2024年3月12日发(作者：国英发)
黄酒酵母ADH2、ALD2和ALD6基因敲除对黄酒中乙醛代谢的
影响
刘华;孙军勇;谢广发;陆健;吴殿辉;李童;吴宗文
【摘 要】以工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3(MATa ura3)为出发菌株,
研究分别敲除乙醛代谢相关酶的编码基因ADH2、ALD2和ALD6对乙醛代谢的影响.采
用融合PCR技术分别构建乙醇脱氢酶编码基因ADH2敲除组件“ADH2S-URA3-ADH2X”
和乙醛脱氢酶编码基因ALD2和ALD6敲除组件“ALD2S-URA3-ALD2X”和“ALD6S-
URA3-ALD6X”,转化N85尿嘧啶缺陷型单倍体菌株后,以尿嘧啶缺陷型的恢复为筛选标
记,分别获得ADH2、ALD2和ALD6基因缺失菌株2a-A2(△adh2)、2a-D2(△ald2)和2a-
D6(△ald6).分别将获得的工程菌与亲本菌株以及前期构建的丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失
菌株2a-P5(△pdc5)进行实验室规模的黄酒发酵实验.结果表明,与亲本菌株2a相比,工程菌
2a-A2发酵液中乙醛含量降低了7.14％,而2a-P5发酵液中乙醛含量降低了32.68％,说明
工业黄酒酵母乙醛的生成存在糖代谢途径,并且乙醛主要由丙酮酸脱羧而来;工程菌2a-D2
和2a-D6发酵液中乙醛含量与亲本相比分别增加了144.91％和88.87％,说明乙醛脱氢酶
是黄酒中控制乙醛降解的关键酶,而且ALD2基因在乙醛转化为乙酸过程中发挥更关键的
作用.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2016(042)011
【总页数】6页(P1-6)
【关键词】黄酒酵母;基因敲除;ADH2;ALD2和ALD6;乙醛
【作 者】刘华;孙军勇;谢广发;陆健;吴殿辉;李童;吴宗文
【作者单位】江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南
大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏无
锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学工
业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏无
锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏无锡,214122;中国绍兴黄酒集团有限公司,国家黄
酒工程技术研究中心,浙江绍兴,312000;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江
苏无锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生
物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无
锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生物工
程学院,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无
锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生物工
程学院,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无
锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生物工
程学院,江苏无锡,214122
【正文语种】中 文
黄酒是世界三大古酒之一，同时也是中华民族传统酒，因其蛋白质、氨基酸、维生素
和对人体有益的微量矿物元素含量丰富，被誉为“液体蛋糕”[1]。黄酒在酿造过程中会
产生一定量的醛类物质[2]，包括乙醛、糠醛、苯乙醛、异戊醛、苯甲醛等。其中，乙醛
