2024年2月18日发(作者：赵小萍)
云南大学学报（自然科学版），2010，32（S1）：426～432JournalofYunnanUniversityCN53－1045/NISSN0258－7971利用ITS（nrDNA）和matK（cpDNA）探讨姜族植物的系统发育1，23郑曼莉，夏永梅（1．中国科学院西双版纳热带植物园植物进化生态学实验室，云南昆明650223；2．中国科学院研究生院，北京100049；3．中国科学院西双版纳热带植物园植物系统与保护生物学实验室，云南昆明650223）matK片段，摘要：姜族是姜科中最大的族，包括25个属，与舞花姜族共同组成姜亚科．本研究应用ITS，通Bayesian推断（BayesianInference）、过最大简约法（MaximumParsimony）、最大似然法（MaximumLikelihood）对获得的序列进行联合矩阵分析，构建基因树，对姜族与舞花姜族之间的关系及族内类群间的亲缘关系进行探讨．系统树的拓扑结构显示：①姜亚科为单系类群．②Distichochlamys与Scaphochlamys、象牙参属与距药姜属、直唇Smitha-姜属与喙花姜属是姐妹类群．③姜花属、象牙参属、山奈属、姜属是单系类群．④姜黄属与Paracautleya，tris，Hitchenia形成并系类群．⑤凹唇姜属与拟姜黄属成并系类群．ITS和matK片段对姜族内部深分支系统关系的解决力尚有不足，建议今后寻找新的分子标记进行更为深入的研究．关键词：姜族；姜科；ITS；matK；系统发育中图分类号：Q949；Q75文献标识码：A文章编号：0258－7971（2010）S1－0426－07姜科是热带、亚热带分布的植物类群，主要分布于南亚、东南亚和太平洋岛屿．全世界目前有53200余种，属，约1500种．我国有22属，主要分布［1－2］．于东南和西南各省区在经典分类学研究中，姜科的分类系统主要有［3－4］3个，、Holttum系统［5］分别是Schumann系统．姜科植物由于花期短暂［7］，花部［1］形态特征变异幅度小，不同类群间易存在性状和Burtt系统交叉［8］［6］，分类研究存在困难．Burtt的检索表自建立后的几年中也被证明是不完善的．［6］Holttum［5］认为姜属的侧生退化雄蕊呈裂片状（lobe），与姜族中其它侧生退化雄蕊通常较小或不存在的属有区别，姜属在此性状上更接近姜花族（Hedychieae），于是将其从姜族中提出放入姜花族，而将原来的姜族更名为山姜族（Alpinieae）．后来Burtt和Olatunji认为姜属药隔附属体突出在花药之上、包裹花柱、叶柄肿胀、维管束具厚角组织、这些特点与姜花族不同，于是将姜属独立成为姜族．Kress等［8］运近年来，随着分子系统学的发展，用nrDNAITS和cpDNAmatK序列对姜科4族41属104种的植物进行系统发育研究，构建了新的姜科分类系统．姜族被重新划分，包括了Burtt系统中的姜族、姜花族以及直唇姜属（Pommereschea）、喙Nanochilus和Stadiochilus，花姜属（Rhynchanthus）、共计25个属．并界定了新姜族植物的共同特征：植［6］姜族（Zingibereae）是姜科的一个重要类群，其分类系统在历史上变动较大．退化雄蕊（stamin-ode）是姜科植物的一个常用分类性状，通常具2或4枚，其中内轮的2枚联合成唇瓣（labellum），外轮的二枚称侧生退化雄蕊（lateralstaminode）．姜科模式属姜属（Zingiber）在Schumann系统中位于姜族，*收稿日期：2010－05－07基金项目：云南省自然科学基金资助项目（2007C111M）．作者简介：郑曼莉（1984－），女，云南人，硕士，主要从事植物系统发育方面的研究．E－mail：xiaym@xtbg．ac．cn．通讯作者：夏永梅，女，研究员，主要从事植物系统发育、生物地理方面的研究，
第S1期郑曼莉等：利用ITS（nrDNA）和matK（cpDNA）探讨姜族植物的系统发育427株二列叶平面与根状茎方向平行、绝大部分属具有大且呈花瓣状的侧生退化雄蕊、子房三室、中轴胎［8］Ngamriabsakul座．在Kress等研究的基础上，［9］等利用nrDNAITS和cpDNAtrnL－F对姜族做［9］了系统发育研究，由于trnL－F相对难以扩增，量和浓度．1．3ITS和matK片段的扩增与产物纯化ITS和matK片段扩增均使用rTaq酶（Takara）．ITS全5．8S，ITS2）扩增引物为ITS4和序列（包括ITS1，ITS5［17］．matK为mIF［8］和trnK2R［18］．反应体系均约有40%的样品未能测序得到trnL－F序列．因此在构建期待提高分支支持率的ITS和trnL－F基因联合树时，仅包括姜族16个属，23个种．在Kress等［8］重建的姜科分类系统中，姜族与舞花姜族（Globbeae）组成姜亚科（Zingiberoideae），舞花姜族的形态特征是植株个体较小（＜1m）、具有单室子房、侧膜胎座．大苞姜属（Caulokaempfe-ria）系统位置不能确定暂时被置于姜亚科．目前，在Kress等［8］和Williams等［10］的研究中姜亚科显示为单系类群，但亚科内的姜族与舞花姜族的关系还难下定论．舞花姜族仅在Kress等［8］研究中的ITS序列最大简约树、Williams等［10］研究中的ITS＆matK联合序列严格一致性简约树中构成单系分支，且支持率微弱．本研究采用Kress划定的姜科系统，在借鉴以往姜科系统发育研究经验的基础上［11－15］，选取姜科分子系统发育研究比较常用的rDNAITS（核糖体内转录间隔区）和cpDNAmatK（赖氨酸tRNA内含子内的成熟酶编码基因）片段作为基因标记，对姜族尽可能获得丰富的取样，构建基因联合树，探讨姜族的系统发育．本研究包括的种类除姜族20个属57个种外，还有舞花姜族3个属10个种，大苞姜属2个种，再次探讨姜族、舞花姜族、大苞姜属3者关系．1材料与方法1．1材料本研究的实验材料采集自中国科学院西双版纳热带植物园姜园，以及中国的云南、四川、广东3个省份，部分材料来自美国史密森研究院自然历史博物馆．内类群包括姜族20个属57个种、3个不定种，1变种，1疑似杂交种；大苞姜属2个种；舞花姜族3个属10个种．根据Kress等（2002）的研究，选择与姜亚科近缘的山姜亚科3个属各1个种作为系统发育研究的外类群．研究中部分种类的序列来源于GenBank，实验材料详细信息见表1．1．2植物总DNA的提取将野外采集的新鲜叶片用硅胶快速干燥，采用改良的3×CTAB法［16］提取总DNA，用1%的琼脂糖电泳检测总DNA的质为50μL，内含：5μL10×Buffer，4μLMgCl2（50mmol/L），2μLdNTPs（2．5mmol/L），正反引物各2μL（5μmol/L），约25ngDNA模板，3UrTaq酶．PCR扩增反应在Veriti96孔热循环仪上进行，ITS扩增反应程序：94℃预变性4min；94℃1min，55℃40s，72℃45s，29次循环；72℃延伸10min．