2024年3月15日发(作者：佴流如)

TaKaRa Code：

DRR081A

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II

（Perfect Real Time）

(200

次量

)

目 录

内 容

●制品说明

●制品内容

●适用的Real Time PCR扩增仪

●保 存

●

TaKaRa Ex Taq

TM

HS活性定义

●纯 度

●Real Time PCR性能检测

●试剂盒原理

●试剂盒特长

●操作注意

●Real Time PCR操作顺序

●操作方法

◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法

◆应用ABI PRISM 7000/7700/7900 HT，

7300/7500/7500 Fast Real - Time PCR的操作方法

◆应用Light Cycler Real Time PCR扩增仪的操作方法

●PCR反应条件说明

●进行RT-PCR反应时的实验方法

●反应例

●引物设计说明

●引物设计服务说明：

本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务

●问 答

◆特别提示：

本制品请于4℃避光保存，避免冻结制品！

页 码

1

1

1

1

1

1

2

2

2

2

3

3

3

4

5

7

7

9

9

10

10

●制品说明

本制品是采用SYBR

®

Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。制品中已经将DNA聚合酶、反

应用Buffer、dNTP、SYBR

®

Green I等试剂预混在一起，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验

时，PCR反应液的配制十分方便简单。

本制品Buffer经过改良，使反应特异性比SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：

DRR041）更高。抑制非特异性反应，能够在更广的范围内进行准确定量。本Buffer和改良后的Hot Start

法用DNA聚合酶

TaKaRa Ex Taq

TM

HS组合使用，可以进行再现性好、可信度高的Real Time PCR解析。

本制品适合于Thermal Cycler Dice

TM

Real Time System、ABI PRISM 7000/7700/7900HT、

7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCR System 、LightCycler、Line-Gene

等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可使用于需要Dye的Real

Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加

BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。

本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

●制品内容

（50 μl反应×200次）

●适用的Real Time PCR扩增仪

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（Perfect Real Time）（2×Conc.）*1 1.0 ml ×5支

ROX Reference Dye（50×Conc.）*2 200 μl ×1支

ROX Reference Dye II（50×Conc.）*2 200 μl ×1支

*1 内含

TaKaRa Ex Taq

TM

HS，dNTP Mixture，Mg

2+

，SYBR

®

Green I等。

*2 只使用在ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上，用以校正孔与孔之

间产生的荧光信号误差。使用ABI PRISM 7000/7700/7900HT和7300 Real-Time PCR

System使用ROX Reference Dye，7500 Real-Time PCR System和7500 Fast Real-Time

PCR System使用ROX Reference Dye II。Thermal Cycler Dice Real Time System、

LightCycler、Line-Gene等Real Time PCR扩增仪时不必使用。

Thermal Cycler Dice

®

Real Time System（TaKaRa Code: TP800）

ABI PRISM7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR

System（Applied Biosystems）

LightCycler（Roche Diagnostics）

Line-Gene（Bioer，杭州博日）

其他各种Real Time PCR扩增仪

注：Smart Cycler

®

System（Cepheid）推荐使用DRR041试剂

●保 存

TM

●

TaKaRa Ex Taq

HS活性定义

●纯 度

4℃避光保存，避免冻结制品。反复冻融制品性能可能下降，请避免冻结制品。

用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃、30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不

溶物的活性定义为1个活性单位（U）。

1）10 U的本酶和0.6 μg的λDNA-

Hin

d III在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

2）10 U的本酶和0.6 μg的Supercoiled pBR322 DNA在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

3）10 U的本酶和0.6 μg的λDNA在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

-1-

●Real Time PCR性能检测

使用Thermal Cycler Dice

®

Real Time System扩增仪，以HL60 cDNA为模板进行Real Time PCR扩增

（扩增产物分别为56 bp和184 bp），通过SYBR

®

Green I荧光信号的检测，确认具有良好及稳定的Real

Time PCR扩增性能。

●试剂盒原理

本制品使用了改良后的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBR Green I的荧光强

度，达到监控PCR产物扩增量的目的。

1． 本制品中的DNA聚合酶使用了改良后的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS，并结合TaKaRa独自开发的Buffer系