含量最高(29.9～137.48 mg/L)，风味阈值为1.2 mg/L[3]，风味强度高，对黄酒风味的
影响大，其风味特征为微醛臭，似果香，味甜带涩。另外黄酒中以乙醛为主的低级醛含量
过高是黄酒后劲大、引起上头的主要原因之一[4]。
目前，已知的酿酒酵母中乙醛的生物形成途径如图1[5-6]所示，酵母通过糖酵解途径
将碳水化合物分解成丙酮酸，丙酮酸脱羧酶将丙酮酸脱羧形成乙醛，形成的乙醛既可以由
乙醇脱氢酶还原成乙醇，又能通过乙醛脱氢酶氧化成乙酸，乙酸在乙酰辅酶A合成酶的
催化下形成乙酰辅酶A。FABIENNE等研究发现,敲除啤酒酵母中ALD6的2个等位基因
时，突变菌株发酵产生的乙醛含量与出发菌株相比，增加了148.4%[7]；而BRIGITE对
葡萄酒工业酵母的研究显示，敲除编码乙醛脱氢酶的ALD6基因，在合成培养基上发酵所
得乙醛含量由39 mg/L降至18 mg/L[8]，说明ALD6基因的缺失对啤酒酵母和葡萄酒酵
母乙醛的影响不同。ARANDA通过研究葡萄酒酿酒菌株中乙醛脱氢酶的活力，推翻了以
往研究所得ALD6基因是编码乙醛脱氢酶的主要基因的结论，认为ALD2基因才是乙醛脱
氢酶的主要编码基因[9]。
以往的研究表明，虽同为酿酒酵母，但由于遗传背景不同，不同酒种酿酒酵母中乙醛
的代谢途径、关键酶及其影响可能存在差异。目前关于工业黄酒酵母中乙醛的代谢途径及
其关键酶尚无明确报道。因此，本文针对工业黄酒酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)N85，采用自克隆技术，以酿酒酵母遗传工程中重要的遗传标记URA3为筛选
标记[10]，通过构建ADH2、ALD2和ALD6基因缺失菌株，再结合本实验室前期构建的
丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失菌株，对工业黄酒酵母中乙醛的代谢途径进行研究，从而为
降低黄酒中乙醛含量的研究提供基础。
1.1 材料
1.1.1 菌株与培养基
出发菌株：工业黄酒酵母N85(Saccharomyces cerevisiae)尿嘧啶缺陷型单倍体2a-
u3(MATa ura3)；亲本菌株：工业黄酒酵母N85(Saccharomyces cerevisiae)单倍体
2a(MATa)；丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失酵母菌株，命名为2a-P5，均由本实验室保存。
YPD培养基[11]：用于酵母菌的培养和保存。
SD-Ura培养基：购自Sigma公司，用于筛选和验证转化子。
1.1.2 酶与试剂
Ex Taq DNA聚合酶、r Taq DNA聚合酶、Prime STAR DNA聚合酶：宝生物工程
(大连)有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒：生工生物工程(上海)有限公司；
乙醛(GC)：阿拉丁公司；氯化钠(AR)、无水乙醇(GR)：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器与设备
85 μm DVB/CAR/PDMS手动固相微萃取头、SPME手动手柄；美国Supelco公司；
Thermo Fisher Trace1300/ISQ GC/MS气相色谱-质谱仪，赛默飞世尔科技公司；DB-
WAX毛细管柱(60 mm×0.25 mm，0.25 μm)，安捷伦科技有限公司；PCR仪L96G，
杭州郎基科学仪器有限公司。
1.1.4 引物
本实验所用PCR反应引物如表1，依据NCBI中公布的酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae S288c)ADH2、ALD2、ALD6和URA3基因序列，采用DNAMAN软件设计
二者的扩增引物。具体引物用途如下：引物A2-1/A2-2、D2-1/D2-2和D6-1/D6-2分
别用于扩增ADH2、ALD2和ALD6上游同源臂序列；引物A2-3/A2-4、D2-3/D2-4和
D6-3/D6-4分别用于扩增两端带有重叠序列的“URA3”片段；引物A2-5/A2-6、D2-