matK扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃2min，55℃2min30s，72℃1min30s，35次循环；72℃延伸7min．产物用E．Z．N．AGel－extractionKitD2500－01（OMEGA）割胶纯化．1．4序列测定所有测序工作由上海生工工程技术有限公司和北京天根生化科技有限公司完成．ITS用ITS5直接正向测序．直接测序失败的个体，对PCR产物割胶回收目的片段，与pUCm－18T载体连接，转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用蓝白斑筛选初步确定阳性克隆，再次PCR后电泳确定为阳性克隆即可测序；matK序列用mIF、trnK2R及另一自行设计的引物mR（5’－AAC-TAGTCGGATGGAGTAG－3’）测通．1．5数据处理利用SeqMan［19］对序列进行编辑和拼接．对ITS和matK序列数据进行单独及联合序列矩阵构建．采用BioEdit［20］中的ClustalW程序对矩阵进行自动排序，并进行人工校对．简约法（Maximumparsimony，MP）分析用PAUP4．0b10软件［21］完成，采用启发式搜索（Heuristicsearch）1000次抽样，TBR枝长交换，每步保留10棵树，获取50%一致性系统进化树（50%majorityrulecon-sensustree）；进行靴带法（Bootstrapanalysis）检测［22］，1000次抽样，根据靴带支持率（boostrap，BS）评估各分支可靠性．Bayesian推断（Bayesianin-ference，BI）利用MrBayes3．1．2软件［23－24］完成，用Modeltest3．06软件［25］进行模型选择，ITS序列矩阵的最适合模型为：TrN+I+G，matK序列矩阵的最适合模型为：K81uf+G；Bayesian推断起始于一棵随机树，MCMC链（MarkovChainMonteCaelochains）运行100万代，每100代取样1次，摒弃前1000次老化样本（burn－insamples），用剩余样本构建50%一致性树并计算各分支的后验概率（pos-
428云南大学学报（自然科学版）第32卷teriorprobability，PP）［23］．似然法（Maximumlikeli-hood，ML）分析在http：//www．atgc－montpellier．fr/网上进行，该网采用PhyML3．0软件分析，采用靴带法检测，1000次抽样．2结果本研究共获得包括外类群在内共80个样品的ITS序列，72个样品的matK序列，72个样品的ITS＆matK联合序列，并对这些序列的单独及联合矩阵进行了相关的数据信息统计，统计分析的结果见表2．运用最大简约法、Bayesian推断和最大似然法进行系统树的构建，其中最大似然法构建的系统树拓扑结构和分支支持率与最大似然法分析结果大致相同．图1，2为最大简约法分析和Bayesian推断的50%一致性树，最大简约法分析中大于50的靴带支持率标注在各分支上，Bayesian推断中大于0．5的后验支持率标注在各分支上．较之最大简约法，Bayesian推断的后验支持率值较高，树构型（拓扑结构）也有所差别．对系统树的拓扑结构进行分析，结果表明：（1）整个姜亚科构成一个单系，在MP树中靴带支持率和BI树中后验支持率分别为100和1．00．姜族在MP分析中构成一个分支，支持率小于50．舞花姜族在MP和BI树中均未构成一个单系分支，族下的3个属中Gagnepaini与Hemiorchis构成姐妹群分支（BS=100，PP=1．00），舞花姜属（Globba）构成单系分支（BS=100，PP=1．00）．舞花姜族的这2个分支在MP树中依次位于姜亚科基部，姜族外部，在BI树中与姜族的4个分支成平行关系．（2）姜族构成2个分别包括姜花属（Hedychi-um）和姜黄属（Curcuma）在内的分支Ⅰ和分支Ⅱ（见图1，2），在MP树中靴带支持率都小于50%．在BI树中分支Ⅰ、分支Ⅱ分别具有0．68和1．00的后验支持率．分支Ⅰ：姜属（Zingiber）（BS=55，PP=1．00）、山奈属（Kaempferia）（BS=81，PP=1．00）、姜花属（BS=100，PP=1．00）、象牙参属（Roscoea）（BS=100，PP=1．00）在MP树和BI树中各自构成单系分支．Distichochlamys与Scaphochlamys（BS=92，PP=1．00），喙花姜属（Rhynchanthus）与直唇姜属（Pommereschea）（BS=82，PP=1．00）、象牙参属与距药姜属（Cautleya）（BS=98，PP=1．00）在MP树和BI树中均构成姐妹类群．Haniffia与大苞姜属（Caulokaempferia）聚为1个分支，靴带支持率小于50，后验支持率为0．54．凹唇姜属（Boesenbergia）物种呈并系类群．其中Boeⅰ白斑凹唇姜（Boesenber-giaalbomaculata）与拟姜黄属（Curcumopha）聚为一支（BS=88，PP=1．00）．分支Ⅰ中除Haniffia/大苞姜属分支外的其余类群构成1个分支，MP树中靴带支持率小于50，BI树中具有0．74的后验支持率．姜属、山奈属、Cornukaempferia、Distichochlamys、Scaphochlamys、白斑凹唇姜/拟姜黄属几个分支构成CladeA，在MP树中支持率小于50，BI树中支持率为1．00．分支Ⅱ：Paracautleya，Hitchenia位于姜黄属分支内，使姜黄属成为并系类群（BS=99，PP=1．00）．联合矩阵分析中缺乏Smithatris，对ITS单基因矩阵分析的结果表明，该并系类群包括Smith-atris．姜黄属并系类群与土田七属（Stahlianthus）成姐妹类群（BS=100，PP=1．00）．Camptandra、苞叶姜属（Pyrgophyllum）在MP树中分别位于分支Ⅱ的基部，相应分支支持率小于50，在BI树中这2个属与姜族和舞花姜族各分支成平行关系．3讨论3．1姜族与舞花姜族的关系分析结果显示，姜亚科为单系类群．姜亚科的部分深分支在最大简约法中靴带支持率低于50，但在Bayesian推断中获得较高后验率，但鉴于后验率一般大于0．90才有意义，所以对于这些分支的讨论需十分谨慎，各分析中姜族浅分支支持率相对较高．舞花姜族在各分析中均未构成单系，姜族在最大简约法分析中虽然构成1个分支，但是支持率小于50．目前ITS和matK片段提供的分子系统发育学证据无法确定舞花姜族和姜族二者的关系．在形态上，舞花姜族具有单室子房、侧膜胎座，唇瓣基部与花丝联合的特征将其与姜族区分开，但这些区别并不是严格的，在姜族的大苞姜属、Scaphochlamys、Paracautleya、Siphonochilus中有部分种为单室子房，直唇姜属也具有唇瓣基部与花丝连合的特征．姜族单系地位在简约法分析中获得弱的支持，但是并没有在姜族中发现易观察到的共有衍征（syna-pomorphy）．不过姜族与舞花姜族的近缘关系是可以确定的，二者构成姜亚科，是一个确定的单系，该