统，可以有效抑制非特异性PCR扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。

2． 嵌合荧光检测法。

SYBR

®

Green I与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBR

®

Green I荧光强

度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

具体原理见下图。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR

®

Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR

反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解

温度。

2．引物退火

3．延伸反应

1．热变性

Polymerase

Primer

荧光物质

●试剂盒特长

1． 适用于Real Time PCR反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。

2． 在2×浓度的Premix中，预先混有SYBR

®

Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌

蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。

3． DNA聚合酶使用了改良后的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与TaKaRa公

●操作注意

司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

1． 本制品请于4℃避光保存，避免冻结制品。反复冻融制品性能可能下降。

2． 使用时请上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。

3． 本制品中含有荧光染料SYBR

®

Green I，保存制品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

4． 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。

-2-

●Real Time PCR操作顺序

1． 上下颠倒混匀试剂，然后用离心机轻微离心收集后使用。

注）避免用振荡器混匀，剧烈振荡会降低制品性能。

以下操作请在冰上进行，长时间室温放置会降低制品性能。

2． 配制PCR反应用混合液，分装至PCR反应管中。

3． 添加PCR扩增用模板。

4． 使用Real Time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。

注）1. 反应液配制方法和PCR扩增条件请参照使用方法。

2. Real Time PCR仪的使用方法，请参照各种仪器说明书。

3. 本制品使用了抗

Taq

抗体，进行Hot Start法PCR扩增。

●操作方法

◆应用Thermal Cycler Dice

TM

Real Time System扩增仪的操作方法

请按照Thermal Cycler Dice

TM

Real Time System（TaKaRa Code：TP800）的使用说明书要求

进行实验操作。

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

SYBR

®

Premix Ex Taq

II（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

TM

使用量

12.5 μl

1 μl

1 μl

2 μl

8.5 μl

终浓度

1×

0.4 μM*1

0.4 μM*1

*2

PCR Reverse Primer（10 μM）

DNA模板

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total 25 μl*3

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在

0.2～1.0 μM范围内调整引物浓度。

*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的

靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步

的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

*3 建议反应液体积为25 μl。

② 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推

荐使用30秒的条件。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝

试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Repeat：1

95℃ 10秒

Stage 2：PCR反应

Repeat：40

95℃ 5秒

60℃ 30秒

Stage 3：Dissociation

-3-

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的

化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。

如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在

PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、10秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试 剂

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

ROX Reference Dye（50×）or

ROX Reference Dye II（50×）*3

DNA模板

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total

使用量

10.0 μl

0.8 μl

0.8 μl

0.4 μl

2.0 μl

6.0 μl

20.0 μl

使用量

25.0 μl

◆应用ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的

操作方法

终浓度

1×

2.0 μl 0.4 μM *1

2.0 μl 0.4 μM *1

1.0 μl

4.0 μl

1×

*2

16.0 μl

50.0 μl *4

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内

调整引物浓度。

*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，

必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为

DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

*3 ROX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time

PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50×）。

与使用ROX Reference Dye（50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全相同。使

用ABI PRISM7000/7700/7900HT及7300 Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye

（50×）。

*4 96孔板、Single-Tube、8联Tube采用50 μl反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal Cycling

plate采用20 μ

l反应体系。

② 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR

条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三

步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。

-4-

< ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 10秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 5秒

60℃ 30～34秒*

Dissociation Stage

* 使用7700和7900HT时请设定在30秒。

使用7000和7300时请设定在31秒。

使用7500时请设定在34秒。

<7500 Fast Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 10秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 3秒

60℃ 25秒

Dissociation Stage

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的

化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。

如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在

PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、10秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法

请按照LightCycler（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作。

-5-

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试 剂

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

DNA模板

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

使 用 量

10.0 μl 1×

终 浓 度

0.8 μl 0.4 μM *1

0.8 μl 0.4 μM *1

2.0 μl

6.4 μl

*2

Total 20.0 μl

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内

调整引物浓度。

*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，

必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为

DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

② 进行Real Time PCR反应。

PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入LightCycler中进行Real Time PCR反应。建议采用