5/D2-6和D6-5/D6-6分别用于扩增ADH2、ALD2和ALD6下游同源臂序列。
1.2 实验方法
1.2.1 ADH2基因缺失酵母工程菌的构建
ADH2基因缺失酵母工程菌的构建过程如图2所示。
以N85酵母基因组为模板，分别以A2-1/A2-2、A2-3/A2-4、A2-5/A2-6为引物，
用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，分别将产物进行纯化回收得ADH2上游同源臂
(A2-S)、两端带有重叠序列的“URA3”片段及ADH2下游同源臂(A2-X)。基于融合
PCR的原理[11]，采用一种高效构建基因组件的方法[12]，以A2-S、“URA3”、A2-X
为模板，用Prime STAR DNA聚合酶进行融合PCR反应。
融合PCR反应体系为：5×Ps Buffer 5 μL；dNTP Mix 2 μL；A2S片段6 μL；
URA3片段6 μL；A2X片段6 μL；Prime STARTM酶0.25 μL。
融合PCR反应程序为：预变性95℃ 4 min；变性98℃ 15 s；初始退火温度65℃
15 s，每个循环递减1℃，共15个循环；延伸72℃ 2 min 50 s；终延伸72℃ 10 min。
再以融合PCR反应产物为模板，A2-1/A2-6为引物，ExTaq DNA聚合酶进行融合
片段的全长扩增，获得ADH2基因敲除组件“A2S-URA3-A2X”。
1.2.2 ALD2基因缺失酵母工程菌的构建
ALD2基因缺失组件的构建原理与ADH2基因缺失组件相同，如图2所示。
以N85酵母基因组为模板，分别以D2-1/D2-2、D2-3/D2-4、D2-5/D2-6为引物，
用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，分别将产物进行纯化回收得ALD2上游同源臂
(D2-S)、两端带有重叠序列的“URA3”片段及ALD2下游同源臂(D2-X)。基于融合PCR
的原理，采用一种高效构建基因组件的方法，以D2-S、“URA3”、D2-X为模板，用
Prime STAR DNA聚合酶进行融合PCR反应，以此产物为模板，D2-1/D2-6为引物，
ExTaq DNA聚合酶进行融合片段的全长扩增，获得ALD2基因敲除组件“D2S-URA3-
D2X”。
1.2.3 ALD6基因缺失酵母工程菌的构建
ALD6基因缺失组件的构建原理也与ADH2基因缺失组件相同，如图2所示。
以N85酵母基因组为模板，分别以D6-1/D6-2、D6-3/D6-4、D6-5/D6-6为引物，
用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，分别将产物进行纯化回收得ALD6上游同源臂
(D6-S)、两端带有重叠序列的“URA3”片段及ALD6下游同源臂(D6-X)。基于融合PCR
的原理，采用一种高效构建基因组件的方法，以D6-S、“URA3”、D6-X为模板，用
Prime STAR DNA聚合酶进行融合PCR反应，以此产物为模板，D6-1/D6-6为引物，
ExTaq DNA聚合酶进行融合片段的全长扩增，获得ALD6基因敲除组件“D6S-URA3-
D6X”。
1.2.4 工业黄酒酵母的转化
采用醋酸锂转化法[13]进行。
1.2.5 转化子的鉴定
将转化后的菌液涂布于SD-Ura平板上，30℃倒置培养2～3 d至转化子长出，提取
转化子的基因组DNA，分别以A2-1/A2-6、D2-1/D2-6和D6-1/D6-6为引物进行PCR
扩增鉴定，最后对正确的PCR扩增条带进行胶回收，测序验证。
1.2.6 发酵实验
将亲本菌株和工程菌株按相同的工艺条件分别进行实验室规模的黄酒发酵实验[14]。
1.2.7 分析方法
(1)发酵液的酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮和pH：依照黄酒国标GB/T 13662—
2008进行测定[15]。
(2)丙酮酸、乙酸含量的测定[16]：样品以12 000 g离心10 min，吸取上清液稀释
适当倍数后，过滤保存在4℃备用。
(3)乙醛含量的测定[17-19]：采用HS-SPME-GC-MS法测定黄酒中的乙醛。
1.3 统计分析方法