第S1期郑曼莉等：利用ITS（nrDNA）和matK（cpDNA）探讨姜族植物的系统发育429［31］亚科的共有特征为二列叶平面与根状茎方向平行，，是（4）姜花属姜花属全球约有80个种这一性状将其与其他亚科区分开．3．2姜族系统的演化关系在姜族内部，尽管ITS和matK提供的信息有限，对内部分支间的系统关系分辨力不高．不过对系统树的分析我们仍然可以得到一些较有价值的结论．山奈属、Disti-chochlamys/Scaphochlamys、象牙参属/距药姜属、姜花属、直唇姜属/喙花姜属、姜黄属并系类群几个分支在ITS＆matK的简约法分析和Bayesian推断中获得一致的支持．对于这几个分支，下面依次做讨论：（1）山奈属约有50个种，主要分布在印度，中国南部和马来西亚地区［26］．山奈属植物植株低矮，具块状根茎，须根常膨大，无明显的地上茎．分析支持山奈属为单系类群．在单基因矩阵分析中发现（结果未列出），山奈属在ITS单基因系统树里的支持率低于matK，这与该属ITS序列变异度大有关，其他属属内种间ITS序列差异（sequencedi-vergence）范围0～13．94%（matK为0～1．31%），山奈属为2．89%～20．31%（matK为0～0．99%）．由于ITS是一个多拷贝基因，且存在明显的趋同进化［27］，山奈属ITS序列变异度大可能是因为趋同效应在该属中作用不明显，还保存着多态性的ITS拷贝．（2）Distichochlamys和ScaphochlamysDisti-chochlamys为越南特有属，Scaphochlamys分布在马来西亚和泰国．在基于形态学的研究中，二者的亲缘关系得到不同学者的一致认可［28－29］．它们形态特征非常相似，主要差别仅在于Distichochlamys苞片为二列覆瓦状排列，小苞片管状，而Scaphochlamy苞片螺旋状排列，小苞片非管状．分析结果强烈支持Distichochlamys和Scaphochlamys成为姐妹类群．（3）象牙参属和距药姜属象牙参属分布在喜马拉雅地区（中国、印度、尼泊尔、锡金、克什米尔），海拔1200～4880m之间［30］，包括18个种．分析结果显示象牙参属为单系类群，这一结果支持Cowley［11］的研究结论．象牙参属和距药姜属是姐妹类群，二者的亲缘关系具有地理分布和形态学方面的证据，它们同为姜族中分布海拔较高的属，分布区部分重叠且形态相似，苞片内都为单花，侧生退化雄蕊椭圆形花瓣状，唇瓣两裂，药隔于基部延伸成距状［11，30］．姜科中唯一一个从热带到高海拔地区分布的大属，为热带亚洲和马达加斯加间断分布的类群，主要分布在亚洲热带、亚热带区域，其现代分布中心为喜马拉雅地区．该属的形态特征是：侧生退化雄蕊长，线形或披针形；苞片革质，宿存；花丝通常较长，花药背着；唇瓣显著，微凹或二裂．姜花属在Wood等［14］和Kress等［8］的研究中呈现为单系类群，本研究中姜花属构成单系（分支且获得较高支持率，支持姜花属为单系类群）．（5）直唇姜属和喙花姜属直唇姜属和喙花姜属侧生退化雄蕊缺失，因此在形态学分类上一直以来被归入侧生退化雄蕊小或不存在的山姜族［32－33］．分析结果中这2个属为姐妹类群并位于姜族内，在Bayesian推断中这一姐妹群分支位于分支Ⅰ，分支Ⅰ具有0．78的后验支持率．由于二者均具有三室子房，中轴胎座，与舞花姜族差异较大，结合分子系统学的证据，本研究支持Kress［8］和Wood［14］的研究中将二者置于姜族的分类处理．（6）姜黄属并系类群在系统树中，姜黄属与Paracautleya，Hitchenia成并系类群，由于实验没有获得Smithatris的matK序列，故联合矩阵中不包括Smithatris．对ITS矩阵进行分析（系统树未列出），结果表明Smithatris也位于这一并系类群内部，在本研究中此并系类群与土田七属成姐妹类群．由于对姜黄属物种的取样存在差异，在Kress等［8］与Ngamriabsakul等［9］的研究中均显示，土田七属也位于姜黄属并系类群内部．这5个属形态较为相似，其中土田七属具钟状总苞，与苞片多枚且紧密排列的其余4个属相区别．姜黄属与Paracautleya的主要区别在于前者苞片连生，每苞片内有数朵小花，具有小苞片，唇瓣微凹鲜少开裂，后者苞片离生，每苞片内仅有一朵小花，小苞片缺失，唇瓣开裂．Skornickova等［34］通过观察活体植物和标本发现Paracautleya与姜黄属的区分性状并不是绝对的，于是将Paracautleya归入姜黄属．Smithatris和Hitchenia在形态上最为接近，二者具有相似的植株特点和花序特征，叶有柄，花序梗都较长，有紧密排列的囊状苞片，并且二者开花后花冠管都会螺旋状后缩，使花藏于苞片内．本研究的ITS分析结果中没有发现Smithatris和Hitchenia有特别的亲缘关系．在Kress等［8］的研究中认为姜黄属并系类群内部较高的支持率更倾向于将姜黄属分割为几个属，
430云南大学学报（自然科学版）第32卷而不是接受包括另外4个属的广义姜黄属．Ngam-riabsakul等［9］总结了这5个属的形态性状差异，认为这些差异性状为自体衍症（autapomorphic），5个属应该归并为一属．在本研究中，由于对姜黄属物种取样有限，尚不明确姜黄属与Smithatris、Hitche-nia、土田七属的关系．目前对于姜黄属与Paracaut-leya、Smithatris、Hitchenia、土田七属的分类处理问题已成为姜科分类研究的一个热点．在以后的系统发育研究中扩大采样范围，观察更多活体材料及标本对解决这一问题是非常必要的．（7）其它姜族内不具有明显假茎的几个属：山奈属、Cornukaempferia、Distichochlamys、Scaphochlamys、凹唇姜属、拟姜黄属在系统树的拓扑结构中显示出一定的近缘关系，几个属构成一个分支，姜属具有明显的假茎，也位于这一分支内部．该分支中除Distichochlamys和Scaphochlamys构成姐妹类群外，其余各属间的系统演化关系并不清楚．凹唇姜属是一个包括约60个种的大属，主要分布在热带亚洲［35］．系统树拓扑结构显示，凹唇姜属为并系类群，在Kress等［8］和Ngamriabsakul等［9］的研究中凹唇姜属也呈现为并系类群．在前者的研究中拟姜黄属和凹唇姜属的部分物种成姐妹类群，后者的研究中大苞姜属和凹唇姜属的部分物种成姐妹类群．本研究中白斑凹唇姜与拟姜黄属成姐妹类群．拟姜黄属是Rao和Verma［36］提出的一个单种属（monotypic），与凹唇姜属的差别在于花序由根茎发出，苞片螺旋状排列，退化雄蕊杯状．Larsen［37］认为这些性状不足以将其与凹唇姜属区分，建议将该属归入凹唇姜属．大苞姜属在本研究中未表现出与凹唇姜属有近缘关系，系统位置不确定．可能的原因是本次实验未取样到与大苞姜属近缘的凹唇姜属种，例如Ngamriabsakul等［9］研究中的Boesenbergiaaurantiaca和Boesenbergiacordata．结合前人的研究，我们认为凹唇姜属本身是一个并系类群，有一部分种与拟姜黄属和大苞姜属关系较近．