下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优

化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR

扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

95℃ 10秒 20℃/秒

1 Cycle

Stage 2：PCR反应

95℃ 5秒 20℃/秒

60℃ 20秒 20℃/秒

40 Cycles

Stage 3：融解曲线分析

95℃ 0秒 20℃/秒

65℃ 15秒 20℃/秒

95℃ 0秒 0.1℃/秒

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的

化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。

如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在

PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、10秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

-6-

●PCR反应条件说明

【预变性】

Step

预变性

【两步法PCR】

Step

变性

【三步法PCR】

Step

退火

延伸

55℃～60℃10～20秒OFF

变性

温度时间检测说明

以基因组DNA为模板时，通常设置30秒，可以延

长至1分钟（超过1分钟有时反应不稳定)。使用

500 bp以下的模板时，不必设置预变性步骤。

95℃

10～30秒

OFF

温度

95℃

时间

3～5秒　

20～30秒

检测

OFF

说明

Real Time PCR扩增片段通常在300 bp以下，只

需进行95℃、3～5秒的变性设置。

首先采用60℃、20秒的条件设定，反应温度可在

60～66℃范围内进行调整。反应性能较差时，可

以适当增加这一步的反应时间或采用三步法进行

PCR反应。

退火/延伸60℃～66℃

（25、30、31、34秒）*

ON

温度

95℃

时间

3～5秒　

检测

OFF

说明

Real Time PCR扩增片段通常在300 bp以下，只

需进行95℃、3～5秒的变性设置。

有非特异性产物产生或者扩增效率不好时，可以

适当对退火温度进行调整。有时适当延长退火时

间，也可以改善扩增效率。

扩增片段在300 bp以下时，请在6～15秒范围内确

定延伸时间，延伸时间过长容易产生非特异性扩

增。

6～15秒

72℃ON

（25、30、31、34秒）*

* 使用Applied Biosystems公司Real Time PCR扩增仪时必须根据仪器型号设定不同时间。

7700/7900HT设定为30秒，7000/7300设定为31秒，7500设定为34秒，7500 Fast设定为25秒。

【循环圈数】 30～45 Cycles

●进行RT-PCR反应时的实验方法

进行RT-PCR反应时，使用SYBR

®

PrimeScript

TM

RT-PCR Kit II（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：

DRR083A）更为方便。SYBR

®

PrimeScript

TM

RT-PCR Kit由二部分组成，即：PrimeScript

TM

RT

reagents Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR037A）和SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（Perfect

Real Time）（TaKaRa Code：DRR081A，即本制品）。这二部分试剂可以同时购买（TaKaRa Code：

DRR083A），也可以单独购买。

-7-

1． 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制）。

使用PrimeScript

TM

RT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR037A）试剂。

试 剂

5×PrimeScript

TM

Buffer

Random 6 mers（100 μM）*1

PrimeScript

TM

RT Enzyme Mix I

Oligo dT Primer(50 μM)*1

Total RNA

RNase Free dH

2

O

Total

*1 Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。

Primer

Oligo dT Primer(50 μM)