采用Excel 2013进行单因素方差分析。
2.1 工程菌的构建与鉴定
2.1.1 基因敲除组件的构建
利用融合PCR获得ADH2、ALD2和ALD6基因敲除组件。琼脂糖电泳分析如图3
所示，组件片段大小与理论预计大小相符，表明融合成功。
2.1.2 转化子验证
将上述构建的ADH2、ALD2和ALD6基因敲除组件转化进工业黄酒酵母尿嘧啶缺陷
型单倍体菌株2a-u3，并涂布于SD-Ura平板上。由于SD-Ura培养基缺少酵母生长所必
需的尿嘧啶，因此尿嘧啶营养缺陷型菌株无法在其上面生长，从而使得阳性转化子进行富
集。根据这一特性，挑取转化子涂布于SD-Ura平板上，以尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3
为对照，初步鉴定长出的转化子即为阳性转化子，如图4所示。
以提取后的阳性转化子基因组DNA为模板，亲本菌株2a为阴性对照，分别以A2-
1/A2-6、D2-1/D2-6和D6-1/D6-6为引物，进行PCR全长验证。如图5所示，阴性对
照只能扩增出1 000 bp左右大小的ADH2基因片段，空白对照无条带，两个转化子都有
一条1 700 bp左右大小的“ADH2S-URA3-ADH2X”扩增片段，与预期结果一致，证明
ADH2基因敲除组件成功整合到酿酒酵母基因组上，ADH2基因被敲除，将此菌株命名为
2a-A2。同理，图6和图7分别证明ALD2和ALD6基因缺失组件已整合进酵母工程菌的
基因组，命名为2a-D2和2a-D6。
2.2 不同工程菌黄酒发酵实验
2.2.1 黄酒常规理化指标的比较
将构建的2a-A2、2a-D2和2a-D6菌株和实验室前期构建的2a-P5菌株以及亲本菌
株2a进行实验室规模的黄酒发酵实验并测定其常规理化指标，结果如表2所示。从表2
中可看出，4株工程菌株发酵的黄酒常规理化指标与亲本菌株2a相比无明显差异，说明
敲除工业黄酒酵母中乙醛代谢相关酶的编码基因对黄酒常规理化指标无明显影响。
2.2.2 乙醛及其相关代谢物的含量
在考察不同工业黄酒酵母工程菌株发酵后乙醛含量的同时，本文也研究了与乙醛代谢
相关的其他物质含量的变化。在酵母乙醛代谢途径中，与其代谢密切相关的物质有丙酮酸
和乙酸，含量变化如表3所示。
丙酮酸脱羧酶主要负责将丙酮酸脱羧转化为乙醛，它主要由PDC1、PDC5和PDC6
三个基因编码。
ADH2基因编码乙醇脱氢酶，在乙醇脱氢酶的作用下，酵母将乙醇转变成乙醛。本研
究将构建的乙醇脱氢酶基因ADH2缺失菌株2a-A2和丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失菌株
2a-P5分别进行黄酒发酵，产生的乙醛含量与亲本菌株2a相比，分别下降了7.14%和
32.7%，工程菌2a-P5发酵所产丙酮酸含量高于亲本菌株，这表明黄酒中的乙醛是通过糖
代谢途径形成，与亲本菌株相比，2a-P5发酵所得乙醛含量的下降幅度高于乙醇脱氢酶基
因缺失菌株，可以认为乙醛主要是由糖代谢得到的丙酮酸脱羧而来，由乙醇转化而来的乙
醛含量少，丙酮酸脱羧酶是该途径中的关键酶。
乙醛脱氢酶可以催化乙醛氧化为乙酸，其编码基因有ALD2、ALD3、ALD4、ALD5
和ALD6[21]。与亲本菌株相比，ALD2和ALD6基因缺失菌株2a-D2和2a-D6黄酒发
酵液中乙醛的含量分别增加了144.92%和88.87%，分别敲除工业黄酒酵母的ALD2和
ALD6基因，乙醛生成乙酸的途径受阻，乙醛累积以致含量上升，同时2a-D2和2a-D6
菌株发酵液中乙酸含量低于亲本菌株，说明乙醛脱氢酶对工业黄酒酵母乙醛的降解有显著
影响；与亲本菌株相比，ALD2基因缺失菌株乙醛含量上升幅度高于ALD6基因缺失菌株，
表明ALD2基因在乙醛转化为乙酸的过程中发挥更关键的作用。
综上所述，工业黄酒酵母中乙醛主要由酵母通过糖代谢途径由丙酮酸脱羧产生，而后
由乙醛脱氢酶催化降解为乙酸，并且丙酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶都是其关键酶。
以工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3(MATa ura3)为出发菌株，敲除乙