Ngamriabsakul和Techaprasan［38］结合染色体计数与分子系统发育分析，认为凹唇姜属的进化以染色体基数为10和12的2条路径进行．基于这一结论，有否可能凹唇姜属具有不同染色体基数的2个进化分支各自与拟姜黄属和大苞姜属有某些联系，对于这一问题的回答，需要在对凹唇姜属采样较完全的基础上进行．Cornukaempferia具有和姜属非常相似的向前延伸成长喙状的药隔附属体［14，39］，但Mood和Larsen［40］认为它与山奈属植株形态相似，二者均无明显地上茎，植株矮小更近缘．在我们的实验结果中，Cornukaempferia未显示出与任何一方有更近的亲缘关系，它在整个姜族分支中系统关系不能确定．姜属是姜科的模式属，分布于亚洲的热带，亚热带地区，约有80个种，分析中姜属单系地位获得支持．姜属侧生退化雄蕊与唇瓣基部合生，这一特征将其与姜族的其他类群区分开，对其单系属性的进一步确定，还需扩大采样范围．Camptandra曾被置于山奈属，后被Schu-mann［3］恢复．Larsen和Smith［41］认为其中的Camp-tandrayunnanensis从地理分布上看较近于大苞姜属，从形态上看该种苞片顶部延伸成叶状，花药全发育，非丁字型着生，顶端有明显的药隔附属体，基部无距，子房具上位腺体，与该属其余种有差别而将其归入大苞姜属．后来吴德邻［42］将其独立出来，成为1个单种属———苞叶姜属（Pyrgophyllum），这个属仅分布于中国的云南和四川．Haniffia包括2个种，从形态上看，与Scaphochlamy较为相似［43］．目前Camptandra、苞叶姜属、Haniffia的系统分类地位还不能确定．姜族共有25个属，本研究包括了其中20个属的种类，还有5个属（Haplochorema，Laosanthus，Nanochilus，Parakaempferia，Stadiochilus）未能获得材料．结果显示，我们选用的ITS和matK片段在解决姜族族内属间系统演化关系上显得能力不足．因此，今后的研究一方面应着眼于开发新的基因，如来自核DNA的单拷贝或低拷贝基因，为确定姜族与舞花姜族二者关系及族内属间的系统演化提供更有效的位点．另一方面扩大试验材料的采集范围，进一步确定呈并系类群的姜黄属、凹唇姜属与相关属的属间关系，以及姜属、山奈属的单系类群属性．致谢：W．JhonKress博士提供部分实验材料，在此表示感谢．参考文献：［1］高江云，夏永梅，黄加元，等．中国姜科花卉［M］．北京：科学出版社，2006．［2］吴德邻．姜科植物地理［J］．热带亚热带植物学报，1994，2：1-14．
第S1期［3］郑曼莉等：利用ITS（nrDNA）和matK（cpDNA）探讨姜族植物的系统发育431SCHUMANNK．Zingiberaceae［C］//EnglerA．DasPflanzenreichⅣ．Lepizig：W．Engelmann，1904，1-458．larevidence［J］．PlantSystematicsandEvolution，2002，230：143-159．［16］DOYLEJJ，DOYLEJSA．ArapidDNAisolationproce-dureforsmallquantitiesoffreshleaftissue［J］．Phyto-1987，19：11-15．chemicalBull，［17］WHITETJ，BRUNST，LEES，etal．Amplificationand［4］LOESENERT．Zingiberaceae［C］//EnglerA，PrantlK．NaturlichenPflanzenfamilien．Lepizig：W．Engelmann，1930，541-640．［5］HOLTTUMRE．TheZingiberaceaeofMalayPeninsula［J］．Gardens＇BulletinSingapore，1950，13：1-249．［6］BURTTBL，OLANTUNJIOA．ThelimitsofthetribeZingibereae［J］．NotesfromtheRoyalBotanicGardenEdinburgh，1972，167-169．［7］KRESSWJ．ThephylogenyandclassificationoftheZin-giberales［J］．MissouriBotanicalGarden，1990，7：698-721．［8］KRESSWJ，PRINCEL，WILLIAMSK．Thephylogenyandanewclassificationofthegingers（Zingiberace-ae）：evidencefrommoleculardata［J］．BotanicalSocAmerica，2002，9：1682-1696．［9］NGAMRIABSAKULC，NEWMANMF，CRONKQCB．ThephylogenyoftribeZingibereae（Zingiberaceae）basedonITS（nrDNA）andtrnL－F（cpDNA）se-quences［J］．EdinburghJournalofBotany，2004，60：483-507．［10］WILLIAMSKJ，KRESSWJ，MANOSPL．Thephy-logeny，evolution，andclassificationofthegenusGlobbaandtribeGlobbeae（Zingiberaceae）：appendagesdomatter［J］．AmericanJournalofBotany，2004，91：100-114．［11］NGAMRIABSAKULC，NEWMANMF，CRONKQCB．PhylogenyanddisjunctioninRoscoea（Zingiberaceae）［J］．EdinburghJournalofBotany，2000，57：39-61．［12］RANGSIRUJIA，NEWMANMF，CRONKQCB．AstudyoftheinfragenericclassificationofAlpina（Zin-giberaceae）basedontheITSregionofnuclearrDNAandthetrnL－FspacerofchloroplastDNA［C］//Wil-sonKL，MorrisonDA．Monocots-systematicsandevolu-tion．Australia：CSIRO，2000，695-709．［13］SEARLERJ，HEDDERSONTAJ．Apreliminaryphy-logenyoftheHedychieaetribe（Zingiberaceae）basedonITSsequencesofthenuclearrRNAcistron［C］//WilsonKL，MorrisonDA．Monocots-systematicsande-volution．Australia：CSIRO，2000，710-718．［14］WOODTH，WHITTENWM，WILLIAMSNH．