Random 6 mers（100 μM）

Gene Specific Primer（2 μM）

使 用 量

0.5 μl

0.5 μl

0.5 μl

加 入 量

25 pmol

50 pmol

1 pmol

使 用 量

2 μl

0.5 μl

0.5 μl

0.5 μl

X μl

up to 10 μl

10 μl*2

*2 反应体积可按需求相应放大，10 μl的反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

2． 反转录反应条件如下：

37℃ 15 min（反转录反应）*3

85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）

4℃

*3：使用Gene Specific Primer时，逆转录反应条件请使用42℃ 15min；

PCR产物有非特性产物生成时，逆转录温度设为50℃对PCR反应特异性扩增有时会有所改善。

3． 按下列组份配制PCR反应液（反应液请在冰上配制）。

（使用Thermal Cycler Dice

®

Real Time System时）

试 剂

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

使 用 量

12.5 μl

1 μl

1 μl

X μl

22.5～24 μl

Total

4． 将上述PCR反应液加入Real Time PCR用反应管中，然后再加入2.5～1 μl*的RT反应液（或

RT反应的稀释液），保证最终反应体积为25 μl。

* RT反应液的加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。

-8-

●反应例

通过RT-PCR对Mouse Gapdh mRNA进行检出，

cDNA量相当于Total RNA 6.4 pg~100 ng。dH

2

O

做为Negative Control用模板。

●引物设计说明

进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物非常重要。根据以下原则，可以设计PCR

扩增效率高，反应特异性强的良好引物。

◆ PCR扩增产物长度： 80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

◆ 设计引物要求如下：

Tm值

引物长度

GC含量

17～25 mers

40～60%（45～55%最佳）

Forward Primer和Reverse Primer的Tm值不能相差太大。

Tm值的计算使用专用软件。

OLIGO *1： 63～68℃

Primer3 *2：60～65℃

A、G、C、T整体分布尽量均匀。

引物序列

不要有部分的GC rich或AT rich（特别是3'端）。

避开T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的连续结构。

避免GC rich或AT rich。

3'末端序列

3'端碱基最好为G或C。

尽量避免3'末端碱基为T。

互补序列

特异性

避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3'末端避

开有2个碱基以上的互补序列。

使用BLAST *3检索确认引物的特异性。

*1 OLIGO: Primer Analysis Software。

*2 Primer3: （/ftp/distribution/software/）

*3

/BLAST/

-9-

●引物设计服务说明：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务

本公司以美国NCBI Data Base上登录的Human、Mouse、Rat的RefSeq（Human 21,000种，Mouse

17,000种，Rat 4,900种）为对象，已经设计完成了各基因用于定量表达分析的Real Time RT-PCR用

高特异性Primer Set，此Primer Set最适于本制品使用，可省略PCR反应条件优化实验。具体情况如下：

可提供1～3对合适的引物，由客户自己选择。

1. 从3’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。

2. 从5’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。

3. 针对Target基因全长的引物候补序列。

●问答

Q1. SYBR

Premix

Ex Taq

II为什么要于4℃保存？

A1. 经本公司实验证明，反复冻融制品性能可能下降。因此，我们推荐本制品于4℃避光保存，避免冻结。

Q2. 使用SYBR

Premix Ex Taq

II时，是否要对Mg

2+

浓度进行研讨？

A2. 使用SYBR

Premix Ex Taq

II时，不需要对Mg

2+

浓度进行研讨。实验时首先请使用本公司说明书推

荐的PCR反应条件，如果得不到良好实验结果时请研讨PCR反应条件，改变使用的PCR引物等。

Q3. SYBR

Premix Ex Taq

II的PCR扩增对使用引物有何要求？

A3. PCR用制品的DNA扩增性能与引物种类有一定的内在关系，本公司提拱SYBR Green I嵌合荧光

法的PCR或RT-PCR用引物的免费设计服务，详细情况请参见本说明书的「引物设计说明」部分。

使用TaKaRa设计推荐的引物，将更适合于SYBR

Premix Ex Taq

II的Real Time PCR扩增。

A4.

Q4. 使用ABI PRISM仪器时，是否需要进行了95℃ 10分钟的变性步骤？

本制品不需要使用这一长时间的变性步骤，请遵照本公司说明书的实验条件要求进行PCR反应。

Q5. 使用ABI PRISM仪器时实验结果不好，融解曲线无主峰，为什么？

A5. SYBR

Premix Ex Taq

II中不含有ROX Reference Dye，在制品包装中另外附有。进行Real Time

PCR反应时需在反应体系中添加ROX Reference Dye，在反应体系中不添加ROX Reference Dye

时，融解曲线图将会产生无主峰的一条紊乱的波浪线。

A6.

Q6. 和某些公司制品相比，SYBR

Premix Ex Taq

II制品的颜色较淡，为什么？

有些公司的Premix制品中已经加有ROX Reference Dye，所以颜色较深。而SYBR

Premix Ex Taq

II在制品中没有添加ROX Reference Dye，但在制品包装中另外附有，所以SYBR

Premix Ex Taq

II颜色较淡。

注）公司免费为客户提供Real Time PCR用引物、探针的设计服务，只收取DNA合成费用！

-10-

V2008.04.02

2024年3月15日发(作者：佴流如)

TaKaRa Code：

DRR081A

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II

（Perfect Real Time）

(200

次量

)