醇脱氢酶编码基因ADH2后，发酵液中乙醛含量比亲本菌株降低了7.14%；敲除丙酮酸
脱羧酶基因PDC5后，发酵液中乙醛含量比亲本菌株降低了32.68%；敲除乙醛脱氢酶编
码基因ALD2和ALD6后，发酵液中乙醛含量比亲本菌株分别增加了144.91%和
88.87%。以上结果说明，工业黄酒酵母N85中乙醛的生成存在糖代谢途径，乙醛主要由
丙酮酸脱羧而来，基因PDC5是控制这一过程的关键基因；乙醛脱氢酶是控制乙醛降解为
乙酸的关键酶，基因ALD2是控制这一降解过程的关键基因。为了对工业黄酒酵母中乙醛
的代谢进行更为全面的了解，下一步将敲除乙醛代谢途径中乙酰辅酶A脱氢酶的编码基
因，以及同时敲除乙醛代谢途径的多个编码基因，构建多基因缺失突变体来进行黄酒发酵，
为构建低产乙醛黄酒酵母工程菌提供理论基础。
【相关文献】
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2024年3月12日发(作者：国英发)
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【年(卷),期】2016(042)011
【总页数】6页(P1-6)
【关键词】黄酒酵母;基因敲除;ADH2;ALD2和ALD6;乙醛
【作 者】刘华;孙军勇;谢广发;陆健;吴殿辉;李童;吴宗文
【作者单位】江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南
大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏无
锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122;江南大学工
业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏无
锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏无锡,214122;中国绍兴黄酒集团有限公司,国家黄
酒工程技术研究中心,浙江绍兴,312000;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江
苏无锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生
物工程学院,江苏无锡,214122;江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无
锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,生物工
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【正文语种】中 文
黄酒是世界三大古酒之一，同时也是中华民族传统酒，因其蛋白质、氨基酸、维生素
和对人体有益的微量矿物元素含量丰富，被誉为“液体蛋糕”[1]。黄酒在酿造过程中会
产生一定量的醛类物质[2]，包括乙醛、糠醛、苯乙醛、异戊醛、苯甲醛等。其中，乙醛
含量最高(29.9～137.48 mg/L)，风味阈值为1.2 mg/L[3]，风味强度高，对黄酒风味的
影响大，其风味特征为微醛臭，似果香，味甜带涩。另外黄酒中以乙醛为主的低级醛含量
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目前，已知的酿酒酵母中乙醛的生物形成途径如图1[5-6]所示，酵母通过糖酵解途径
将碳水化合物分解成丙酮酸，丙酮酸脱羧酶将丙酮酸脱羧形成乙醛，形成的乙醛既可以由
乙醇脱氢酶还原成乙醇，又能通过乙醛脱氢酶氧化成乙酸，乙酸在乙酰辅酶A合成酶的
催化下形成乙酰辅酶A。FABIENNE等研究发现,敲除啤酒酵母中ALD6的2个等位基因
时，突变菌株发酵产生的乙醛含量与出发菌株相比，增加了148.4%[7]；而BRIGITE对
葡萄酒工业酵母的研究显示，敲除编码乙醛脱氢酶的ALD6基因，在合成培养基上发酵所
得乙醛含量由39 mg/L降至18 mg/L[8]，说明ALD6基因的缺失对啤酒酵母和葡萄酒酵