Phyloge-nyofHedychiumandRelatedgenera（Zingiberaceae）BasedonITSsequencedata［J］．EdinburghJournalofBotany，2000，57：261-270．［15］TAKANOA，OKADAH．Multipleoccurrencesoftrip-loidformationinGlobba（Zingiberaceae）frommolecu-directsequencingoffungalribosomalRNAgenesforphylogenetics［C］//INNISMA，GELFANDDH，SNINSKYJJ，etal．PCRprotocols：aguidetomethodsandapplications．USA：AcademicPress，1990，315-322．18］STEELEPK，VILGALYSR．PhylogeneticanalysesofPolemoniaceaeusingnucleotidesequencesoftheplastidgenematK［J］．SystematicBotany，1994，19：126-142．19］MADISONWI．SeqManII，DNASTAR［CP］．1998．20］HALLTA．BioEdit：auser－friendlybiologicalse-quencealignmenteditorandanalysisprogramforWin-dows95/98/NT［J］．Nucleicacidssymposiumseries，1999，41：95-98．21］SWORFOORDDL．PAUP*4．0b10：Phylogenetica-nalysisusingparsimony（*andothermethods），betaversion［C］．Sunderland：SinauerAssociates，2002．22］FELSENSTEINJ．Confidencelimitsonphylogenies：anapproachusingthebootstrap［J］．Evolution，1985，39：783-791．23］HUELSENBECKJP，RONQUISTF．MRBAYES：Bayesianinferenceofphylogenetictrees［J］．Bioinfor-matics，2001，17：754-755．24］RONQUISTF，HUELSENBECKJP．MrBayes3：Bayesianphylogeneticinferenceundermixedmodels［J］．Bioinformatics，2003，19：1572-1574．25］POSADAD，CRANDALLKA．Modeltest：testingthemodelofDNAsubstitution［J］．Bioinformatics，1998，14：817-818．26］MABBERLEYDJ．ThePlantBook．Aportabledictiona-ryofthehigherplants［M］．London：CambridgeUniver-styPress，1993．27］WENDLEJF，SCHNABELA，SEELANANT．Bidirec-tionalinterlocusconcertedevolutionfollowingallopoly-ploidspeciationincotton（Gossypium）［J］．Proceed-ingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1995，92：80-284．28］NEWMANMF．Distichochlamys，anewgenusfromViet-nam［J］．EdinburghJournalofBotany，1995，52：65-69．29］LARSENK，NEWMANM．AnewspeciesofDisti-chochlamysfromVietnamandsomeobservationsonge-nericlimitsinHedychieae（Zingiberaceae）［J］．NaturalHistoryBulletinoftheSiamSociety，2001，49：77-80．［［［［［［［［［［［［
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2024年2月18日发(作者：赵小萍)
云南大学学报（自然科学版），2010，32（S1）：426～432JournalofYunnanUniversityCN53－1045/NISSN0258－7971利用ITS（nrDNA）和matK（cpDNA）探讨姜族植物的系统发育1，23郑曼莉，夏永梅（1．中国科学院西双版纳热带植物园植物进化生态学实验室，云南昆明650223；2．中国科学院研究生院，北京100049；3．中国科学院西双版纳热带植物园植物系统与保护生物学实验室，云南昆明650223）matK片段，摘要：姜族是姜科中最大的族，包括25个属，与舞花姜族共同组成姜亚科．本研究应用ITS，通Bayesian推断（BayesianInference）、过最大简约法（MaximumParsimony）、最大似然法（MaximumLikelihood）对获得的序列进行联合矩阵分析，构建基因树，对姜族与舞花姜族之间的关系及族内类群间的亲缘关系进行探讨．系统树的拓扑结构显示：①姜亚科为单系类群．②Distichochlamys与Scaphochlamys、象牙参属与距药姜属、直唇Smitha-姜属与喙花姜属是姐妹类群．③姜花属、象牙参属、山奈属、姜属是单系类群．④姜黄属与Paracautleya，tris，Hitchenia形成并系类群．⑤凹唇姜属与拟姜黄属成并系类群．ITS和matK片段对姜族内部深分支系统关系的解决力尚有不足，建议今后寻找新的分子标记进行更为深入的研究．关键词：姜族；姜科；ITS；matK；系统发育中图分类号：Q949；Q75文献标识码：A文章编号：0258－7971（2010）S1－0426－07姜科是热带、亚热带分布的植物类群，主要分布于南亚、东南亚和太平洋岛屿．全世界目前有53200余种，属，约1500种．我国有22属，主要分布［1－2］．于东南和西南各省区在经典分类学研究中，姜科的分类系统主要有［3－4］3个，、Holttum系统［5］分别是Schumann系统．姜科植物由于花期短暂［7］，花部［1］形态特征变异幅度小，不同类群间易存在性状和Burtt系统交叉［8］［6］，分类研究存在困难．Burtt的检索表自建立后的几年中也被证明是不完善的．［6］Holttum［5］认为姜属的侧生退化雄蕊呈裂片状（lobe），与姜族中其它侧生退化雄蕊通常较小或不存在的属有区别，姜属在此性状上更接近姜花族（Hedychieae），于是将其从姜族中提出放入姜花族，而将原来的姜族更名为山姜族（Alpinieae）．后来Burtt和Olatunji认为姜属药隔附属体突出在花药之上、包裹花柱、叶柄肿胀、维管束具厚角组织、这些特点与姜花族不同，于是将姜属独立成为姜族．