目 录

内 容

●制品说明

●制品内容

●适用的Real Time PCR扩增仪

●保 存

●

TaKaRa Ex Taq

TM

HS活性定义

●纯 度

●Real Time PCR性能检测

●试剂盒原理

●试剂盒特长

●操作注意

●Real Time PCR操作顺序

●操作方法

◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法

◆应用ABI PRISM 7000/7700/7900 HT，

7300/7500/7500 Fast Real - Time PCR的操作方法

◆应用Light Cycler Real Time PCR扩增仪的操作方法

●PCR反应条件说明

●进行RT-PCR反应时的实验方法

●反应例

●引物设计说明

●引物设计服务说明：

本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务

●问 答

◆特别提示：

本制品请于4℃避光保存，避免冻结制品！

页 码

1

1

1

1

1

1

2

2

2

2

3

3

3

4

5

7

7

9

9

10

10

●制品说明

本制品是采用SYBR

®

Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。制品中已经将DNA聚合酶、反

应用Buffer、dNTP、SYBR

®

Green I等试剂预混在一起，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验

时，PCR反应液的配制十分方便简单。

本制品Buffer经过改良，使反应特异性比SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：

DRR041）更高。抑制非特异性反应，能够在更广的范围内进行准确定量。本Buffer和改良后的Hot Start

法用DNA聚合酶

TaKaRa Ex Taq

TM

HS组合使用，可以进行再现性好、可信度高的Real Time PCR解析。

本制品适合于Thermal Cycler Dice

TM

Real Time System、ABI PRISM 7000/7700/7900HT、

7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCR System 、LightCycler、Line-Gene

等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可使用于需要Dye的Real

Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加

BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。

本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

●制品内容

（50 μl反应×200次）

●适用的Real Time PCR扩增仪

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（Perfect Real Time）（2×Conc.）*1 1.0 ml ×5支

ROX Reference Dye（50×Conc.）*2 200 μl ×1支

ROX Reference Dye II（50×Conc.）*2 200 μl ×1支

*1 内含

TaKaRa Ex Taq

TM

HS，dNTP Mixture，Mg

2+

，SYBR

®

Green I等。

*2 只使用在ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上，用以校正孔与孔之

间产生的荧光信号误差。使用ABI PRISM 7000/7700/7900HT和7300 Real-Time PCR

System使用ROX Reference Dye，7500 Real-Time PCR System和7500 Fast Real-Time

PCR System使用ROX Reference Dye II。Thermal Cycler Dice Real Time System、

LightCycler、Line-Gene等Real Time PCR扩增仪时不必使用。

Thermal Cycler Dice

®

Real Time System（TaKaRa Code: TP800）

ABI PRISM7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR

System（Applied Biosystems）

LightCycler（Roche Diagnostics）

Line-Gene（Bioer，杭州博日）

其他各种Real Time PCR扩增仪

注：Smart Cycler

®

System（Cepheid）推荐使用DRR041试剂

●保 存

TM

●

TaKaRa Ex Taq

HS活性定义

●纯 度

4℃避光保存，避免冻结制品。反复冻融制品性能可能下降，请避免冻结制品。

用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃、30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不

溶物的活性定义为1个活性单位（U）。

1）10 U的本酶和0.6 μg的λDNA-

Hin

d III在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

2）10 U的本酶和0.6 μg的Supercoiled pBR322 DNA在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

3）10 U的本酶和0.6 μg的λDNA在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

-1-

●Real Time PCR性能检测

使用Thermal Cycler Dice

®

Real Time System扩增仪，以HL60 cDNA为模板进行Real Time PCR扩增

（扩增产物分别为56 bp和184 bp），通过SYBR

®

Green I荧光信号的检测，确认具有良好及稳定的Real

Time PCR扩增性能。

●试剂盒原理

本制品使用了改良后的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBR Green I的荧光强

度，达到监控PCR产物扩增量的目的。

1． 本制品中的DNA聚合酶使用了改良后的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS，并结合TaKaRa独自开发的Buffer系