母乙醛的影响不同。ARANDA通过研究葡萄酒酿酒菌株中乙醛脱氢酶的活力，推翻了以
往研究所得ALD6基因是编码乙醛脱氢酶的主要基因的结论，认为ALD2基因才是乙醛脱
氢酶的主要编码基因[9]。
以往的研究表明，虽同为酿酒酵母，但由于遗传背景不同，不同酒种酿酒酵母中乙醛
的代谢途径、关键酶及其影响可能存在差异。目前关于工业黄酒酵母中乙醛的代谢途径及
其关键酶尚无明确报道。因此，本文针对工业黄酒酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)N85，采用自克隆技术，以酿酒酵母遗传工程中重要的遗传标记URA3为筛选
标记[10]，通过构建ADH2、ALD2和ALD6基因缺失菌株，再结合本实验室前期构建的
丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失菌株，对工业黄酒酵母中乙醛的代谢途径进行研究，从而为
降低黄酒中乙醛含量的研究提供基础。
1.1 材料
1.1.1 菌株与培养基
出发菌株：工业黄酒酵母N85(Saccharomyces cerevisiae)尿嘧啶缺陷型单倍体2a-
u3(MATa ura3)；亲本菌株：工业黄酒酵母N85(Saccharomyces cerevisiae)单倍体
2a(MATa)；丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失酵母菌株，命名为2a-P5，均由本实验室保存。
YPD培养基[11]：用于酵母菌的培养和保存。
SD-Ura培养基：购自Sigma公司，用于筛选和验证转化子。
1.1.2 酶与试剂
Ex Taq DNA聚合酶、r Taq DNA聚合酶、Prime STAR DNA聚合酶：宝生物工程
(大连)有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒：生工生物工程(上海)有限公司；
乙醛(GC)：阿拉丁公司；氯化钠(AR)、无水乙醇(GR)：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器与设备
85 μm DVB/CAR/PDMS手动固相微萃取头、SPME手动手柄；美国Supelco公司；
Thermo Fisher Trace1300/ISQ GC/MS气相色谱-质谱仪，赛默飞世尔科技公司；DB-
WAX毛细管柱(60 mm×0.25 mm，0.25 μm)，安捷伦科技有限公司；PCR仪L96G，
杭州郎基科学仪器有限公司。
1.1.4 引物
本实验所用PCR反应引物如表1，依据NCBI中公布的酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae S288c)ADH2、ALD2、ALD6和URA3基因序列，采用DNAMAN软件设计
二者的扩增引物。具体引物用途如下：引物A2-1/A2-2、D2-1/D2-2和D6-1/D6-2分
别用于扩增ADH2、ALD2和ALD6上游同源臂序列；引物A2-3/A2-4、D2-3/D2-4和
D6-3/D6-4分别用于扩增两端带有重叠序列的“URA3”片段；引物A2-5/A2-6、D2-
5/D2-6和D6-5/D6-6分别用于扩增ADH2、ALD2和ALD6下游同源臂序列。
1.2 实验方法
1.2.1 ADH2基因缺失酵母工程菌的构建
ADH2基因缺失酵母工程菌的构建过程如图2所示。
以N85酵母基因组为模板，分别以A2-1/A2-2、A2-3/A2-4、A2-5/A2-6为引物，
用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，分别将产物进行纯化回收得ADH2上游同源臂
(A2-S)、两端带有重叠序列的“URA3”片段及ADH2下游同源臂(A2-X)。基于融合
PCR的原理[11]，采用一种高效构建基因组件的方法[12]，以A2-S、“URA3”、A2-X
为模板，用Prime STAR DNA聚合酶进行融合PCR反应。
融合PCR反应体系为：5×Ps Buffer 5 μL；dNTP Mix 2 μL；A2S片段6 μL；
URA3片段6 μL；A2X片段6 μL；Prime STARTM酶0.25 μL。
