
2024年10月7日发(作者：端木如冬)
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第３期
・
临床论著・
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－０２６４．２０１０．０３．００２
干扰素一 基因＋８７４位点及肿瘤坏死因子一
基因一２３８位点单核苷酸多态性与
ＨＢＶ宫内感染相关性研究
林巧 刘晋洪。 吴其恺 高 洁 陈家建 万学信 聂 广 杨大国
１．深圳宝安慢性病防治院肝病科（广东深圳，５１８１３３） ２．深圳市东湖医院３．深圳市妇幼保健院
摘要 目的：研究ＩＦＮ一＿ｙ＋８７４位点Ｔ／Ａ以及ＴＮＦ—ｏｔ一２３８位点Ｇ／Ａ的单核苷酸多态性与ＨＢＶ宫内感染的相关
性。方法：采集ＨＢＶ标记物单项或多项阳性孕妇的外周血，提取基因组ＤＮＡ，根据新生儿是否感染ＨＢＶ将孕妇分为
宫内感染组和对照组。利用等位基因特异性ＰＣＲ检测ＩＦＮ一 ＋８７４位点等位基因型，利用ＰＣＲ．ＲＦＩＪＰ方法检测ＴＮＦ—
一
２３８位点等位基因型。结果：等位基因特异性ＰＣＲ可以准确判断ＩＦＮ． ＋８７４位点等位基因型，对照组ＩＦＮ一 ＋８７４
位点等位基因频率Ａ为０．５６２，Ｔ为０．４３８，而宫内感染组Ａ为０．７３８，Ｔ为０．２６２，两组之间的差异具有统计学意义
（ ＝４．３８，Ｐ＝０．０３６）。ＴＮＦ—ｅｔ一２３８位点等位基因型的检测可以使用ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法，对照组ＴＮＦ—ｄ一２３８位点等位
基因频率Ａ为０．１４６，Ｇ为０．８５４，宫内感染组Ａ为０．２６２，Ｇ为０．７３８，两组之间的差异无统计学意义（ ＝３．２６，Ｐ
＝
０．０７１）。结论：ＩＦＮ一 ＋８７４位点Ｔ／Ａ等位基因与ＨＢＶ宫内感染具有一定相关性，Ｔ等位基因对胎儿ＨＢＶ宫内感染
具有防护作用。ＴＮＦ—ｏｔ一２３８位点Ｇ／Ａ等位基因型与ＨＢＶ宫内感染的关系尚不明确。
关键词干扰素一 ；肿瘤坏死因子一ｏｔ；单核苷酸多态性；肝炎病毒，乙型；宫内感染
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ＋８７４
ｓｉｔｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ——２３ ８ ｓｉｔｅ ｗｉｔｈ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ＬＩＮ Ｑ１ＡＯ１．ＨＵ ＪＩＮ—ＨＯＮＧｌ，ＷＵ Ｑｌ一１６１１２，ｅｔ ａ１．Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｂａｏａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｐｒ￣ｅｍｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｒｅ Ｓｈｅｎｚ－
ｈｅｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，５１８１３３）Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ＩＦＮ一 ＋８７４ ｓｉｔｅ ａｎｄ ＴＮＦ—ｏｔ一２３８
ｓｉｔｅ ｗｉｔｈ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｏ ｃｏｌｌｅｃｔ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ＨＢＶ ｉｆｅｃｔｉｎｏｎ，ａｎｄ
ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ２ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ
ＨＢＶ．Ｔｈｅ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ＩＦＮ一－ｙ＋８７４ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ｂｙ ａｌｌｆｅｌｅ—ｓｐｅｃｉｉｃ ＰＣＲ，ｍｅａｎｗｈｉｆｌｅ，ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ＴＮＦ—ｏｔ一２３８ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｂｙ ＰＣＲ—ＲＦＬＰ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉｔ ｗａｓ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉ￣ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ＩＦＮ一 ＋８７４ ｓｉｔｅ ｂｙ ｌａｌｅｌｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＰＣＲ，ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ＩＦＮ一
＾Ｙ＋８７４ ｓｉｔｅ ｗｅｒｅ ０．５６２（Ａ）ａｎｄ ０．４３８（Ｔ）ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（ ＝４．３８，Ｐ＝０．０３６）
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｆｅｃｔｎｉｏｎ ｒｏｕｐ ｇｗｉｔｈ ０．７３８（Ａ）ａｎｄ ０．２６２（Ｔ）．ＰＣＲ—ＲＦＬＰ ｗａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｌａｌｅｌｅ
ｏｆ ＴＮＦ．ｏｔ一２３８ ｓｉｔｅ，ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ ２＝３．２６，Ｐ＝０．０７１）ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｌｌａｅｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ＴＮＦ一 一２３８ ｓｉｔｅ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ０．１４６（Ａ）ａｎｄ ０．８５４（Ｇ）ａｎｄ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ０．２６２（Ａ）ａｎｄ ０．７３８（Ｇ）．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｌｌｅｌｅ Ｔ／Ａ ｏｆ ＩＦＮ一 ＋８７４ ｓｉｔｅ ａｎｄ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｔ ａｌｌｅｌｅ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｌｌｅｌｅ Ｇ／Ａ ｏｆ ＴＮＦ— 一２３８ ｓｉｔｅ ａｎｄ
ＨＢＶ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｆｅｃｔｉｎｏｎ ｉｓ ｎｏｔ ｏｂｖｉｏｕｓ．
Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—ｇａｍｍａ；ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ—ａｌｐｈａ；ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｂ；ｉｎｔｒａｕ—
ｔｅｒｉｎｅ ｉｆｅｃｔｎｉｏｎ
基金项目：深圳市宝安科技计划项目（Ｎｏ．２００８１４９）；Ａ通讯作者
・
’１３２・
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第３期
母婴垂直传播是ＨＢＶ传播的重要途径，自从乙
型肝炎疫苗纳入计划免疫管理以来，对于高危新生儿
即ＨＢｓＡｇ阳性孕妇所生婴儿，采取主、被动联合免
疫的阻断效果约为９０％，但仍有５％～１０％婴儿免疫
酸多态性，该反应所需要的引物见表１，其中包括两
条ｒｒ／Ａ等位基因特异性正向引物，１条ＩＦＮ－ 反向引
物，还有１对用于扩增人垂体生长激素基因的内参对
照引物。每个ＤＮＡ样本使用两对等位基因特异性引
阻断失败，其主要原因就是ＨＢＶ宫内感染¨Ｊ。ＨＢＶ
物分别进行两次ＰＣＲ反应。ＰＣＲ反应体系为２０ｐＪ，
宫内感染是指妊娠期ＨＢＶ侵入胎儿肝细胞并复制，
使胎儿在宫内即被感染。目前国内外学者 对ＨＢＶ
宫内感染的机制进行了广泛研究，并筛选出一些引起
ＨＢＶ宫内感染的危险因素，如孕妇ＨＢｅＡｇ阳性、
ＨＢＶ ＤＮＡ阳性、先兆早产、先兆流产等，但其确切
机制尚未完全阐明。近年来研究发现多种非遗传性疾
病（如变应性鼻炎、利什曼原虫感染等）均存在遗
传背景，从而导致不同个体对疾病易感性、疗效和预