统，可以有效抑制非特异性PCR扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。

2． 嵌合荧光检测法。

SYBR

®

Green I与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBR

®

Green I荧光强

度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

具体原理见下图。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR

®

Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR

反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解

温度。

2．引物退火

3．延伸反应

1．热变性

Polymerase

Primer

荧光物质

●试剂盒特长

1． 适用于Real Time PCR反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。

2． 在2×浓度的Premix中，预先混有SYBR

®

Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌

蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。

3． DNA聚合酶使用了改良后的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与TaKaRa公

●操作注意

司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

1． 本制品请于4℃避光保存，避免冻结制品。反复冻融制品性能可能下降。

2． 使用时请上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。

3． 本制品中含有荧光染料SYBR

®

Green I，保存制品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

4． 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。

-2-

●Real Time PCR操作顺序

1． 上下颠倒混匀试剂，然后用离心机轻微离心收集后使用。

注）避免用振荡器混匀，剧烈振荡会降低制品性能。

以下操作请在冰上进行，长时间室温放置会降低制品性能。

2． 配制PCR反应用混合液，分装至PCR反应管中。

3． 添加PCR扩增用模板。

4． 使用Real Time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。

注）1. 反应液配制方法和PCR扩增条件请参照使用方法。

2. Real Time PCR仪的使用方法，请参照各种仪器说明书。

3. 本制品使用了抗

Taq

抗体，进行Hot Start法PCR扩增。

●操作方法

◆应用Thermal Cycler Dice

TM

Real Time System扩增仪的操作方法

请按照Thermal Cycler Dice

TM

Real Time System（TaKaRa Code：TP800）的使用说明书要求

进行实验操作。

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

SYBR

®

Premix Ex Taq

II（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

TM

使用量

12.5 μl

1 μl

1 μl

2 μl

8.5 μl

终浓度

1×

0.4 μM*1

0.4 μM*1

*2

PCR Reverse Primer（10 μM）

DNA模板

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total 25 μl*3

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在

0.2～1.0 μM范围内调整引物浓度。

*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的

靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步

的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

*3 建议反应液体积为25 μl。

② 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推

荐使用30秒的条件。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝

试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Repeat：1

95℃ 10秒

Stage 2：PCR反应

Repeat：40

95℃ 5秒

60℃ 30秒

Stage 3：Dissociation

-3-

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的

化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。

如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在

PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、10秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试 剂

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

ROX Reference Dye（50×）or

ROX Reference Dye II（50×）*3

DNA模板

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

Total

使用量

10.0 μl

0.8 μl

0.8 μl

0.4 μl

2.0 μl

6.0 μl

20.0 μl

使用量

25.0 μl

◆应用ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的

操作方法

终浓度

1×

2.0 μl 0.4 μM *1

2.0 μl 0.4 μM *1

1.0 μl

4.0 μl

1×

*2

16.0 μl

50.0 μl *4

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内

调整引物浓度。

*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，

必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为

DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

*3 ROX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time

PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50×）。

与使用ROX Reference Dye（50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全相同。使

用ABI PRISM7000/7700/7900HT及7300 Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye

（50×）。

*4 96孔板、Single-Tube、8联Tube采用50 μl反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal Cycling

plate采用20 μ

l反应体系。

② 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR

条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三

步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。

-4-

< ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 10秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 5秒

60℃ 30～34秒*

Dissociation Stage

* 使用7700和7900HT时请设定在30秒。

使用7000和7300时请设定在31秒。

使用7500时请设定在34秒。

<7500 Fast Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 10秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 3秒

60℃ 25秒

Dissociation Stage

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的

化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。

如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在

PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、10秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法

请按照LightCycler（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作。

-5-

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试 剂

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

DNA模板

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

使 用 量

10.0 μl 1×

终 浓 度

0.8 μl 0.4 μM *1

0.8 μl 0.4 μM *1

2.0 μl

6.4 μl

*2

Total 20.0 μl

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内

调整引物浓度。

*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，

必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为

DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

② 进行Real Time PCR反应。

PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入LightCycler中进行Real Time PCR反应。建议采用