融合PCR反应程序为：预变性95℃ 4 min；变性98℃ 15 s；初始退火温度65℃
15 s，每个循环递减1℃，共15个循环；延伸72℃ 2 min 50 s；终延伸72℃ 10 min。
再以融合PCR反应产物为模板，A2-1/A2-6为引物，ExTaq DNA聚合酶进行融合
片段的全长扩增，获得ADH2基因敲除组件“A2S-URA3-A2X”。
1.2.2 ALD2基因缺失酵母工程菌的构建
ALD2基因缺失组件的构建原理与ADH2基因缺失组件相同，如图2所示。
以N85酵母基因组为模板，分别以D2-1/D2-2、D2-3/D2-4、D2-5/D2-6为引物，
用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，分别将产物进行纯化回收得ALD2上游同源臂
(D2-S)、两端带有重叠序列的“URA3”片段及ALD2下游同源臂(D2-X)。基于融合PCR
的原理，采用一种高效构建基因组件的方法，以D2-S、“URA3”、D2-X为模板，用
Prime STAR DNA聚合酶进行融合PCR反应，以此产物为模板，D2-1/D2-6为引物，
ExTaq DNA聚合酶进行融合片段的全长扩增，获得ALD2基因敲除组件“D2S-URA3-
D2X”。
1.2.3 ALD6基因缺失酵母工程菌的构建
ALD6基因缺失组件的构建原理也与ADH2基因缺失组件相同，如图2所示。
以N85酵母基因组为模板，分别以D6-1/D6-2、D6-3/D6-4、D6-5/D6-6为引物，
用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，分别将产物进行纯化回收得ALD6上游同源臂
(D6-S)、两端带有重叠序列的“URA3”片段及ALD6下游同源臂(D6-X)。基于融合PCR
的原理，采用一种高效构建基因组件的方法，以D6-S、“URA3”、D6-X为模板，用
Prime STAR DNA聚合酶进行融合PCR反应，以此产物为模板，D6-1/D6-6为引物，
ExTaq DNA聚合酶进行融合片段的全长扩增，获得ALD6基因敲除组件“D6S-URA3-
D6X”。
1.2.4 工业黄酒酵母的转化
采用醋酸锂转化法[13]进行。
1.2.5 转化子的鉴定
将转化后的菌液涂布于SD-Ura平板上，30℃倒置培养2～3 d至转化子长出，提取
转化子的基因组DNA，分别以A2-1/A2-6、D2-1/D2-6和D6-1/D6-6为引物进行PCR
扩增鉴定，最后对正确的PCR扩增条带进行胶回收，测序验证。
1.2.6 发酵实验
将亲本菌株和工程菌株按相同的工艺条件分别进行实验室规模的黄酒发酵实验[14]。
1.2.7 分析方法
(1)发酵液的酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮和pH：依照黄酒国标GB/T 13662—
2008进行测定[15]。
(2)丙酮酸、乙酸含量的测定[16]：样品以12 000 g离心10 min，吸取上清液稀释
适当倍数后，过滤保存在4℃备用。
(3)乙醛含量的测定[17-19]：采用HS-SPME-GC-MS法测定黄酒中的乙醛。
1.3 统计分析方法
采用Excel 2013进行单因素方差分析。
2.1 工程菌的构建与鉴定
2.1.1 基因敲除组件的构建
利用融合PCR获得ADH2、ALD2和ALD6基因敲除组件。琼脂糖电泳分析如图3
所示，组件片段大小与理论预计大小相符，表明融合成功。
2.1.2 转化子验证
将上述构建的ADH2、ALD2和ALD6基因敲除组件转化进工业黄酒酵母尿嘧啶缺陷
型单倍体菌株2a-u3，并涂布于SD-Ura平板上。由于SD-Ura培养基缺少酵母生长所必
需的尿嘧啶，因此尿嘧啶营养缺陷型菌株无法在其上面生长，从而使得阳性转化子进行富
集。根据这一特性，挑取转化子涂布于SD-Ura平板上，以尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3
为对照，初步鉴定长出的转化子即为阳性转化子，如图4所示。
以提取后的阳性转化子基因组DNA为模板，亲本菌株2a为阴性对照，分别以A2-