后存在差异，而单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）是遗传背景多样性的重要表现
形式＿４ ｊ。本研究选取与ＨＢＶ清除密切相关的细胞
因子干扰素－ （ＩＦＮ一 ）、肿瘤坏死因子一ＯＬ（ＴＮＦ一仅），
分析ＩＦＮ一＾ｙ＋８７４位点Ｔ／Ａ以及ＴＮＦ—ｄ一２３８位点Ｇ／
Ａ的单核苷酸多态性与ＨＢＶ宫内感染的相关性。
１资料与方法
１．１ 一般资料搜集２００８年３月一２００９年８月期间
在深圳市东湖医院、深圳市妇幼保健院及深圳宝安慢
性病防治院随访的ＨＢＶ标记物（如ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、
ＨＢＶ ＤＮＡ等）单项或多项阳性的孕妇２２３例，并追
踪至胎儿分娩，根据胎儿是否发生宫内感染将孕妇分
为对照组和宫内感染组。宫内感染的诊断标准依据文
献报道，即新生儿期外周血ＨＢｓＡｇ和（或）ＨＢｅＡｇ
阳性为现行感染标志，如果抗一ＨＢｅ和（或）抗一ＨＢｃ
阳性表示曾发生宫内感染，现在处于恢复期或自然好
转。本组资料中发生ＨＢＶ宫内感染的孕妇共２１例，
发生率９．４％，平均年龄（２８．２６±１１．０４）岁，对照
组中孕妇２０２例，平均年龄（２６．５７±１０．９５）岁。
１．２基因组ＤＮＡ提取抽取孕妇空腹静脉血３ｍｌ，
使用２．５％ＥＤＴＡ抗凝。基因组ＤＮＡ抽提使用基因
组ＤＮＡ小量提取试剂盒（德国Ｑｉａｇｅｎ公司），操作
方法按照试剂盒说明书进行。基因组ＤＮＡ用灭菌水
溶解后一２０￣Ｃ保存。宫内感染组２１例孕妇均获得基
因组ＤＮＡ样本，对照组中由于部分孕妇拒绝参与本
项研究，或者部分孕妇的基因组ＤＮＡ提取失败，仅
获得８９份样本。
１．３ ＩＦＮ． ＋８７４位点Ｔ／Ａ单核苷酸多态性检测 参
照国外文献报道 ，采用等位基因特异性ＰＣＲ（ａｌ－
ｌｅｌｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＰＣＲ）检测ＩＦＮ． ＋８７４位点Ｔ／Ａ单核苷
其中包括ＤＮＡ模板５０～１００ｎｇ，ｄＮＴＰ ２００ｔ．ｚｍｏｌ／Ｌ，
１０×ＰＣＲ缓冲液２１ｘｌ，１对等位基因特异性引物各
５￣ｍｏＵＬ，１对内参引物各０．５ ｍ０ｌ／，Ｌ。ＰＣＲ反应条
件为：９４℃预变性５分钟，随后按９４℃３０秒、６０℃
５Ｏ秒、７２ｑＣ ４０秒循环３０次，最后７２℃延伸５分钟。
ＰＣＲ反应完成后，用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测扩增
产物。
１．４ ＴＮＦ一 一２３８位点Ｇ／Ａ单核苷酸多态性检测
ＴＮＦ—ｏ【一２３８位点Ｇ／Ａ单核苷酸多态性的检测使用
ＰＣＲ结合限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）技术 。利用表１中
ＴＮＦ— 特异性正、反向引物进行ＰＣＲ扩增，反应体
系为２０ｔｚｌ，其中包括ＤＮＡ模板５０～１００ｎｇ，ｄＮＴＰ
２００ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ，１０×ＰＣＲ缓冲液２１，ｚｌ，正、反向引物各
５￣ｍｏＵＬ。ＰＣＲ反应条件为：９４￣Ｃ预变性５分钟，随
后按９４℃３０秒、５８￣Ｃ ３０秒、 ７２℃３０秒循环３０次，
最后７２＂１２延伸５分钟。ＰＣＲ反应完成后，用２．０％琼
脂糖凝胶电泳检测扩增产物。取ＰＣＲ产物１０ ，使
用１０Ｕ ＭｓｐＩ限制性内切酶３７℃酶切１２小时，之后使
用２．０％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
表１检测ＩＦＮ一＾ｒ＋８７４位点Ｔ／Ａ和 ＩＴＮＦ—ｏｔ一２３８
位点Ｇ／Ａ单核苷酸多态性所用引物
引物名称 引物序列（５’－３’）
Ｔ特异性正向引物
ＴＩ℃ＴｒＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴ
Ａ特异性正向引物
ＴＩ℃ＴＴＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡ Ｉ℃Ａ
ＩＦＮ－ 反向引物
ＴＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＴＡＣ Ｉ℃ＣＡ
内参正向引物
ＧＣＣ１ＴＣＣＣＡＡＣＣＡ Ｉ’Ｉ℃ＣＣＴｒＡ
内参反向引物
ＴＮＦ．Ⅱ一２３８位点Ｇ／Ａ
ＴＮＦ—ｏｔ正向引物
ＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＣＧＧＡＡＣＣ
ｒＮＦ一０【反向引物
ＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴＡＧＴＧ
１．５统计学方法统计分析使用ＳＰＳＳ １１．０软件，
分类变量使用 检验，Ｐ＜０．０５（双侧检验）认为
有统计学意义。
２ 结果
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第３期
２．１ ＩＦＮ一 ＋８７４位点ｒｒ／Ａ等位基因特异性ＰＣＲ方
法的建立每份基因组ＤＮＡ样本在使用两对等位基
因特异性引物进行两次ＰＣＲ反应后，可以出现３种
不同情况，１Ｔｒ正常纯合子仅能使用Ａ等位基因特异
性引物扩增获得２６４ｂｐ片段；ＡＡ突变纯合子仅能使
用Ｔ等位基因特异性引物获得２６４ｂｐ片段；而ＡＴ杂
合子则使用两种等位基因特异性引物均可以获得目的
片段（图１）。由于每轮ＰＣＲ反应中均含有内参引物
用于评价整个反应体系，所以产物中包括４２９ｂｐ长度
的阳性对照片段。
图１ ＩＦＮ－．ｙ＋８７４位点Ｔ／Ａ等位基因特异性ＰＣＲ
产物琼脂糖凝胶电泳图
ａ使用Ｔ等位基因特异性引物；ｂ．使用Ａ等位基因特异性引物
２．２ ＩＦＮ一 ＋８７４位点基因型数量及Ｔ／Ａ等位基因分
布频率表２显示对照组和宫内感染组孕妇中ＡＡ突
变纯合子的数量最多，分别为４０．４％（３６／８９）和
６１．９％（１３／２１），对照组ＩＦＮ－＾ｙ＋８７４位点Ｔ／Ａ等位
基因频率Ａ为０．５６２，Ｔ为０．４３８，而宫内感染组Ａ
等位基因频率为０．７３８，Ｔ为０．２６２，两组之间的差
异具有统计学意义（ ＝４．３８，Ｐ＝０．０３６）。
表２ ＩＦＮ一．ｙ＋８７４位点基因型数量及Ｔ／Ａ等位基因分布频率
与对照组比较， Ｐ＜０．０５
２．３ ＴＮＦ—ｏ【一２３８位点Ｇ／Ａ等位基因ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方
法的建立 由于在ＴＮＦ． 正向引物一２４０位点引入Ｔ
—ｃ突变，在ＧＧ正常纯合子的ＰＣＲ产物中引入Ｍｓｐ
Ｉ酶切位点，产物可以发生完全酶切，产生１３３ｂｐ和
１９ｂｐ两条片段；而ＡＡ突变纯合子ＰＣＲ产物则缺少
・
ｌ３３・
该酶切位点，Ｍｓｐ Ｉ不能发生酶切，仅出现１５２ｂｐ １
条片段；ＡＧ杂合子在酶切后应该出现１５２ｂｐ、１３３ｂｐ
和１９ｂｐ共３条片段。由于１９ｂｐ片段较小，电泳过程
中容易丢失，所以本研究仅通过１５２ｂｐ和１３３ｂｐ两条
片段进行等位基因的判断（图２）。
２５０ｂｐ
１ＯＯｂｐ
图２ ＴＮＦ—ｄ一２３８位点Ｇ／Ａ等位基因ＰＣＲ—ＲＦＬＰ
产物琼脂糖凝胶电泳图
２．４ Ｆ— 一２３８位点基因型数量及Ｇ／Ａ等位基因
分布频率ＴＮＦ—ｄ一２３８位点３种等位基因型在对照
组和宫内感染组孕妇中的数量、分布频率见表３。对
照组ＴＮＦ一仅一２３８位点Ａ等位基因频率为０．１４６，Ｇ
为０．８５４，而宫内感染组Ａ等位基因频率为０．２６２，
Ｇ为０．７３８，两组之问的差异无统计学意义（ ＝
３．２６，Ｐ＝０．０７１）。
表３ ＴＮＦ—ａ一２３８位点基因型数量及Ｇ／Ａ等位基因分布频率
３讨论
有关ＨＢＶ宫内感染机制的研究始于上世纪８０年
代，由于国内ＨＢＶ感染率较高，近年来此类报道较
多，并提出３种假说用于阐明ＨＢＶ宫内感染的机制，
其中包括胎盘渗漏学说、胎盘感染学说以及外周血单
核细胞（ＰＢＭＣｓ）感染学说 Ｊ。虽然以上学说都获
得部分科学证据的支持，然而也存在一定片面性，而
且其研究角度均从ＨＢＶ自身出发，缺少对宿主因素
的分析。目前研究已经证实多种传染性疾病的发生、
发展及转归与宿主的遗传背景密切相关，如丙型肝
炎、ＥＢ病毒感染及流行性出血热等 ｊ，基于现在的
研究状况，本研究重点探讨宿主ＩＦＮ一 和ＴＮＦ－０【两
・
１３４・
种细胞因子的多态性在ＨＢＶ宫内感染中所扮演的角
色，这不仅有利于从新的角度阐明ＨＢＶ宫内感染的
发生机制，也可以为建立一套预测ＨＢＶ宫内感染发
生的准确预警机制奠定基础。
ＩＦＮ一 可以作为抗原提呈细胞和Ｔ淋巴细胞增
殖、分化的调节因子，参与抗病毒及炎症反应。
＋８７４位点位于ＩＦＮ一＾ｙ基因第一个内含子（ｉｎｔｒｏｎ）区
域，包括ＡＡ、ＡＴ、１－ｒ ３种基因型，不同基因型之间
在与转录因子的结合能力以及ＩＦＮ． 表达水平上并不
相同，并且与疾病的易感性相关 ｊ。Ｌｉｏ等 。。研究发
现ＩＦＮ一＾ｙ＋８７４位点ｒｒＩ’正常纯合子ＩＦＮ一 分泌水平显
著高于其他基因型，并且可以抑制慢性肺结核患者病
情进展。本研究发现宫内感染组孕妇＋８７４位点等位
基因频率以Ａ占优势，并且与对照组的差异有统计
学意义（Ｐ＜０．０５），这与朱启镕等¨ 对宫内感染患
儿的分子流行病学调查相符，从而提示Ａ等位基因
孕妇ＩＦＮ． 分泌量低下，消弱了ＣＤ４ Ｔｈｌ和ＣＤ８