下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优

化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR

扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

95℃ 10秒 20℃/秒

1 Cycle

Stage 2：PCR反应

95℃ 5秒 20℃/秒

60℃ 20秒 20℃/秒

40 Cycles

Stage 3：融解曲线分析

95℃ 0秒 20℃/秒

65℃ 15秒 20℃/秒

95℃ 0秒 0.1℃/秒

◆特别提示：

本制品中使用的

TaKaRa Ex Taq

TM

HS是利用抗

Taq

抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的

化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。

如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在

PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、10秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

-6-

●PCR反应条件说明

【预变性】

Step

预变性

【两步法PCR】

Step

变性

【三步法PCR】

Step

退火

延伸

55℃～60℃10～20秒OFF

变性

温度时间检测说明

以基因组DNA为模板时，通常设置30秒，可以延

长至1分钟（超过1分钟有时反应不稳定)。使用

500 bp以下的模板时，不必设置预变性步骤。

95℃

10～30秒

OFF

温度

95℃

时间

3～5秒　

20～30秒

检测

OFF

说明

Real Time PCR扩增片段通常在300 bp以下，只

需进行95℃、3～5秒的变性设置。

首先采用60℃、20秒的条件设定，反应温度可在

60～66℃范围内进行调整。反应性能较差时，可

以适当增加这一步的反应时间或采用三步法进行

PCR反应。

退火/延伸60℃～66℃

（25、30、31、34秒）*

ON

温度

95℃

时间

3～5秒　

检测

OFF

说明

Real Time PCR扩增片段通常在300 bp以下，只

需进行95℃、3～5秒的变性设置。

有非特异性产物产生或者扩增效率不好时，可以

适当对退火温度进行调整。有时适当延长退火时

间，也可以改善扩增效率。

扩增片段在300 bp以下时，请在6～15秒范围内确

定延伸时间，延伸时间过长容易产生非特异性扩

增。

6～15秒

72℃ON

（25、30、31、34秒）*

* 使用Applied Biosystems公司Real Time PCR扩增仪时必须根据仪器型号设定不同时间。

7700/7900HT设定为30秒，7000/7300设定为31秒，7500设定为34秒，7500 Fast设定为25秒。

【循环圈数】 30～45 Cycles

●进行RT-PCR反应时的实验方法

进行RT-PCR反应时，使用SYBR

®

PrimeScript

TM

RT-PCR Kit II（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：

DRR083A）更为方便。SYBR

®

PrimeScript

TM

RT-PCR Kit由二部分组成，即：PrimeScript

TM

RT

reagents Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR037A）和SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（Perfect

Real Time）（TaKaRa Code：DRR081A，即本制品）。这二部分试剂可以同时购买（TaKaRa Code：

DRR083A），也可以单独购买。

-7-

1． 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制）。

使用PrimeScript

TM

RT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR037A）试剂。

试 剂

5×PrimeScript

TM

Buffer

Random 6 mers（100 μM）*1

PrimeScript

TM

RT Enzyme Mix I

Oligo dT Primer(50 μM)*1

Total RNA

RNase Free dH

2

O

Total

*1 Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。

Primer

Oligo dT Primer(50 μM)