Kress等［8］运近年来，随着分子系统学的发展，用nrDNAITS和cpDNAmatK序列对姜科4族41属104种的植物进行系统发育研究，构建了新的姜科分类系统．姜族被重新划分，包括了Burtt系统中的姜族、姜花族以及直唇姜属（Pommereschea）、喙Nanochilus和Stadiochilus，花姜属（Rhynchanthus）、共计25个属．并界定了新姜族植物的共同特征：植［6］姜族（Zingibereae）是姜科的一个重要类群，其分类系统在历史上变动较大．退化雄蕊（stamin-ode）是姜科植物的一个常用分类性状，通常具2或4枚，其中内轮的2枚联合成唇瓣（labellum），外轮的二枚称侧生退化雄蕊（lateralstaminode）．姜科模式属姜属（Zingiber）在Schumann系统中位于姜族，*收稿日期：2010－05－07基金项目：云南省自然科学基金资助项目（2007C111M）．作者简介：郑曼莉（1984－），女，云南人，硕士，主要从事植物系统发育方面的研究．E－mail：xiaym@xtbg．ac．cn．通讯作者：夏永梅，女，研究员，主要从事植物系统发育、生物地理方面的研究，
第S1期郑曼莉等：利用ITS（nrDNA）和matK（cpDNA）探讨姜族植物的系统发育427株二列叶平面与根状茎方向平行、绝大部分属具有大且呈花瓣状的侧生退化雄蕊、子房三室、中轴胎［8］Ngamriabsakul座．在Kress等研究的基础上，［9］等利用nrDNAITS和cpDNAtrnL－F对姜族做［9］了系统发育研究，由于trnL－F相对难以扩增，量和浓度．1．3ITS和matK片段的扩增与产物纯化ITS和matK片段扩增均使用rTaq酶（Takara）．ITS全5．8S，ITS2）扩增引物为ITS4和序列（包括ITS1，ITS5［17］．matK为mIF［8］和trnK2R［18］．反应体系均约有40%的样品未能测序得到trnL－F序列．因此在构建期待提高分支支持率的ITS和trnL－F基因联合树时，仅包括姜族16个属，23个种．在Kress等［8］重建的姜科分类系统中，姜族与舞花姜族（Globbeae）组成姜亚科（Zingiberoideae），舞花姜族的形态特征是植株个体较小（＜1m）、具有单室子房、侧膜胎座．大苞姜属（Caulokaempfe-ria）系统位置不能确定暂时被置于姜亚科．目前，在Kress等［8］和Williams等［10］的研究中姜亚科显示为单系类群，但亚科内的姜族与舞花姜族的关系还难下定论．舞花姜族仅在Kress等［8］研究中的ITS序列最大简约树、Williams等［10］研究中的ITS＆matK联合序列严格一致性简约树中构成单系分支，且支持率微弱．本研究采用Kress划定的姜科系统，在借鉴以往姜科系统发育研究经验的基础上［11－15］，选取姜科分子系统发育研究比较常用的rDNAITS（核糖体内转录间隔区）和cpDNAmatK（赖氨酸tRNA内含子内的成熟酶编码基因）片段作为基因标记，对姜族尽可能获得丰富的取样，构建基因联合树，探讨姜族的系统发育．本研究包括的种类除姜族20个属57个种外，还有舞花姜族3个属10个种，大苞姜属2个种，再次探讨姜族、舞花姜族、大苞姜属3者关系．1材料与方法1．1材料本研究的实验材料采集自中国科学院西双版纳热带植物园姜园，以及中国的云南、四川、广东3个省份，部分材料来自美国史密森研究院自然历史博物馆．内类群包括姜族20个属57个种、3个不定种，1变种，1疑似杂交种；大苞姜属2个种；舞花姜族3个属10个种．根据Kress等（2002）的研究，选择与姜亚科近缘的山姜亚科3个属各1个种作为系统发育研究的外类群．研究中部分种类的序列来源于GenBank，实验材料详细信息见表1．1．2植物总DNA的提取将野外采集的新鲜叶片用硅胶快速干燥，采用改良的3×CTAB法［16］提取总DNA，用1%的琼脂糖电泳检测总DNA的质为50μL，内含：5μL10×Buffer，4μLMgCl2（50mmol/L），2μLdNTPs（2．5mmol/L），正反引物各2μL（5μmol/L），约25ngDNA模板，3UrTaq酶．PCR扩增反应在Veriti96孔热循环仪上进行，ITS扩增反应程序：94℃预变性4min；94℃1min，55℃40s，72℃45s，29次循环；72℃延伸10min．matK扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃2min，55℃2min30s，72℃1min30s，35次循环；72℃延伸7min．产物用E．Z．N．AGel－extractionKitD2500－01（OMEGA）割胶纯化．1．4序列测定所有测序工作由上海生工工程技术有限公司和北京天根生化科技有限公司完成．ITS用ITS5直接正向测序．直接测序失败的个体，对PCR产物割胶回收目的片段，与pUCm－18T载体连接，转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用蓝白斑筛选初步确定阳性克隆，再次PCR后电泳确定为阳性克隆即可测序；matK序列用mIF、trnK2R及另一自行设计的引物mR（5’－AAC-TAGTCGGATGGAGTAG－3’）测通．1．5数据处理利用SeqMan［19］对序列进行编辑和拼接．对ITS和matK序列数据进行单独及联合序列矩阵构建．采用BioEdit［20］中的ClustalW程序对矩阵进行自动排序，并进行人工校对．简约法（Maximumparsimony，MP）分析用PAUP4．0b10软件［21］完成，采用启发式搜索（Heuristicsearch）1000次抽样，TBR枝长交换，每步保留10棵树，获取50%一致性系统进化树（50%majorityrulecon-sensustree）；进行靴带法（Bootstrapanalysis）检测［22］，1000次抽样，根据靴带支持率（boostrap，BS）评估各分支可靠性．Bayesian推断（Bayesianin-ference，BI）利用MrBayes3．1．2软件［23－24］完成，用Modeltest3．06软件［25］进行模型选择，ITS序列矩阵的最适合模型为：TrN+I+G，matK序列矩阵的最适合模型为：K81uf+G；Bayesian推断起始于一棵随机树，MCMC链（MarkovChainMonteCaelochains）运行100万代，每100代取样1次，摒弃前1000次老化样本（burn－insamples），用剩余样本构建50%一致性树并计算各分支的后验概率（pos-