ＣＴＬ对ＨＢＶ的识别和清除能力，从而导致胎儿容易
发生宫内感染。同时也提示应该加强对于＋８７４位点
Ａ等位基因孕妇的检测，及早采取有效的母婴阻断措
施，避免ＨＢＶ宫内感染的发生。
ＴＮＦ一 是一种多功能细胞因子，主要由单核．巨
噬细胞、自然杀伤细胞产生，其强烈的促炎效应、抗
病毒效应、免疫调节效应及抗肿瘤活性效应在许多疾
病的发生发展过程中发挥重要作用。ＴＮＦ基因位于主
要组织相容复合体（ＭＨＣ）ｍ类基因区内，具有
ＳＮＰ、微卫星多态性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）、
ＲＦＬＰ多态性等多种表现形式，这些多态性可以从转
录水平上影响ＴＮＦ－仪的产生，从而最终表现为不同
个体之间ＴＮＦ一 水平的明显差异，并与众多感染性
疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及器官移植后排
斥反应相关 。一２３８位点位于ＴＮＦ．仅启动子区域，
Ｈｕｉｚｉｎｇａ等 发现该位点ＧＧ纯合子ＴＮＦ．仪表达水
平显著高于其他基因型。国内其他相关研究发现
ＨＢＶ宫内感染患儿一２３８位点Ａ等位基因频率显著
升高 ，然而本研究发现宫内感染组和对照组在一
２３８位点Ａ等位基因频率的差异并无统计学意义（Ｐ
＞０．０５），推测可能存在两点原因，一是对于孕妇而
言，ＴＮＦ－ｄ一２３８位点的确与ＨＢＶ宫内感染无明显相
关性；二是可能由于宫内感染组样本数量偏少，存在
统计学偏倚，应当增加病例数进行重新评估。
本研究初步证实ＨＢＶ宫内感染的发生与宿主因
素具有一定相关性，尤其是孕妇ＩＦＮ． ＋８７４位点Ｔ／
中西医结合肝病杂志２０１０年第２０卷第３期
Ａ等位基因型对于ＨＢＶ宫内感染发生的预警具有重
要意义。然而人体抗ＨＢＶ效应涉及免疫反应过程中
的诸多细胞因子，不同个体之间细胞因子的多态性又
极为复杂，而且许多细胞因子又存在连锁不平衡性，
这些都为筛选与ＨＢＶ宫内感染相关的高危因素提出
了巨大挑战。
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ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｂｕｔ Ｃａｌｌ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＦＮ－
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ｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｏｒｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩＦＮ一 ｇｅｎｅ：ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＣＡ ｍｉｃｍｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｈｉｇｈ ＩＦＮ一 ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
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ｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｎ ＴＮＦ—ａｌｐｈａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｎａｄ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ，
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ｔｈｅ＋８７４Ｔ—｝Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ一 ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ Ｓｉｃｉｌｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｕｂｅｒ－
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ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕ—
ｎｏｌ，１９９７，７２（９）：１４９—１５３．
（收稿日期：２０１０—０２—２８编辑：李晓东）