Random 6 mers（100 μM）

Gene Specific Primer（2 μM）

使 用 量

0.5 μl

0.5 μl

0.5 μl

加 入 量

25 pmol

50 pmol

1 pmol

使 用 量

2 μl

0.5 μl

0.5 μl

0.5 μl

X μl

up to 10 μl

10 μl*2

*2 反应体积可按需求相应放大，10 μl的反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

2． 反转录反应条件如下：

37℃ 15 min（反转录反应）*3

85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）

4℃

*3：使用Gene Specific Primer时，逆转录反应条件请使用42℃ 15min；

PCR产物有非特性产物生成时，逆转录温度设为50℃对PCR反应特异性扩增有时会有所改善。

3． 按下列组份配制PCR反应液（反应液请在冰上配制）。

（使用Thermal Cycler Dice

®

Real Time System时）

试 剂

SYBR

®

Premix Ex Taq

TM

II（2×）

PCR Forward Primer（10 μM）

PCR Reverse Primer（10 μM）

dH

2

O（灭菌蒸馏水）

使 用 量

12.5 μl

1 μl

1 μl

X μl

22.5～24 μl

Total

4． 将上述PCR反应液加入Real Time PCR用反应管中，然后再加入2.5～1 μl*的RT反应液（或

RT反应的稀释液），保证最终反应体积为25 μl。

* RT反应液的加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。

-8-

●反应例

通过RT-PCR对Mouse Gapdh mRNA进行检出，

cDNA量相当于Total RNA 6.4 pg~100 ng。dH

2

O

做为Negative Control用模板。

●引物设计说明

进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物非常重要。根据以下原则，可以设计PCR

扩增效率高，反应特异性强的良好引物。

◆ PCR扩增产物长度： 80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

◆ 设计引物要求如下：

Tm值

引物长度

GC含量

17～25 mers

40～60%（45～55%最佳）

Forward Primer和Reverse Primer的Tm值不能相差太大。

Tm值的计算使用专用软件。

OLIGO *1： 63～68℃

Primer3 *2：60～65℃

A、G、C、T整体分布尽量均匀。

引物序列

不要有部分的GC rich或AT rich（特别是3'端）。

避开T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的连续结构。

避免GC rich或AT rich。

3'末端序列

3'端碱基最好为G或C。

尽量避免3'末端碱基为T。

互补序列

特异性

避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3'末端避

开有2个碱基以上的互补序列。

使用BLAST *3检索确认引物的特异性。

*1 OLIGO: Primer Analysis Software。

*2 Primer3: （/ftp/distribution/software/）

*3

/BLAST/

-9-

●引物设计服务说明：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务

本公司以美国NCBI Data Base上登录的Human、Mouse、Rat的RefSeq（Human 21,000种，Mouse

17,000种，Rat 4,900种）为对象，已经设计完成了各基因用于定量表达分析的Real Time RT-PCR用

高特异性Primer Set，此Primer Set最适于本制品使用，可省略PCR反应条件优化实验。具体情况如下：

可提供1～3对合适的引物，由客户自己选择。

1. 从3’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。

2. 从5’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。

3. 针对Target基因全长的引物候补序列。

●问答

Q1. SYBR

Premix

Ex Taq

II为什么要于4℃保存？

A1. 经本公司实验证明，反复冻融制品性能可能下降。因此，我们推荐本制品于4℃避光保存，避免冻结。

Q2. 使用SYBR

Premix Ex Taq

II时，是否要对Mg

2+

浓度进行研讨？

A2. 使用SYBR

Premix Ex Taq

II时，不需要对Mg

2+

浓度进行研讨。实验时首先请使用本公司说明书推

荐的PCR反应条件，如果得不到良好实验结果时请研讨PCR反应条件，改变使用的PCR引物等。

Q3. SYBR

Premix Ex Taq

II的PCR扩增对使用引物有何要求？

A3. PCR用制品的DNA扩增性能与引物种类有一定的内在关系，本公司提拱SYBR Green I嵌合荧光

法的PCR或RT-PCR用引物的免费设计服务，详细情况请参见本说明书的「引物设计说明」部分。

使用TaKaRa设计推荐的引物，将更适合于SYBR

Premix Ex Taq

II的Real Time PCR扩增。

A4.

Q4. 使用ABI PRISM仪器时，是否需要进行了95℃ 10分钟的变性步骤？

本制品不需要使用这一长时间的变性步骤，请遵照本公司说明书的实验条件要求进行PCR反应。

Q5. 使用ABI PRISM仪器时实验结果不好，融解曲线无主峰，为什么？

A5. SYBR

Premix Ex Taq

II中不含有ROX Reference Dye，在制品包装中另外附有。进行Real Time

PCR反应时需在反应体系中添加ROX Reference Dye，在反应体系中不添加ROX Reference Dye

时，融解曲线图将会产生无主峰的一条紊乱的波浪线。

A6.

Q6. 和某些公司制品相比，SYBR

Premix Ex Taq

II制品的颜色较淡，为什么？

有些公司的Premix制品中已经加有ROX Reference Dye，所以颜色较深。而SYBR

Premix Ex Taq

II在制品中没有添加ROX Reference Dye，但在制品包装中另外附有，所以SYBR

Premix Ex Taq

II颜色较淡。

注）公司免费为客户提供Real Time PCR用引物、探针的设计服务，只收取DNA合成费用！

-10-

V2008.04.02