428云南大学学报（自然科学版）第32卷teriorprobability，PP）［23］．似然法（Maximumlikeli-hood，ML）分析在http：//www．atgc－montpellier．fr/网上进行，该网采用PhyML3．0软件分析，采用靴带法检测，1000次抽样．2结果本研究共获得包括外类群在内共80个样品的ITS序列，72个样品的matK序列，72个样品的ITS＆matK联合序列，并对这些序列的单独及联合矩阵进行了相关的数据信息统计，统计分析的结果见表2．运用最大简约法、Bayesian推断和最大似然法进行系统树的构建，其中最大似然法构建的系统树拓扑结构和分支支持率与最大似然法分析结果大致相同．图1，2为最大简约法分析和Bayesian推断的50%一致性树，最大简约法分析中大于50的靴带支持率标注在各分支上，Bayesian推断中大于0．5的后验支持率标注在各分支上．较之最大简约法，Bayesian推断的后验支持率值较高，树构型（拓扑结构）也有所差别．对系统树的拓扑结构进行分析，结果表明：（1）整个姜亚科构成一个单系，在MP树中靴带支持率和BI树中后验支持率分别为100和1．00．姜族在MP分析中构成一个分支，支持率小于50．舞花姜族在MP和BI树中均未构成一个单系分支，族下的3个属中Gagnepaini与Hemiorchis构成姐妹群分支（BS=100，PP=1．00），舞花姜属（Globba）构成单系分支（BS=100，PP=1．00）．舞花姜族的这2个分支在MP树中依次位于姜亚科基部，姜族外部，在BI树中与姜族的4个分支成平行关系．（2）姜族构成2个分别包括姜花属（Hedychi-um）和姜黄属（Curcuma）在内的分支Ⅰ和分支Ⅱ（见图1，2），在MP树中靴带支持率都小于50%．在BI树中分支Ⅰ、分支Ⅱ分别具有0．68和1．00的后验支持率．分支Ⅰ：姜属（Zingiber）（BS=55，PP=1．00）、山奈属（Kaempferia）（BS=81，PP=1．00）、姜花属（BS=100，PP=1．00）、象牙参属（Roscoea）（BS=100，PP=1．00）在MP树和BI树中各自构成单系分支．Distichochlamys与Scaphochlamys（BS=92，PP=1．00），喙花姜属（Rhynchanthus）与直唇姜属（Pommereschea）（BS=82，PP=1．00）、象牙参属与距药姜属（Cautleya）（BS=98，PP=1．00）在MP树和BI树中均构成姐妹类群．Haniffia与大苞姜属（Caulokaempferia）聚为1个分支，靴带支持率小于50，后验支持率为0．54．凹唇姜属（Boesenbergia）物种呈并系类群．其中Boeⅰ白斑凹唇姜（Boesenber-giaalbomaculata）与拟姜黄属（Curcumopha）聚为一支（BS=88，PP=1．00）．分支Ⅰ中除Haniffia/大苞姜属分支外的其余类群构成1个分支，MP树中靴带支持率小于50，BI树中具有0．74的后验支持率．姜属、山奈属、Cornukaempferia、Distichochlamys、Scaphochlamys、白斑凹唇姜/拟姜黄属几个分支构成CladeA，在MP树中支持率小于50，BI树中支持率为1．00．分支Ⅱ：Paracautleya，Hitchenia位于姜黄属分支内，使姜黄属成为并系类群（BS=99，PP=1．00）．联合矩阵分析中缺乏Smithatris，对ITS单基因矩阵分析的结果表明，该并系类群包括Smith-atris．姜黄属并系类群与土田七属（Stahlianthus）成姐妹类群（BS=100，PP=1．00）．Camptandra、苞叶姜属（Pyrgophyllum）在MP树中分别位于分支Ⅱ的基部，相应分支支持率小于50，在BI树中这2个属与姜族和舞花姜族各分支成平行关系．3讨论3．1姜族与舞花姜族的关系分析结果显示，姜亚科为单系类群．姜亚科的部分深分支在最大简约法中靴带支持率低于50，但在Bayesian推断中获得较高后验率，但鉴于后验率一般大于0．90才有意义，所以对于这些分支的讨论需十分谨慎，各分析中姜族浅分支支持率相对较高．舞花姜族在各分析中均未构成单系，姜族在最大简约法分析中虽然构成1个分支，但是支持率小于50．目前ITS和matK片段提供的分子系统发育学证据无法确定舞花姜族和姜族二者的关系．在形态上，舞花姜族具有单室子房、侧膜胎座，唇瓣基部与花丝联合的特征将其与姜族区分开，但这些区别并不是严格的，在姜族的大苞姜属、Scaphochlamys、Paracautleya、Siphonochilus中有部分种为单室子房，直唇姜属也具有唇瓣基部与花丝连合的特征．姜族单系地位在简约法分析中获得弱的支持，但是并没有在姜族中发现易观察到的共有衍征（syna-pomorphy）．不过姜族与舞花姜族的近缘关系是可以确定的，二者构成姜亚科，是一个确定的单系，该
第S1期郑曼莉等：利用ITS（nrDNA）和matK（cpDNA）探讨姜族植物的系统发育429［31］亚科的共有特征为二列叶平面与根状茎方向平行，，是（4）姜花属姜花属全球约有80个种这一性状将其与其他亚科区分开．3．2姜族系统的演化关系在姜族内部，尽管ITS和matK提供的信息有限，对内部分支间的系统关系分辨力不高．不过对系统树的分析我们仍然可以得到一些较有价值的结论．山奈属、Disti-chochlamys/Scaphochlamys、象牙参属/距药姜属、姜花属、直唇姜属/喙花姜属、姜黄属并系类群几个分支在ITS＆matK的简约法分析和Bayesian推断中获得一致的支持．对于这几个分支，下面依次做讨论：（1）山奈属约有50个种，主要分布在印度，中国南部和马来西亚地区［26］．山奈属植物植株低矮，具块状根茎，须根常膨大，无明显的地上茎．分析支持山奈属为单系类群．在单基因矩阵分析中发现（结果未列出），山奈属在ITS单基因系统树里的支持率低于matK，这与该属ITS序列变异度大有关，其他属属内种间ITS序列差异（sequencedi-vergence）范围0～13．94%（matK为0～1．31%），山奈属为2．89%～20．31%（matK为0～0．99%）．由于ITS是一个多拷贝基因，且存在明显的趋同进化［27］，山奈属ITS序列变异度大可能是因为趋同效应在该属中作用不明显，还保存着多态性的ITS拷贝．（2）Distichochlamys和ScaphochlamysDisti-chochlamys为越南特有属，Scaphochlamys分布在马来西亚和泰国．在基于形态学的研究中，二者的亲缘关系得到不同学者的一致认可［28－29］．它们形态特征非常相似，主要差别仅在于Distichochlamys苞片为二列覆瓦状排列，小苞片管状，而Scaphochlamy苞片螺旋状排列，小苞片非管状．分析结果强烈支持Distichochlamys和Scaphochlamys成为姐妹类群．（3）象牙参属和距药姜属象牙参属分布在喜马拉雅地区（中国、印度、尼泊尔、锡金、克什米尔），海拔1200～4880m之间［30］，包括18个种．分析结果显示象牙参属为单系类群，这一结果支持Cowley［11］的研究结论．象牙参属和距药姜属是姐妹类群，二者的亲缘关系具有地理分布和形态学方面的证据，它们同为姜族中分布海拔较高的属，分布区部分重叠且形态相似，苞片内都为单花，侧生退化雄蕊椭圆形花瓣状，唇瓣两裂，药隔于基部延伸成距状［11，30］．姜科中唯一一个从热带到高海拔地区分布的大属，为热带亚洲和马达加斯加间断分布的类群，主要分布在亚洲热带、亚热带区域，其现代分布中心为喜马拉雅地区．