1/A2-6、D2-1/D2-6和D6-1/D6-6为引物，进行PCR全长验证。如图5所示，阴性对
照只能扩增出1 000 bp左右大小的ADH2基因片段，空白对照无条带，两个转化子都有
一条1 700 bp左右大小的“ADH2S-URA3-ADH2X”扩增片段，与预期结果一致，证明
ADH2基因敲除组件成功整合到酿酒酵母基因组上，ADH2基因被敲除，将此菌株命名为
2a-A2。同理，图6和图7分别证明ALD2和ALD6基因缺失组件已整合进酵母工程菌的
基因组，命名为2a-D2和2a-D6。
2.2 不同工程菌黄酒发酵实验
2.2.1 黄酒常规理化指标的比较
将构建的2a-A2、2a-D2和2a-D6菌株和实验室前期构建的2a-P5菌株以及亲本菌
株2a进行实验室规模的黄酒发酵实验并测定其常规理化指标，结果如表2所示。从表2
中可看出，4株工程菌株发酵的黄酒常规理化指标与亲本菌株2a相比无明显差异，说明
敲除工业黄酒酵母中乙醛代谢相关酶的编码基因对黄酒常规理化指标无明显影响。
2.2.2 乙醛及其相关代谢物的含量
在考察不同工业黄酒酵母工程菌株发酵后乙醛含量的同时，本文也研究了与乙醛代谢
相关的其他物质含量的变化。在酵母乙醛代谢途径中，与其代谢密切相关的物质有丙酮酸
和乙酸，含量变化如表3所示。
丙酮酸脱羧酶主要负责将丙酮酸脱羧转化为乙醛，它主要由PDC1、PDC5和PDC6
三个基因编码。
ADH2基因编码乙醇脱氢酶，在乙醇脱氢酶的作用下，酵母将乙醇转变成乙醛。本研
究将构建的乙醇脱氢酶基因ADH2缺失菌株2a-A2和丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失菌株
2a-P5分别进行黄酒发酵，产生的乙醛含量与亲本菌株2a相比，分别下降了7.14%和
32.7%，工程菌2a-P5发酵所产丙酮酸含量高于亲本菌株，这表明黄酒中的乙醛是通过糖
代谢途径形成，与亲本菌株相比，2a-P5发酵所得乙醛含量的下降幅度高于乙醇脱氢酶基
因缺失菌株，可以认为乙醛主要是由糖代谢得到的丙酮酸脱羧而来，由乙醇转化而来的乙
醛含量少，丙酮酸脱羧酶是该途径中的关键酶。
乙醛脱氢酶可以催化乙醛氧化为乙酸，其编码基因有ALD2、ALD3、ALD4、ALD5
和ALD6[21]。与亲本菌株相比，ALD2和ALD6基因缺失菌株2a-D2和2a-D6黄酒发
酵液中乙醛的含量分别增加了144.92%和88.87%，分别敲除工业黄酒酵母的ALD2和
ALD6基因，乙醛生成乙酸的途径受阻，乙醛累积以致含量上升，同时2a-D2和2a-D6
菌株发酵液中乙酸含量低于亲本菌株，说明乙醛脱氢酶对工业黄酒酵母乙醛的降解有显著
影响；与亲本菌株相比，ALD2基因缺失菌株乙醛含量上升幅度高于ALD6基因缺失菌株，
表明ALD2基因在乙醛转化为乙酸的过程中发挥更关键的作用。
综上所述，工业黄酒酵母中乙醛主要由酵母通过糖代谢途径由丙酮酸脱羧产生，而后
由乙醛脱氢酶催化降解为乙酸，并且丙酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶都是其关键酶。
以工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3(MATa ura3)为出发菌株，敲除乙
醇脱氢酶编码基因ADH2后，发酵液中乙醛含量比亲本菌株降低了7.14%；敲除丙酮酸
脱羧酶基因PDC5后，发酵液中乙醛含量比亲本菌株降低了32.68%；敲除乙醛脱氢酶编
码基因ALD2和ALD6后，发酵液中乙醛含量比亲本菌株分别增加了144.91%和
88.87%。以上结果说明，工业黄酒酵母N85中乙醛的生成存在糖代谢途径，乙醛主要由
丙酮酸脱羧而来，基因PDC5是控制这一过程的关键基因；乙醛脱氢酶是控制乙醛降解为
乙酸的关键酶，基因ALD2是控制这一降解过程的关键基因。为了对工业黄酒酵母中乙醛
的代谢进行更为全面的了解，下一步将敲除乙醛代谢途径中乙酰辅酶A脱氢酶的编码基
因，以及同时敲除乙醛代谢途径的多个编码基因，构建多基因缺失突变体来进行黄酒发酵，
为构建低产乙醛黄酒酵母工程菌提供理论基础。
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