该属的形态特征是：侧生退化雄蕊长，线形或披针形；苞片革质，宿存；花丝通常较长，花药背着；唇瓣显著，微凹或二裂．姜花属在Wood等［14］和Kress等［8］的研究中呈现为单系类群，本研究中姜花属构成单系（分支且获得较高支持率，支持姜花属为单系类群）．（5）直唇姜属和喙花姜属直唇姜属和喙花姜属侧生退化雄蕊缺失，因此在形态学分类上一直以来被归入侧生退化雄蕊小或不存在的山姜族［32－33］．分析结果中这2个属为姐妹类群并位于姜族内，在Bayesian推断中这一姐妹群分支位于分支Ⅰ，分支Ⅰ具有0．78的后验支持率．由于二者均具有三室子房，中轴胎座，与舞花姜族差异较大，结合分子系统学的证据，本研究支持Kress［8］和Wood［14］的研究中将二者置于姜族的分类处理．（6）姜黄属并系类群在系统树中，姜黄属与Paracautleya，Hitchenia成并系类群，由于实验没有获得Smithatris的matK序列，故联合矩阵中不包括Smithatris．对ITS矩阵进行分析（系统树未列出），结果表明Smithatris也位于这一并系类群内部，在本研究中此并系类群与土田七属成姐妹类群．由于对姜黄属物种的取样存在差异，在Kress等［8］与Ngamriabsakul等［9］的研究中均显示，土田七属也位于姜黄属并系类群内部．这5个属形态较为相似，其中土田七属具钟状总苞，与苞片多枚且紧密排列的其余4个属相区别．姜黄属与Paracautleya的主要区别在于前者苞片连生，每苞片内有数朵小花，具有小苞片，唇瓣微凹鲜少开裂，后者苞片离生，每苞片内仅有一朵小花，小苞片缺失，唇瓣开裂．Skornickova等［34］通过观察活体植物和标本发现Paracautleya与姜黄属的区分性状并不是绝对的，于是将Paracautleya归入姜黄属．Smithatris和Hitchenia在形态上最为接近，二者具有相似的植株特点和花序特征，叶有柄，花序梗都较长，有紧密排列的囊状苞片，并且二者开花后花冠管都会螺旋状后缩，使花藏于苞片内．本研究的ITS分析结果中没有发现Smithatris和Hitchenia有特别的亲缘关系．在Kress等［8］的研究中认为姜黄属并系类群内部较高的支持率更倾向于将姜黄属分割为几个属，
430云南大学学报（自然科学版）第32卷而不是接受包括另外4个属的广义姜黄属．Ngam-riabsakul等［9］总结了这5个属的形态性状差异，认为这些差异性状为自体衍症（autapomorphic），5个属应该归并为一属．在本研究中，由于对姜黄属物种取样有限，尚不明确姜黄属与Smithatris、Hitche-nia、土田七属的关系．目前对于姜黄属与Paracaut-leya、Smithatris、Hitchenia、土田七属的分类处理问题已成为姜科分类研究的一个热点．在以后的系统发育研究中扩大采样范围，观察更多活体材料及标本对解决这一问题是非常必要的．（7）其它姜族内不具有明显假茎的几个属：山奈属、Cornukaempferia、Distichochlamys、Scaphochlamys、凹唇姜属、拟姜黄属在系统树的拓扑结构中显示出一定的近缘关系，几个属构成一个分支，姜属具有明显的假茎，也位于这一分支内部．该分支中除Distichochlamys和Scaphochlamys构成姐妹类群外，其余各属间的系统演化关系并不清楚．凹唇姜属是一个包括约60个种的大属，主要分布在热带亚洲［35］．系统树拓扑结构显示，凹唇姜属为并系类群，在Kress等［8］和Ngamriabsakul等［9］的研究中凹唇姜属也呈现为并系类群．在前者的研究中拟姜黄属和凹唇姜属的部分物种成姐妹类群，后者的研究中大苞姜属和凹唇姜属的部分物种成姐妹类群．本研究中白斑凹唇姜与拟姜黄属成姐妹类群．拟姜黄属是Rao和Verma［36］提出的一个单种属（monotypic），与凹唇姜属的差别在于花序由根茎发出，苞片螺旋状排列，退化雄蕊杯状．Larsen［37］认为这些性状不足以将其与凹唇姜属区分，建议将该属归入凹唇姜属．大苞姜属在本研究中未表现出与凹唇姜属有近缘关系，系统位置不确定．可能的原因是本次实验未取样到与大苞姜属近缘的凹唇姜属种，例如Ngamriabsakul等［9］研究中的Boesenbergiaaurantiaca和Boesenbergiacordata．结合前人的研究，我们认为凹唇姜属本身是一个并系类群，有一部分种与拟姜黄属和大苞姜属关系较近．Ngamriabsakul和Techaprasan［38］结合染色体计数与分子系统发育分析，认为凹唇姜属的进化以染色体基数为10和12的2条路径进行．基于这一结论，有否可能凹唇姜属具有不同染色体基数的2个进化分支各自与拟姜黄属和大苞姜属有某些联系，对于这一问题的回答，需要在对凹唇姜属采样较完全的基础上进行．Cornukaempferia具有和姜属非常相似的向前延伸成长喙状的药隔附属体［14，39］，但Mood和Larsen［40］认为它与山奈属植株形态相似，二者均无明显地上茎，植株矮小更近缘．在我们的实验结果中，Cornukaempferia未显示出与任何一方有更近的亲缘关系，它在整个姜族分支中系统关系不能确定．姜属是姜科的模式属，分布于亚洲的热带，亚热带地区，约有80个种，分析中姜属单系地位获得支持．姜属侧生退化雄蕊与唇瓣基部合生，这一特征将其与姜族的其他类群区分开，对其单系属性的进一步确定，还需扩大采样范围．Camptandra曾被置于山奈属，后被Schu-mann［3］恢复．Larsen和Smith［41］认为其中的Camp-tandrayunnanensis从地理分布上看较近于大苞姜属，从形态上看该种苞片顶部延伸成叶状，花药全发育，非丁字型着生，顶端有明显的药隔附属体，基部无距，子房具上位腺体，与该属其余种有差别而将其归入大苞姜属．后来吴德邻［42］将其独立出来，成为1个单种属———苞叶姜属（Pyrgophyllum），这个属仅分布于中国的云南和四川．Haniffia包括2个种，从形态上看，与Scaphochlamy较为相似［43］．目前Camptandra、苞叶姜属、Haniffia的系统分类地位还不能确定．姜族共有25个属，本研究包括了其中20个属的种类，还有5个属（Haplochorema，Laosanthus，Nanochilus，Parakaempferia，Stadiochilus）未能获得材料．结果显示，我们选用的ITS和matK片段在解决姜族族内属间系统演化关系上显得能力不足．因此，今后的研究一方面应着眼于开发新的基因，如来自核DNA的单拷贝或低拷贝基因，为确定姜族与舞花姜族二者关系及族内属间的系统演化提供更有效的位点．另一方面扩大试验材料的采集范围，进一步确定呈并系类群的姜黄属、凹唇姜属与相关属的属间关系，以及姜属、山奈属的单系类群属性．致谢：W．JhonKress博士提供部分实验材料，在此表示感谢．参考文献：［1］高江云，夏永梅，黄加元，等．中国姜科花卉［M］．北京：科学出版社，2006．［2］吴德邻．姜科植物地理［J］．热带亚热带植物学报，1994，2：1-14．
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